一种人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物气溶胶的健康效应技术领域，更具体地，涉及一种人体呼吸细胞暴露于病原菌体系及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物气溶胶由多种微生物及其产物组成，主要的微生物成分是细菌、真菌和霉菌等病原菌，其产物包括内毒素、真菌毒素和过敏原等。通过空气传播，其颗粒大小从0.001nm-100μm不等。生物气溶胶病理生理效应取决于它的大小、浓度、理化性质和粒径分布。由于微米至纳米尺度，生物气溶胶很容易通过肺部和循环系统沉积在人体的各个部位，诱发涉及单个到整个呼吸器官系统的健康并发症。许多生物气溶胶研究评估生物气溶胶对生物有机体的影响，但其确切作用和发病机制仍是一个谜。
3.其中，以生物气溶胶作为载体的病原菌构成了原核微生物的一个非常大的领域，它们被发现生活在地球上几乎所有的陆地上，包括极端环境(极端微生物)。据估计，地球上大约有107到109种细菌，其中只有10000种是已知的，因为它们生长要求严格。细菌粒径从0.3μm(支原体)-0.5mm不等，空气是已知的传播致病菌的主要载体，如百日咳博德杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌和脑膜炎奈瑟菌，它们分别是百日咳、炭疽、白喉和脑膜炎的病原体，这些病原菌通过生物气溶胶的传播对人类产生致命影响。同时许多以生物气溶胶形式传播的芽孢杆菌被认为是引起呼吸道疾病的强效过敏原。病原菌为生物气溶胶成分，对呼吸道产生疾病主要是通过呼吸暴露于人体呼吸道细胞。因此，对人体呼吸道细胞暴露于病原菌的研究非常重要。然而，目前评价以生物气溶胶对人体呼吸道细胞的毒性通常是通过流行病学研究来评估对人体的健康风险等，而对于生物气溶胶中的单一/混合病原菌成分以及它对人体呼吸道产生的毒性效应不详，且人体呼吸细胞暴露于生物气溶胶中的病原菌的相互作用道研究也甚少。因此，使用人体呼吸道细胞暴露于生物气溶胶成分中病原菌的体系来研究病原菌对人体呼吸道产生的毒性效应及暴露状态很有必要。


技术实现要素：

4.为了解决上述针对生物气溶胶成分中病原菌的健康效应评估相关研究的局限性。本发明的目的在于提供一种人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系的制备方法。该方法能够真实模拟人体呼吸道对生物气溶胶成分中病原菌的呼吸暴露，自主调节病原微生物种类、暴露浓度、细胞种类、细胞数量以及暴露时间，制备人体呼吸细胞暴露于病原菌体系，实现对人体呼吸道暴露于病原菌的毒性效应和健康风险评估研究。
5.本发明的另一目的在于提供上述方法制备的人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系。
6.本发明的再一目的在于提供上述方法制备的人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案来实现：
8.一种人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系的制备方法，包括以下步骤：
9.s1.将经液氮冷冻的人体呼吸道细胞放入0～60℃水浴锅融化得到细胞悬液a，取细胞悬液a转移至细胞培养基中，置于0～60℃恒温培养1～3天，得到用于细胞传代的人体呼吸道的融合细胞；
10.s2.将人体呼吸道的融合细胞移除培养基后，用缓冲液磷酸盐溶液洗涤，移除洗涤液后，添加0.01～10％的胰蛋白酶消化，在0～60℃，0～30％co2的条件下孵育，再添加细胞培养基终止消化，收集人体呼吸道细胞，离心移除上清液得到人体呼吸道的细胞球，将细胞培养基添加到细胞球中重悬细胞球后得到细胞悬液b，取细胞悬液b转移至细胞培养基中，置于培养箱中传代培养1～6代，得到用于细胞计数与铺板的40～100％融合的人体呼吸道细胞；
11.s3.将40～100％融合的人体呼吸道细胞用缓冲液磷酸盐溶液洗涤，胰蛋白酶消化，再添加细胞培养基终止消化，离心弃上清得到细胞球，将细胞培养基添加到细胞球中重悬细胞球后得到细胞悬液c，将细胞悬液c稀释滴入细胞血球计数板，转移至倒置相差显微镜计数，再将所得人体呼吸道细胞转移至不同规格的细胞培养皿中铺板操作得到0～10
10
个细胞量，恒温培养直至在不同规格的细胞培养皿中人体呼吸道细胞达到40～100％融合，用缓冲液磷酸盐溶液洗涤，得到用于细胞暴露的人体呼吸道细胞；
12.s4.将储存于冷冻条件下的病原菌接种到病原菌培养基营养肉汤，在0～60℃恒温培养，直至病原菌进入对数生长期，病原菌离心弃上清得到菌球，用缓冲液洗涤菌球，再加改性的细胞培养基，得到病原菌悬液；
13.s5.在超净工作台中将病原菌悬液加入步骤s3的用于细胞暴露的人体呼吸道细胞中，置于培养箱中在0～60℃，0～30％co2的条件下培养，得到人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系，所述病原菌悬液的浓度为0～10
10
cfu/ml。
14.优选地，步骤s1中所述的呼吸道细胞为鼻、咽、喉、支气管或肺部细胞中的一种以上。
15.优选地，步骤s4中所述的病原菌包括细菌、真菌或霉菌中的一种以上。
16.优选地，步骤s1～s3中所述细胞培养基包括30～99.98％的细胞基础培养基、0.01～50％的胎牛血清和0.01～20％的青霉素-链霉素，所述细胞基础培养基为dmem、mem、rpmi 1640或f-12k。
17.优选地，步骤s2中所述孵育的时间为0～10min，所述终止消化的细胞培养基的体积为0.2～8ml，所述细胞培养基的体积为0.5～10ml。
18.优选地，步骤s3中所述不同规格的细胞培养皿的面积为0.01～70cm2，所述细胞数量为0～10
10
个。
19.优选地，步骤s4中所述冷冻条件为-100～-60℃，所述洗涤缓冲液为磷酸盐溶液，所述改性的细胞培养基包括50～99.99％的细胞基础培养基和0.01～50％的胎牛血清，所述细胞基础培养基为dmem、mem、rpmi 1640或f-12k。
20.优选地，步骤s5中所述培养的时间为0～7d。
21.一种人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系，所述人体呼吸细胞暴露于病原菌体系是由所述方法制备得到。
22.所述的人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系在生物气溶胶对人体健康效应评估中的应用。
23.本发明的人体呼吸道细胞暴露于生物气溶胶成分中病原菌体系的制备方法，先将储存在液氮中的细胞复苏后进行恒温培养。经洗涤、消化后将细胞转移至新鲜细胞培养基传代培养。通过细胞血球计数板和显微镜观察计数，后将细胞定量铺板培养。将达到一定融合度的细胞用于细胞暴露与毒性测试实验；而后将冷冻条件下的病原菌接种，恒温培养至对数生长期。经洗涤、重悬后用于病原菌暴露细胞实验。使用酶标仪调节合适的病原菌浓度，梯度稀释法制备不同梯度浓度的病原菌。接着在超净工作台进行染毒暴露及开展毒性测试试验，可分别检测暴露系统中病原菌和呼吸道细胞的毒理学和生理生化性质及其生物应激反应。该人体呼吸道细胞暴露于生物气溶胶成分中病原菌体系能应用于生物气溶胶中病原菌对呼吸细胞的健康效应评估研究，具有可操作性强、条件易达成和成本低的特点，可以为生物气溶胶的暴露场地和职业暴露人群的健康风险评估和防护措施提供技术支持。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.1.本发明的人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系的制备方法，具有操作简便，前期投入较低，条件易达到，易于实现不同的细胞暴露模型。
26.2.本发明真实模拟生物气溶胶通过职业暴露评价人群的呼吸作用进入呼吸道产生的健康风险，即暴露于病原菌导致健康风险的情况一般都是在特定的暴露场所，比如污水处理厂，垃圾填埋场，养殖场等，在这些场所工作的工人都称为特定职业暴露，健康风险较高。
27.3.本发明通过多规格细胞培养皿的设计能实现不同数量呼吸道细胞的培养，便于研究细胞数量对细胞暴露系统产生的毒理效应的影响。细胞培养皿的平行孔板设计能实现不同种类呼吸道细胞的同时培养，便于控制变量，探讨病原菌对不同呼吸道细胞产生的毒理效应的差异，寻找病原菌的潜在靶向细胞。
28.4.本发明可实现自主调整病原菌种类和浓度，便于分析人体呼吸细胞急性或慢性暴露于不同浓度(0-10
10
cfu/ml)的病原菌的潜在细胞毒性。
29.5.本发明的人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系很容易将病原菌和细胞组分分离，可以从病原菌和细胞的角度分别探讨病原菌的细胞毒性和病原菌逃避细胞防御的适应性策略。
附图说明
30.图1为本发明中人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系的毒性测试的流程图。
31.图2为实施例1中人支气管上皮细胞暴露于铜绿假单胞菌的细胞活性图。
32.图3为实施例1中人支气管上皮细胞暴露于铜绿假单胞菌的暴露界面状态效果图。
33.步骤s1～s3中所述细胞培养基包括30～99.98％的dmem(dulbecco's modified eagle medium)/mem(minimum essential medium)/rpmi 1640(roswell park memorial institute)/f-12k(ham
‘
s f-12)中的一种，0.01～50％的胎牛血清、0.01～20％的青霉素-链霉素。
34.所述改性的细胞培养基包括50～99.99％的dmem(dulbecco's modified eagle medium)/mem(minimum essential medium)/rpmi 1640(roswell park memorial institute)/f-12k(ham
‘
s f-12)中的一种，0.01～50％的胎牛血清。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明专利采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
36.实施例1
37.图1为本发明人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系的制备方法的流程图，其具体步骤如图1所示：
38.s1.从液氮中取出冻存管，将其放入37℃水浴锅迅速融化，取1ml人支气管上皮细胞悬液转移至含dmem的细胞培养基中，尽量使细胞均匀分布在培养皿中，置于37℃，4％co2的培养箱中培养1d，不断对细胞更换新鲜的含dmem的培养基，到第三天传代。重复传代，传至第三代结束。
39.s2.将80％融合的人支气管上皮细胞移除细胞培养基，2mlpbs洗涤两次，1ml胰蛋白酶使细胞消化，于培养箱孵育2min取出，1ml含dmem的培养基终止消化，移液枪吹打均匀，转移至ep管，1000rmp条件下离心5min，弃上清液，含dmem的细胞培养基重悬细胞，置于37℃，4％co2的培养箱中培养。
40.s3.取出处理过的血球计数板，盖上盖玻片。取消化下来的人支气管上皮细胞悬液加入到装有含dmem培养基的离心管稀释，取稀释液滴于计数板，转移到倒置相差显微镜计数，计数原则为“记上不计下，计左不计右”。计数结果：
41.细胞浓度(细胞/ml悬液)＝(四格总细胞数/4)*10000*稀释倍数
42.根据不同规格的细胞培养板所需要的细胞数量结合细胞计数结果补充相应的含dmem的细胞培养基，而后置于37℃，4％co2的培养箱中培养至细胞达到80％融合。
43.s4.移液枪挑铜绿假单胞菌接种至制备好的50ml肉汤培养基中，置于恒温振荡培养箱中37℃过夜培养。培养至对数生长期，取5ml菌液经8000rpm离心2min，弃上清，5ml无菌pbs冲洗细菌沉淀物后重新悬浮于改性的含dmem的细胞培养基，酶标仪调节细菌浓度，另其od600为0.1，指示此时的铜绿假单胞菌浓度为108cfu/ml。
44.s5.通过含dmem的细胞培养基对菌液进行10的倍比稀释，得到浓度103和105cfu/ml的病原菌，将病原菌悬液加入已融合的细胞进行染毒暴露试验，转移至37℃，4％co2的培养箱中孵育，收集细胞培养板，得到人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系，所述病原菌悬液的浓度为0-10
10
cfu/ml。分别对细胞活性和暴露界面状态进行测定。
45.图2为实施例1中人支气管上皮细胞暴露于铜绿假单胞菌的细胞活性图。从图2中可知，暴露于铜绿假单胞菌的细胞活性随着细菌浓度的加大呈现剂量依赖性降低，可以在生物气溶胶中的细菌急性暴露于呼吸系统细胞时，评估细胞的潜在毒性，从而了解病原菌对人体的健康风险。图3为实施例1中人支气管上皮细胞暴露于铜绿假单胞菌的暴露界面状态效果图。其中，(a)为没有暴露铜绿假单胞菌时的细胞对照组，(b)为将103cfu/ml铜绿假单胞菌暴露于16hbe细胞的实验组1，(c)为将105cfu/ml铜绿假单胞菌暴露于16hbe细胞的实验组2，(d)为没有细胞的铜绿假单胞菌对照组。从图3中可以看出，没有细菌暴露的细胞对照组，细胞表面呈自然光滑褶皱形状，而加入103和105cfu/ml细菌后，细胞的四周被细菌紧紧包围，且细菌与细菌之间通过胞外聚合物紧密连接，显示细菌在细胞表面形成了生物膜。可以直接观察生物气溶胶中的细菌暴露于细胞界面上的状况，以便于了解暴露的进程
和细菌诱导细胞毒性的潜在机制。
46.实施例2
47.与实施例1不同的在于：本实施例中步骤s3中四格总细胞数为180个，计算细胞浓度为4.5*106个/ml，使用96孔板铺板，每个孔需要104个细胞，算出每孔需要2.2ul的细胞悬液，另外每孔补充97.8ul的含dmem的细胞培养基，置于37℃，4％co2的培养箱中培养至细胞达到80％融合。步骤s5中通过加入含dmem的细胞培养基对菌液进行10的倍比稀释，得到101、102、103、104、105cfu/ml的铜绿假单胞菌，将100ul细菌悬液加入96孔板已融合的16hbe细胞进行染毒暴露试验，转移至37℃，4％co2的培养箱中孵育8h。
48.采用实施例2的人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系的毒性测试方法，选用的病原菌是生物气溶胶中的铜绿假单胞菌，细胞是人支气管上皮细胞，包括以下步骤：
49.s1：孵育8h结束后，在显微镜下观察人支气管上皮细胞的形态。
50.s2：配制cck-8(cell counting kit-8)培养基的混合液，以cck-8：含dmem的细胞培养基＝1:10的比例配制cck-8稀释液，操作注意避光。
51.s3：将96孔板中原有的细胞培养基吸出，用100ulpbs清洗细胞两次，每孔添加cck-8稀释液100ml，用锡箔纸避光。
52.s4：将培养板在培养箱内孵育1.5h。
53.s5：用酶标仪在450nm处测定吸光度。
54.细胞活性按公式计算：
55.细胞活力(％)＝(od加药-od空白)/(od0加药-od空白)*100
56.实施例3
57.与实施例1不同的在于：本实施例步骤s3中，使用12孔板铺板，每个孔需要105个细胞，算出每孔需要22ul的细胞悬液，另外每孔补充1978ul的含dmem的细胞培养基。所述步骤s5中，通过加入含dmem的细胞培养基对菌液进行10的倍比稀释，得到101、102、103、104、105cfu/ml的铜绿假单胞菌，将2ml细菌悬液加入12孔板已融合的细胞进行染毒暴露试验，而后转移至37℃，4％co2的培养箱中孵育8h。
58.采用实施例2的人体呼吸道细胞暴露于病原菌体系的毒性测试方法，选用的病原菌是生物气溶胶中的铜绿假单胞菌，选用的细胞是人支气管上皮细胞。包括以下步骤：
59.s1：孵育8h结束后，在显微镜下观察人支气管上皮细胞形态。
60.s2：将12孔板中原有的细胞培养基吸出，用500ulpbs清洗细胞两次，用100ppm的庆大霉素处理1h。
61.s3：将处理后的细胞上清液吸出，加入2.5％戊二醛在4℃下固定过夜。
62.s4：依次用30％、50％、70％、90％的乙醇连续脱水各15min，100％的无水乙醇脱水15min，重复三次。
63.s5：在冷冻干燥机中干燥12h，镀金，然后在德国卡尔蔡司显微镜上观察。
64.实施例4
65.与实施例1不同的在于，本实施例中，选用的病原菌是生物气溶胶中的金黄色葡萄球菌。采用实施例1的人体呼吸道细胞暴露于金黄色葡萄球菌的毒性测试方法，包括以下步骤：
66.包括以下步骤：
67.s1：孵育8h结束后，在显微镜下观察人支气管上皮细胞16hbe的形态。
68.s2：配制cck-8培养基的混合液，以cck-8：含dmem的细胞培养基＝1:10的比例配制cck-8稀释液，操作注意避光。
69.s3：将96孔板中原有的细胞培养基吸出，用100ulpbs清洗细胞两次，每孔添加cck-8稀释液100μl，用锡箔纸避光。
70.s4：将培养板在培养箱内孵育1.5h。
71.s5：用酶标仪在450nm处测定吸光度。
72.细胞活性按公式计算：
73.细胞活力(％)＝(od加药-od空白)/(od0加药-od空白)*100
74.检测结果与实施例2类似，说明本方法可以评估金黄色葡萄球菌暴露于呼吸道人支气管上皮细胞16hbe的细胞毒理学效应，可实现自主调整病原菌种类的暴露，便于分析不同环境的病原菌急性或慢性暴露于人体呼吸细胞的潜在毒性。
75.实施例5
76.与实施例1不同的所不同之处在于，本实施例中选用的细胞是人肺上皮细胞beas-2b。采用实施例5的人体呼吸道细胞暴露于铜绿假单胞菌的毒性测试方法，包括以下步骤：
77.s1：孵育8h结束后，在显微镜下观察细胞形态。
78.s2：配制cck-8培养基的混合液，以cck-8：含dmem的细胞培养基＝1:10的比例配制cck-8稀释液，操作注意避光。
79.s3：将96孔板中原有的细胞培养基吸出，用100ulpbs清洗细胞两次，每孔添加cck-8稀释液100μl，用锡箔纸避光。
80.s4：将培养板在培养箱内孵育1.5h。
81.s5：用酶标仪在450nm处测定吸光度。
82.细胞活性按公式计算：
83.细胞活力(％)＝(od加药-od空白)/(od0加药-od空白)*100
84.检测结果与实施例2类似，说明本方法可以评估铜绿假单胞菌暴露于呼吸道人肺上皮细胞beas-2b的细胞毒理学效应，能实现不同种类呼吸道细胞的同时培养，便于控制变量，探讨病原菌对呼吸道细胞产生的毒理效应的差异，寻找病原菌的潜在靶向细胞。
85.实施例6
86.与实施例3不同之处在于，本实施例中，所述步骤s3中，使用24孔板铺板，每个孔需要5*104个细胞，算出每孔需要11ul的细胞悬液，另外每孔补充989ul的含dmem的细胞培养基。所述步骤s5中，通过加入含dmem的细胞培养基对菌液进行10的倍比稀释，得到101、102、103、104、105cfu/ml的铜绿假单胞菌，将1ml细菌悬液加入24孔板已融合的细胞进行染毒暴露试验，而后转移至37℃，4％co2的培养箱中孵育10h。
87.一种人体呼吸道细胞暴露病原菌的毒性测试，选用的病原菌是生物气溶胶中的铜绿假单胞菌，选用的细胞是人支气管上皮细胞。包括以下步骤：
88.s1：孵育10h结束后，在显微镜下观察人支气管上皮细胞形态。
89.s2：将24孔板中原有的细胞培养基吸出，用500ulpbs清洗细胞两次，用100ppm的庆大霉素处理1h。
90.s3：将处理后的细胞上清液吸出，加入2.5％戊二醛在4℃下固定过夜。
91.s4：依次用30％、50％、70％、90％的乙醇连续脱水各15min，100％的无水乙醇脱水15min，重复三次。
92.s5：在冷冻干燥机中干燥12h，镀金，然后在德国卡尔蔡司显微镜上观察。
93.检测结果与实施例3类似，说明本发明的人体呼吸道细胞暴露于病原菌的体系可以评估呼吸道人支气管上皮细胞16hbe暴露于铜绿假单胞菌的细胞毒理学效应，可以直观的观察到随着暴露时间的延长，支气管上皮细胞暴露于生物气溶胶中的铜绿假单胞菌的暴露界面上细菌数量以及细胞形态的变化情况，以便于了解暴露进程与细菌诱导细胞毒性的潜在关联。
94.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。