一株抗铅镉污染细菌的筛选及其应用的制作方法

1.本发明属于菌株功能及应用技术领域，具体涉及耐辐射甲基杆菌jb18在修复重金属污染土壤中的应用。


背景技术：

2.人类活动与工业化的发展不断地向土壤、水与大气中释放有毒有害物质，使生态破坏和环境质量恶化。重金属是危害较大的污染物之一，对整个人类生存环境的影响越来越突出。重金属污染的植物通过人类和动物的日常摄入进入到食物链中，导致动物和人类体中堆积有毒金属，许多致癌和其他有害影响都与此有关。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供耐辐射甲基杆菌jb18在修复重金属污染土壤中的应用，jb18具有较好的耐铅镉性，可为微生物修复重金属污染的土壤提供菌种资源。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了耐辐射甲基杆菌(methylobacterium radiotolerans)jb18在修复重金属污染土壤中的应用，所述耐辐射甲基杆菌(methylobacterium radiotolerans)jb18的保藏编号为 cgmcc no.22961。
6.优选的，所述jb18的its基因序列登录号为mz723900。
7.优选的，所述重金属包括铅或镉。
8.优选的，利用所述jb18修复铅污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的浓度不高于200 mg/l；
9.利用所述jb18修复镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中镉的浓度不高于400mg/l；
10.利用所述jb18修复铅和/或镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的浓度不高于200 mg/l，镉的浓度不高于20mg/l。
11.本发明还提供了一种修复铅和/或镉污染的土壤的菌剂，所述菌剂的活性成分包括所述耐辐射甲基杆菌jb18。
12.本发明提供了耐辐射甲基杆菌jb18在修复重金属污染土壤中的应用，所述jb18分离筛选自黑龙江省齐齐哈尔市齐齐哈尔大学生命科学与农林学院环境修复实验室的铅镉污染土壤，经阶梯性筛选，jb18能在含有200mg/l pb
2
、400mg/l cd
2
培养基中存活，具有较好的耐铅镉性，能够利用淀粉、麦芽糖作为碳源生长，不能水解纤维素，在甲基红和明胶液化实验中皆显示为阴性，its序列鉴定为耐辐射甲基杆菌(methylobacterium radiotolerans)。本发明实施例中，将所述jb18在含铅的lb平板培养基上进行培养时，铅离子的最低抑制浓度为200mg/l；在含镉的lb平板培养基上进行培养时，镉离子的最低抑制浓度为400mg/l；在含铅和镉的lb培养基平板上进行培养时，铅镉复合浓度为200/20mg/l时，菌株jb18仍能存活。证明所述jb18具有较好的耐铅镉性，可为微生物修复重金属污染的土壤提供菌种资源。
13.生物保藏信息
14.耐辐射甲基杆菌(methylobacteriumradiotolerans)jb18，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.22961，保藏日期为2021年7月26日。
附图说明
15.图1为利用its序列构建得到的进化树。
具体实施方式
16.本发明提供了耐辐射甲基杆菌(methylobacteriumradiotolerans)jb18在修复重金属污染土壤中的应用，所述耐辐射甲基杆菌(methylobacteriumradiotolerans)jb18的保藏编号为cgmccno.22961。
17.本发明所述jb18的its基因序列登录号优选为mz723900，其its基因序列优选如seqidno.1所示：
18.ggctcagagcgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcgggcccttcggggtcagcggcggacgggtgagtaacgcgtgggaacgtgccttctggttcggaataaccctgggaaactagggctaataccggatacgcccttttggggaaaggtttactgccggaagatcggcccgcgtctgattagctagttggtggggtaacggcctaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctcttttatccgggacgataatgacggtaccggaggaataagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgctcggaatcactgggcgtaaagggcgcgtaggcggcgttttaagtcgggggtgaaagcctgtggctcaaccacagaatggccttcgatactgggacgcttgagtatggtagaggttggtggaactgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccggtggcgaaggcggccaactggaccattactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgccagctgttggggtgcttgcaccgcagtagcgcagctaacgctttgagcattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccatcctttgacatggcgtgttacccagagagatctggggtccccttcgggggcgcgcacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccacgtccttagttgccatcattcagttgggcactctagggagactgccggtgataagccgcgaggaaggtgtggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggatgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggaggcgaaggagcgatctggagcaaatccccaaaagccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaaggcggaatcgctagtaatcgtggatcagcatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggtcttacccgacggcgctgcgccaaccgcaaggaggcaggcgaccacggtagggtcagcgactggggtgaagtcgtaa。本发明利用所述its序列与genbank中已有的its序列进行blast同源性分析，利用软件megax构建进化树，如图1所示，该菌株与耐辐射甲基杆菌(methylobacteriumradiotolerans)的相似性较高，确定分离到的菌株为耐辐射甲基杆菌，编号为jb18，序列已提交ncbi的genbank数据库，菌株基因序列登录号为mz723900。
19.本发明所述jb18优选分离筛选自黑龙江省齐齐哈尔市齐齐哈尔大学生命科学与农林学院环境修复实验室的铅镉污染土壤，本发明对所述分离筛选的方法并没有特殊限
定，优选包括：将10-5
g/ml、10-6
g/ml、10-7
g/ml浓度土壤悬液取0.1ml接种到铅浓度为200mg/l、镉浓度为20mg/l的lb培养基平板上，在恒温培养箱中30℃，培养3～5天，观察是否有菌落长出，若有菌株长出，则继续增加lb培养基中铅、镉浓度，从而确定铅、镉离子的最低抑制浓度；因复合铅镉浓度的胁迫比单一铅、镉浓度大，故再通过含复合铅镉浓度的lb培养基进行筛选。本发明所述重金属优选包括铅和/或镉。在本发明中，利用所述jb18修复铅污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的浓度优选不高于200mg/l；利用所述jb18修复镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中镉的浓度优选不高于400mg/l；利用所述jb18修复铅和镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的浓度优选不高于200mg/l，镉的浓度优选不高于20 mg/l。
20.本发明还提供了一种修复铅和/或镉污染的土壤的菌剂，所述菌剂的活性成分包括所述 jb18。
21.下面结合实施例对本发明提供的耐辐射甲基杆菌jb18在修复重金属污染土壤中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
22.实施例1
23.耐辐射甲基杆菌(methylobacterium radiotolerans)的分离和鉴定
24.一、jb18是从黑龙江省齐齐哈尔市齐齐哈尔大学生命科学与农林学院环境修复实验室的铅镉污染土壤内筛选出的耐性菌株，具体包括如下的步骤：
25.1.配制培养基
26.lb培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，氯化钠5g，ph值 7.4。lb培养基具体配制过程：将3g牛肉膏、10g蛋白胨和5g氯化钠放入烧杯中并加入少量蒸馏水，用玻璃棒搅拌溶解后加入20g琼脂粉搅拌均匀并补水到1000ml，分装于250ml 的三角瓶中，灭菌锅设置为121℃、20min。
27.2.筛选培养
28.称取土样10g置于锥形瓶中，加入无菌水90ml制成土壤悬液，放入适量玻璃珠后封口移入恒温摇床中，180r/min、30℃处理2h，静置30min。取土壤悬液的1ml加入到9ml 无菌水得到10-1
的土壤菌悬液，继续稀释，依次得到10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
和10-8
的浓度土壤菌悬液。将10-5
、10-6
、10-7
浓度菌悬液取0.1ml接种到铅浓度为200mg/l、镉浓度为20mg/l的lb培养基平板上，在恒温培养箱中30℃培养3～5天，观察是否有菌落长出，若有菌株长出，则继续增加lb培养基中铅、镉浓度，从而确定铅、镉离子的最低抑制浓度。因复合铅镉浓度的胁迫比单一铅、镉浓度大，故再通过含复合铅镉浓度的lb培养基进行筛选。确定铅离子的最低抑制浓度为200mg/l；确定镉离子的最低抑制浓度为400mg/l，铅镉复合浓度为200/20mg/l时，jb18仍能存活。
29.二、采用its基因测序法对jb18进行分类鉴定
30.1.its基因pcr扩增引物为：
31.its1(7f)：5
‘‑
cagagtttgatcctggct-3’；
32.its2(1540r)：5
‘‑
aggaggtgatccagccgca-3’。
33.its3(27f)：5
‘‑
agtttgatcmtggctcag-3’；
34.its4(1492r)：5
‘‑
ggttaccttgttacgactt-3’。
35.2.扩增程序为：预变性95℃300s；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃90s，重复30次；修复延伸72℃600s。
36.基因扩增产物纯化后经生工公司测序，将所得序列与genbank中已有的its序列进行 blast同源性分析，利用软件mega x构建进化树。结果如图1所示，该菌株与耐辐射甲基杆菌(methylobacterium radiotolerans)的相似性较高，确定分离到的菌株为耐辐射甲基杆菌，编号为jb18，序列已提交ncbi的genbank数据库，菌株基因序列登录号为mz723900。
37.三、jb18的生理生化试验
38.1.甲基红试验
39.(1)葡萄糖蛋白胨培养基：7.5g蛋白胨，7.5g葡萄糖，7.5g磷酸氢二钾，定容到1500 ml，ph为7。
40.(2)步骤：将jb18接种到葡萄糖蛋白胨培养基中，灭菌棉塞封口，培养温度30℃，24 h后，向葡萄糖蛋白胨培养基中滴加1～2滴甲基红试剂，观察颜色变化。若变为红色表示培养基中含有酸性物质则为阳性，用“ ”表示；若变为黄色表示培养基中不含有酸性物质则为阴性，用
“‑”
表示。
41.2.明胶液化试验
42.(1)明胶液化培养基：蛋白胨5g，明胶200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
43.(2)步骤：将jb18接种于明胶表面，28℃下暗培养，每隔5d观察一次。先将试管低温冷却，待未接种的ck试管中明胶凝固后观察记录。若冷却后明胶不液化则无蛋白酶水解作用，反之则表明有蛋白酶水解作用。水解为阳性用“ ”表示，不水解为阴性用
“‑”
表示。
44.3.淀粉水解试验
45.(1)淀粉水解培养基：磷酸氢二钾10g，磷酸二氢钾0.3g，氯化钠0.5g，碳酸镁1g，硝酸钾1g，可溶性淀粉2.0g，琼脂15g，ph为7.2，蒸馏水1000ml。
46.(2)步骤：将培养基倒入培养皿中，待培养基凝固后采用点接法接种，28℃下暗培养 10～20d后，将配制好的碘液倒入培养基表面。如有淀粉酶产生，则菌落的周围不会变为蓝色，反之则变成蓝色，表明有淀粉酶产生。利用形成的透明圈来检测是否产生淀粉酶。淀粉酶水解为阳性用“ ”来表示，淀粉酶不水解为阴性用
“‑”
来表示。
47.4.纤维素水解试验
48.(1)纤维素水解培养基：硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g，硝酸钾1g，滤纸条，蒸馏水1000ml。
49.(2)步骤：将滤纸条放置在试管的培养基中，一半浸入培养基中一半在培养基上，将待测菌株接种于已灭菌的试管中的滤纸条上，28℃培养30d后，观察其是否能在滤纸条上生长。纤维素水解为阳性用“ ”表示，纤维素不水解为阴性用
“‑”
表示。
50.5.麦芽糖利用测定
51.(1)土豆200g，麦芽糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
52.(2)观察菌株能否正常生长。能正常生长则为阳性用“ ”表示，不能正常生长用
“‑”
表示。
53.6.试验结果如表1所示
54.表1 jb18的生理生化性质
[0055][0056]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。