多层培养容器的制作方法

1.本发明涉及一种能够在多个培养层中培养细胞的多层培养容器。


背景技术：

2.存在多种类型的细胞培养方法。最常用的方法是静态培养，其中细胞在附着于培养容器的同时被培养。具体地说，使细胞与培养容器(例如，培养皿或培养瓶)的底面紧密接触，将培养基添加到由培养容器的底面和侧面形成的培养层中，并且在预定的环境条件下进行细胞培养。随着培养的进行，细胞沿着培养容器的底面增殖。此外，近年来，为了对大量细胞进行静态培养，已经开发了一种多层培养容器，其具有细胞可以附着的多个附着面，并且包括在其中形成的多个培养层(参见图6)。
3.在静态培养中，当进行将增殖的细胞转移到新的培养容器中的继代培养时或当回收培养的细胞时，需要使用剥离液将细胞从附着表面剥离。特别地，当在多层培养容器上进行细胞剥离时，需要供应大量剥离液，并且需要通过预定程序将供应的剥离液分配到培养容器内的各培养层。例如，如图6所示，传统的多层培养容器201包括由底板202、顶板203和侧壁204组成的长方体外壳、被构造为将外壳的内部空间分成多个培养层221的多个中间板205、被构造为向多层培养容器201供应和从多层培养容器201排出液体的供液/排液部件206以及被构造为排出外壳内的气体的排气口207。供液/排液部件206具有圆柱形形状，其中顶板203侧是打开的，并且该圆柱形形状从顶板203侧到底板202侧贯穿多个中间板205。在供液/排液部件206的圆柱形侧面上形成有与各培养层221连通的多个连通部分214。此外，如图6所示，供液/排液部件206的开口部分布置在顶板203的拐角处，排气口207布置在邻近供液/排液部件206的布置位置的拐角处。下面将参照图7描述用于向传统的多层培养容器201供应剥离液30并剥离细胞的过程。图7中的阴影部分是存在剥离液30的区域。
4.首先，如图7(a)所示，将多层培养容器201布置成使得供液/排液部件206位于底侧，排气口207位于顶侧并且底板202垂直于水平安装面(以下称为第一姿态)，并且从供液/排液部件206排出多层培养容器201内的培养基。随后，在多层培养容器201布置在第一姿势的状态下，从供液/排液部件206向多层培养容器201的内部供应预定量的剥离液30。在供应剥离液30之后，如图7(b)所示，将多层培养容器201重新布置成使得供液/排液部件206和排气口207位于顶侧，同时底板202保持垂直于安装面(以下称为第二姿势)。结果，剥离液30经由连通部分214基本上均匀地流入各培养层221。接下来，如图7(c)所示，将多层培养容器201重新布置成使得底板202与安装面接触并且供液/排液部件206和排气口207位于顶侧(第三姿势)。结果，剥离液30沿着底板202和中间板205均匀地铺开，并且附着在底板202和中间板205上的全部细胞被浸入剥离液30中。然后，通过将多层培养容器201以第三姿势保持预定时间，细胞从底板202和中间板205剥离。最后，如图7(d)所示，将多层培养容器201再次以第一姿势布置，并且从底板202和中间板205剥离的细胞从供液/排液部件206排出。
5.通过上述程序，可以回收在传统的多层培养容器201中从底板202和中间板205剥离的细胞。然而，如图7(a)所示，在多层培养容器201以第一姿势布置并且剥离液30被供应
到多层培养容器201时，剥离液30流入各培养层221。因此，当多层培养容器201以第一姿势布置时，在剥离液30的整个供应过程中，附着在靠近位于底侧的侧壁204的中间板205和底板202上的细胞被浸入剥离液30中。另一方面，当多层培养容器201以第一姿势布置时，在供应剥离液30时，附着在靠近位于顶侧的侧壁204的中间板205和底板202上的细胞不被浸入剥离液30中。由于向容器中供应大量剥离液需要时间，因此在传统的多层培养容器201中，细胞浸在剥离液中的时间随着位置而不同。当细胞浸在剥离液中的时间过长时，细胞可能会被破坏。当细胞浸在剥离液中的时间太短时，细胞可能无法从培养层剥离。
6.本发明提供了在从培养层剥离细胞时能够抑制细胞浸在剥离液中的时间差异的多层培养容器的一些实施方式。


技术实现要素：

7.根据本发明的一个实施方式，提供了一种能够在多个培养层中培养细胞的多层培养容器。该多层培养容器包括：外壳，其包括底板、面对底板的顶板以及连接底板和顶板的多个侧壁；边界部分，其将外壳的内部空间在平行于底板的方向上分为边界部分的一侧的培养空间和边界部分的另一侧的缓冲空间；至少一个中间板，其至少在培养空间中沿着平行于底板的方向延伸并被构造为将培养空间分成多个培养层；位于边界部分的多个壁部分，该多个壁部分包括从底板在朝顶板的方向上延伸的壁部分和从至少一个中间板中的每一个中间板在朝顶板的方向上延伸的壁部分；多个连通部分，其形成在边界部分处，用于使培养层与缓冲空间连通；以及供液/排液口，其形成在外壳的面对缓冲空间的位置。
8.通过使用上述的多层培养容器，可通过以下程序向各培养层供应剥离液。首先，将多层培养容器布置在安装面上使得另一侧的侧壁位于底侧，即，使得缓冲空间位于底侧。随后，将剥离液从供液/排液口供应到缓冲空间。在供应剥离液之后，将多层培养容器重新布置在安装面上使得与另一侧的侧壁连接的侧壁位于底侧，即，使得底板和中间板在水平方向上并排布置。因此，缓冲空间内的剥离液的一部分经由连通部分基本上均匀地流入各培养层。接下来，将多层培养容器重新布置在安装面上使得一侧的侧壁位于底侧，即，使得培养空间位于底侧。因此，缓冲空间中的全部剥离液经由连通部分基本上均匀地流入各培养层。最后，当将多层培养容器布置成使得底板位于底侧时，各培养层中的剥离液沿着底板或中间板均匀地铺开。
9.根据上述程序，当正在从供液/排液口供应剥离液时，剥离液流入缓冲空间，而不流入各培养层。此外，当在供应剥离液之后将多层培养容器重新布置两次时，剥离液仅存在于每个培养层的部分区域中。然而，这样的重新布置工作可以在短时间内完成。因此，对不同位置的细胞浸在剥离液中的时间差异的影响较小。即，根据本发明，通过设置用于临时储存剥离液的缓冲空间，在供应剥离液时，可以抑制细胞浸在剥离液中的时间差异。
10.此外，优选多层培养容器还包括倾斜板，该倾斜板从形成在底板上的壁部分的上端部朝向边界部分的另一侧的侧壁延伸，同时朝顶板倾斜。
11.储存在缓冲空间中的剥离液随后经由连通部分流入各培养层。此时，当在底板上设置壁部分时，剥离液的一部分保留在由壁部分、底板和另一侧的侧面包围的缓冲空间的一部分中。因此，在上述构造中，设置了倾斜板，该倾斜板从设置在底板上的壁部分的上端部朝向另一侧的侧壁延伸，同时朝顶板倾斜。结果，保留在缓冲空间中的剥离液沿着倾斜板
流入底板和中间板之间的培养层。因此，可以减少保留在缓冲空间中的剥离液，并且可以在不浪费的情况下使用剥离液。
12.此外，在多层培养容器中，优选至少一个中间板在培养空间中延伸到边界部分。
13.在传统的多层培养容器中，培养层通过中间板彼此完全隔开。因此，为了向各培养层供应剥离液，需要设置具有贯穿中间板的圆柱形形状并包括形成在圆柱形侧面上用于与各培养层连通的多个连通部分的供液/排液部件。相比之下，在上述构造中，中间板在一侧的培养空间中延伸到边界部分，而不延伸到另一侧的缓冲空间。即，缓冲空间不被中间板隔开。供应到缓冲空间的剥离液可以经由形成在边界部分的连通部分流入各培养层。因此，根据上述构造，为了向各培养层供应剥离液，仅在外壳的面对缓冲空间的位置形成开口(供液/排液口)就足够了。与需要形成贯穿中间板的圆柱形的供液/排液部件的传统的多层培养容器相比，该多层培养容器容易制造。
14.此外，在多层培养容器中，优选的是，至少一个中间板在培养空间和缓冲空间中都沿着平行于底板的方向延伸以将缓冲空间分成多个缓冲层，并且在缓冲空间中形成贯穿至少一个中间板的通孔。
15.在上述构造中，缓冲空间被延伸到另一侧的侧壁的中间板划分为与培养层相对应的多个缓冲层。此外，由于在中间板中形成有通孔，因此液体或气体可以在缓冲层之间流动。因此，当将剥离液供应到缓冲空间，然后重新布置多层培养容器使得与另一侧的侧壁连接的侧壁位于底侧时，一部分剥离液基本上均匀地流入各培养层，而剩余部分的剥离液基本上均匀地分开供应到缓冲层并储存在缓冲层中。从该状态开始，当重新布置多层培养容器使得培养空间位于底侧时，基本上均匀地储存在各缓冲层中的剩余部分的剥离液经由连通部分流入各培养层。因此，全部剥离液可以更均匀地供应到各培养层。
16.根据本发明，可以提供一种多层培养容器，当从培养层剥离细胞时，该多层培养容器能够抑制细胞浸在剥离液中的时间差异。
附图说明
17.图1是示出根据本发明的实施方式的多层培养容器的立体图。
18.图2是沿着图1中的线a-a截取的剖面图。
19.图3是示出向多层培养容器供应剥离液并将细胞浸入剥离液中的程序的图。
20.图4是示出根据变形例的多层培养容器的立体图。
21.图5是沿着图4中的线b-b截取的剖面图。
22.图6是示出传统的多层培养容器的立体图。
23.图7是示出用于向传统的多层培养容器供应剥离液并将细胞浸入剥离液中的程序的图。
具体实施方式
24.现在将参照附图详细描述本发明的优选实施方式。
25.根据本实施方式的多层培养容器1是能够在多个培养层中培养细胞的长方体形状的培养容器。如图1所示，多层培养容器1包括底板2、面对底板2的顶板3、连接底板2和顶板3的四个侧壁4、三个中间板5、供液/排液口6和排气口7。此外，多层培养容器1的内部空间在
平行于底板2的方向(在图1中的左右方向)上被划分为边界面(边界部分)10的一侧(图1中的左侧)的培养空间11和边界面10的另一侧(图1中的右侧)的缓冲空间12。
26.底板2和顶板3为矩形平板。底板2和顶板3彼此面对。此外，底板2和顶板3通过四个侧壁4连接。侧壁4包括一侧的侧壁4a、另一侧的侧壁4b以及与侧壁4a和4b连接的侧壁4c和4d。
27.中间板5在培养空间11内在平行于底板2的方向上延伸，并与侧壁4a、4c和4d的内表面接触。此外，三个中间板5在垂直于底板2的方向上一个叠一个地布置。细胞可附着在底板2和中间板5上。在边界面10处，形成有壁部分13，其包括从底板2在朝顶板的方向上延伸的壁部分，以及分别从三个中间板5中的每一个中间板5在朝顶板3的方向上延伸的壁部分。由底板2、一个中间板5、侧壁4a、4c和4d和一个壁部分13包围的区域、由两个中间板5、侧壁4a、4c和4d和一个壁部分13包围的区域以及由一个中间板5、顶板3、侧壁4a、4c和4d和一个壁部分13包围的区域分别构成培养层21。即，在本实施方式的多层培养容器1中形成四个培养层21。
28.此外，在壁部分13的全部上端部和中间板5或顶板3之间形成有用于使培养层21与缓冲空间12连通的连通部分14。此外，如图2所示，设置有倾斜板153，该倾斜板153从形成在底板2上的壁部分13的上端部朝向另一侧的侧壁4b延伸，同时朝顶板3倾斜。
29.供液/排液口6是用于向多层培养容器1供应液体和从多层培养容器1排出液体的开口部分，并且如图1所示，形成在顶板3的面对缓冲空间12的位置。此外，供液/排液口6例如以圆柱形形状突出，并且可以通过装上和卸下盖子而进行打开和关闭。
30.排气口7是用于排放多层培养容器1内的气体的开口部分，并且形成在顶板3的面对培养空间11的位置。此外，排气口7例如以圆柱形形状突出，并且可以通过装上和卸下盖子而进行打开和关闭。另外，在从侧壁4c朝向侧壁4d的方向上，供液/排液口6形成得比排气口7更靠近侧壁4c。
31.随后，下面将参照图3描述用于向根据本实施方式的多层培养容器1供应剥离液30并剥离细胞的程序。对于与图7所示的传统的多层培养容器一样的姿势，使用相同的名称。此外，图3中的阴影部分是存在剥离液30的区域。
32.首先，通过使侧壁4b或4c位于底侧，使多层培养容器1内的培养基从打开状态的供液/排液口6排出。随后，如图3(a)所示，将多层培养容器1放置在安装面上使得侧壁4b位于底侧，即，使得缓冲空间12位于底侧(以下称为储存姿势)，由此，剥离液30从供液/排液口6供应到缓冲空间12。
33.在供应剥离液30之后，如图3(b)所示，将多层培养容器1重新布置在安装面上使得侧面4c位于底侧(第一姿势)。结果，储存在缓冲空间12内的剥离液30的一部分经由连通部分14基本上均匀地流入各培养层21。接下来，如图3(c)所示，将多层培养容器1重新布置在安装面上使得侧壁4a位于底侧，即，使得培养空间11位于底侧(第二姿势)。因此，缓冲空间12中的全部剥离液30经由连通部分14基本上均匀地流入各培养层21。此后，如图3(d)所示，通过将多层培养容器1在安装面上布置成使得底板2位于底侧(第三姿势)，各培养层中的剥离液30沿着底板2或中间板5均匀地铺开。通过使多层培养容器1以第三姿势保持预定时间，从底板2和中间板5剥离细胞。然后，如图3(e)所示，将多层培养容器1布置成侧面4c位于底侧的第一姿势或缓冲空间12位于底侧的储存姿势(图3(a))，由此将细胞从供液/排液口6排
出。
34.本实施方式的多层培养容器1的内部空间被边界面10在平行于底板2的方向上分为一侧的培养空间11和另一侧的缓冲空间12。此外，多层培养容器1包括沿着平行于底板2的方向延伸并被构造为将培养空间11划分为四个培养层21的三个中间板5、布置在边界面10处的分别从底板2和三个中间板5在朝顶板3的方向上延伸的壁部分13、被构造为使缓冲空间12与各培养层21连通的四个连通部分14以及形成在顶板3的面对缓冲空间12的位置的供液/排液口6。
35.通过使用上述的多层培养容器1，可通过以下程序将剥离液30供应到各培养层21。首先，将多层培养容器1布置在安装面上使得另一侧的侧壁4d位于底侧，即，缓冲空间12位于底侧(储存姿势)。随后，将剥离液30从供液/排液口6供应到缓冲空间12。在供应剥离液30之后，将多层培养容器1重新布置在安装面上使得侧壁4c位于底侧，即，使得底板2和中间板5在水平方向上并排布置(第一姿势)。因此，缓冲空间12内的剥离液30的一部分经由连通部分14基本上均匀地流入各培养层21。接下来，将多层培养容器1重新布置在安装面上使得侧壁4a位于底侧，即，使得培养空间11位于底侧(第二姿势)。因此，缓冲空间12中的全部剥离液30经由连通部分14基本上均匀地流入各培养层21。最后，当将多层培养容器1布置在安装面上使得底板2位于底侧(第三姿势)时，各培养层21中的剥离液30沿着底板2或中间板5均匀地铺开。根据上述步骤，当正在从供液/排液口6供应剥离液30时，剥离液30流入缓冲空间12，而不流入各培养层21。此外，当在供应剥离液30之后将多层培养容器1以第一姿势和第二姿势重新布置两次时，剥离液30仅存在于每个培养层21的部分区域中。然而，这样的重新布置工作可以在短时间内完成。因此，对不同位置的细胞浸在剥离液30中的时间差异的影响很小。即，根据本发明，通过设置用于临时储存剥离液30的缓冲空间12，在供应剥离液30时，可以抑制细胞浸在剥离液30中的时间差异。
36.本实施方式的多层培养容器1具有倾斜板15，该倾斜板15从形成在底板2上的壁部分13的上端部朝向侧壁4d延伸，同时朝顶板3倾斜。储存在缓冲空间12中的剥离液30则经由连通部分14流入各培养层21。当壁部分13设置在底板上时，剥离液30的一部分保留在由壁部分13、底板2和侧面4d包围的缓冲空间12的一部分中。因此，在本实施方式中，设置了倾斜板15，该倾斜板15从设置在底板2上的壁部分13的上端部朝向侧壁4d延伸，同时朝顶板3倾斜。结果，保留在缓冲空间12中的剥离液30沿着倾斜板15流入底板2和中间板5之间的培养层21。因此，可以减少保留在缓冲空间12中的剥离液30，并且可以在不浪费的情况下使用剥离液30。
37.在本实施方式的多层培养容器1中，三个中间板5在培养空间11中延伸到边界面10。在传统的多层培养容器201中，如图6所示，培养层221通过中间板205彼此完全隔开。因此，为了向各培养层221供应剥离液30，需要提供具有贯穿中间板205的圆柱形形状并包括形成在圆柱形侧面上用于与各培养层221连通的多个连通部分214的供液/排液部件206。相比之下，在本实施方式的多层培养容器1中，如图1所示，中间板5在一侧的培养空间11中延伸到边界面10，而不延伸到另一侧的缓冲空间12。即，缓冲空间12不被中间板5隔开。供应到缓冲空间12的剥离液30可以经由形成在边界面10上的连通部分14流入各培养层21。因此，根据本实施方式的构造，为了向各培养层21供应剥离液30，仅在面对缓冲空间12的位置形成开口(供液/排液口6)就足够了。与需要形成贯穿中间板205的圆柱形的供液/排液部件
206的传统的多层培养容器201相比，本实施方式的多层培养容器1可以容易地制造。
38.尽管已在上文中描述了本发明的优选实施方式，但本发明不限于该实施方式，并且只要权利要求书中叙述了各种变形，就可以做出各种变形。
39.在上述实施方式中，中间板5在培养空间11内在平行于底板2的方向上延伸，并与侧壁4a、4c和4d的内表面接触。然而，中间板5可在培养空间11和缓冲空间12中都沿平行于底板2的方向延伸。例如，在根据变形的多层培养容器101中，如图4和图5所示，三个中间板105沿着平行于底板2的方向延伸，并与侧壁4a、4b、4c和4d的内表面接触。在这种情况下，三个中间板105在缓冲空间12中形成有贯穿三个中间板105的通孔16。根据该构造，如图5所示，通过延伸到侧壁4d的中间板105将缓冲空间12分为与四个培养层21相对应的四个缓冲层22。此外，由于通孔16形成在中间板105中，因此液体或气体可以在缓冲层22之间流动。因此，当将剥离液30供应到缓冲空间12，然后将多层培养容器重新布置在安装面上使得侧壁4c位于底侧(第一姿势)时，一部分剥离液30基本上均匀地流入各培养层21，而剩余部分的剥离液30基本上均匀地被分开供应到缓冲层22并储存在缓冲层22中。从该状态开始，当多层培养容器101被重新布置在安装面上使得培养空间11位于底侧(第二姿势)时，基本上均匀地储存在各缓冲层22中的剩余部分的剥离液30经由连通部分14流入各培养层21。因此，全部剥离液30可以更均匀地供应到各培养层21。
40.在上述变形中，中间板105与侧壁4d的内表面接触。然而，中间板105可以不与侧壁4d的内表面接触。在这种情况下，例如，中间板105延伸到培养空间12中的边界面10与侧壁4d之间的位置。此外，在这种情况下，由于中间板105与侧壁4d之间存在间隙，因此不需要用于允许液体或气体在缓冲层之间流动的通孔16。
41.在上述实施方式和上述变形中，布置了三个中间板。替代地，可布置一个或两个中间板，或四个或更多个中间板。
42.此外，在上述实施方式中，在边界面10处，壁部分13从底板2和每个中间板5在垂直于底板2和中间板5的方向上朝顶板3延伸。然而，壁部分13可以向一侧或另一侧倾斜。此外，每个连通部分14可以形成在每个壁部分13的上端部的一部分与每个中间板5或顶板3之间。在这种情况下，未形成每个连通部分14的每个壁部分13的上端部的剩余部分与中间板5或顶板3接触。替代地，每个壁部分13的整个上端部与中间板5或顶板3接触，并且可以在壁部分13的任意位置形成一个或多个连通部分14。
43.在上述实施方式中，供液/排液口6形成在顶板3的面对缓冲空间12的位置。然而，供液/排液口6可以形成在侧壁4b、4c或4d的面对缓冲空间12的位置。
44.在上述实施方式中，排气口7形成在顶板3的面对培养空间11的位置。然而，排气口7可形成在侧壁4a、4b、4c或4d的面对培养空间11或缓冲空间12的位置处。
45.在上述实施方式中，通过使添加有剥离液的多层培养容器以第三姿势保持预定时间，从底板2和中间板5剥离细胞。然而，例如，在将多层培养容器1以第三姿势保持预定时间之后，可敲击多层培养容器1以从培养层剥离细胞。在这种情况下，与仅将多层培养容器1保留预定时间相比，剥离细胞变得更容易。
46.在上述实施方式中，底板2和顶板3为矩形形状。然而，底板2和顶板3可以具有梯形形状、其他多边形形状、椭圆形形状或其组合。
47.附图标记说明
48.1101：多层培养容器
49.2：底板
50.3：顶板
51.4、204：侧壁
52.5、105、205：中间板
53.6：供液/排液口
54.7：排气口
55.10：边界面
56.11：培养空间
57.12：缓冲空间
58.13：壁部分
59.14：连通部分
60.15：倾斜板
61.16：通孔
62.21、221：培养层