测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法与流程

1.本发明涉及酶动力学分析技术领域，具体为测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法。


背景技术：

2.lpaat基因家族及其同源基因，属于膜结合型酰基转移酶的超级家族，lpaat是磷脂和三酰基甘油合成的关键中间体，在生成pa过程中起着重要作用，因此体外lpaat酶活性测定能够准确了解这些酶的生理功能，在植物中lpaat与叶绿体、内质网膜和线粒体膜紧密相连，在拟南芥质体中，溶血磷脂酸转移酶是胚胎合成的关键调控因子，多种基因在不同器官或组织中生产不同类型的脂中间产物，在功能和活力中有较大的差异，因此，体外溶血磷脂酸酰基转移酶的参数测定，底物偏好测定和活力测定非常有意义，但此类测定目前多依赖于放射性同位素技术，该方法底物高昂，对人体不利，且传统方法只能在同一个反应中检测同一种酶的反应参数。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，包括以下步骤：步骤一，叶片瞬时表达和载体构建；步骤二，农杆菌介导在本氏叶片瞬时表达农杆菌菌株；步骤三，叶片细胞微粒体的提取；步骤四，体外lpaat反应；步骤五，lc-ms脂组学测定；
5.其中在上述步骤一中，将含有35s启动子调控的p19基因的表达载体转入gv3101农杆菌系中，将拟南芥叶片的lpaat序列和油菜的lpaat序列的内含子经优化克隆进pjp3343载体，最终将载体导入农杆菌agl1随同病毒沉默蛋白p19注射进烟草的叶片，待用；
6.其中在上述步骤二中，首先将含基因表达载体的农杆菌接种于lb培养基，于28℃条件下黑暗培养至生长对数期，然后离心收集菌体，加buffer重悬，于28℃继续培养2h，最后注射到本氏烟草叶片并标记注射范围，光照培养5天后沿标记区域剪下叶片，冻干待用；
7.其中在上述步骤三中，取步骤二中所制备的冻干叶片，于研钵中加液氮研磨成粉，加buffer a充分研磨，离心后弃上清，再使用buffer b润洗底部微粒体，并转入匀浆器充分研磨，最后通过液氮极速冷冻，于-80℃保存，待用；
8.其中在上述步骤四中，反应总体积为100ul，以6nm的lpa作为底物，6nm乙酰辅酶a为酰基供体，50ul缓冲液(0.2m、ph＝7的tris，0.4m的蔗糖，20ug/ul的牛血清蛋白bsa)和15μg步骤三中制备的微粒体进行体外lpaat反应，将上述4种成分充分混合后，在室温下700rpm震荡培养30min，在反应的0，5，10，15和30min分别取出15μl反应混合物加入1.2ml的氯仿/甲醇(2/1，v/v)和0.3ml的kcl终止反应，再以2500rpm的速度震荡7min，以1700xg离心5min，收集下层脂质相，将收集的脂质溶液的溶剂在氮气下吹干，备用；
9.其中在上述步骤五中，取lpaat体外干燥油样，溶解于20μl的叔丁醇和甲醇混合溶液，取2μl进行lc-ms分析。
10.优选的，所述步骤一中，p19基因为番茄丛矮病病毒沉默抑制子，拟南芥叶片的lpaat序列为np_567052，油菜的lpaat序列为np_001302955。
11.优选的，所述步骤二中，lb培养基配方为10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母膏和5g/l的nacl，ph＝7.0；buffer为5mm的mes、5mm的mgso4和100μm的乙酰丁香酮，ph＝5.7。
12.优选的，所述步骤二中，离心收集菌体是取200μl培养液于10ml培养基中再次培养，然后在4000r/min下离心5min。
13.优选的，所述步骤三中，buffer a为ph7.2的k2hpo4/kh2po4溶液、0.33m蔗糖、0.1％牛血清蛋白和1000u/ml过氧化氢酶；离心条件为：37000r/min，温度为4℃，离心时间为90min；buffer b为ph7.2的k2hpo4/kh2po4溶液。
14.优选的，所述步骤五中，混合溶液中叔丁醇和甲醇的比例为1:1，且混合溶液中含有10mm丁羟甲苯。
15.优选的，所述步骤五中，色谱条件：waters behc8色谱柱(100
×
2.1mm，2.7μm)；流动相：a相为乙腈-甲醇-水(5:4:1，v/v，含0.2％甲酸，10mmol/l甲酸胺和8mmol/l磷酸)；b相为异丙醇-乙腈-水(15:3:1，v/v，含0.2％甲酸，10mmol/l甲酸胺和8mmol/l磷酸)；流速：200μl/min；柱温：40℃；进样量：2μl。
16.优选的，所述步骤五中，质谱条件：电喷雾离子源(esi)，负离子扫描模式，干燥气体温度和流速分别为210℃和15l/min，喷雾器电压为20psi，鞘气流速和温度分别为10l/min和350℃，喷嘴电压1000v，离子气流温度和流速为350℃和10l/min，喷雾器压强20psi，喷嘴电压1000v，毛细管电压3000v，二级离子漏斗的高低压辐射频率分别为120khz、180khz。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用lc-ms非放射性检测技术测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数，具有高效分离能力和高灵敏度检测能力，能够在单次分析中量化不同的脂质类别，该法简单快捷，且避免了放射性底物对人体的伤害，同时结合三重四极技术实现了对目标脂质化合物的高通量分析，并可以根据质谱仪的采集速度等因素对目标种类的动态范围进行量化。
附图说明
18.图1为本发明的方法流程图；
19.图2为基于lc-ms技术检测pa和dag的合成动力学参数特征曲线图。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.请参阅图1-2，本发明提供的一种实施例：测定溶血磷脂酸酰基转移酶动力学参数的方法，包括以下步骤：步骤一，叶片瞬时表达和载体构建；步骤二，农杆菌介导在本氏叶片
瞬时表达农杆菌菌株；步骤三，叶片细胞微粒体的提取；步骤四，体外lpaat反应；步骤五，lc-ms脂组学测定；
22.其中在上述步骤一中，将含有35s启动子调控的p19基因的表达载体转入gv3101农杆菌系中，将拟南芥叶片的lpaat序列和油菜的lpaat序列的内含子经优化克隆进pjp3343载体，最终将载体导入农杆菌agl1随同病毒沉默蛋白p19注射进烟草的叶片，待用，其中p19基因为番茄丛矮病病毒沉默抑制子，拟南芥叶片的lpaat序列为np_567052，油菜的lpaat序列为np_001302955；
23.其中在上述步骤二中，首先将含基因表达载体的农杆菌接种于lb培养基，于28℃条件下黑暗培养至生长对数期，然后取200μl培养液于10ml培养基中再次培养，在4000r/min下离心5min收集菌体，加buffer重悬，于28℃继续培养2h，600nm测定各菌株吸光度，并buffer调至0.125，之后注射到5周半大小的本氏烟草叶片，标记注射范围，继续在光照下生长5天后，沿标记区域，剪下叶片，迅速冷冻于液氮，冷冻干燥后用于脂类分析，其中，lb培养基配方为10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母膏和5g/l的nacl，ph＝7.0；buffer为5mm的mes、5mm的mgso4和100μm的乙酰丁香酮，ph＝5.7；
24.其中在上述步骤三中，取步骤二中所制备的冻干叶片，于研钵中加液氮研磨成粉，加入10ml的buffer a充分研磨，将混合液转入30ml塑料离心管中，用3.5mlbuffer a润洗研钵并将润洗液与样品混合，使用高速离心机以13000r/min在4℃条件下离心10min，上清液通过聚酯人造纤维滤布过滤并以37000r/min在4℃条件下离心90min，完成离心后倒掉上清液，再使用2ml的buffer b润洗底部微粒体，向离心管中加入300μl的buffer b并将其转移至1ml匀浆器充分研磨，最后转入微量离心管通过液氮极速冷冻，于-80℃保存，蛋白质含量通过bca试剂测定，采用牛血清蛋白作为标准物质定量分析，其中，buffer a为ph7.2的k2hpo4/kh2po4溶液、0.33m蔗糖、0.1％牛血清蛋白和1000u/ml过氧化氢酶；离心条件为：37000r/min，温度为4℃，离心时间为90min；buffer b为ph7.2的k2hpo4/kh2po4溶液；
25.其中在上述步骤四中，反应总体积为100ul，以6nm的lpa作为底物，6nm乙酰辅酶a为酰基供体，50ul缓冲液和15μg步骤三中制备的微粒体进行体外lpaat反应，将上述4种成分充分混合后，在室温下700rpm震荡培养30min，在反应的0，5，10，15和30min分别取出15μl反应混合物加入1.2ml的氯仿/甲醇(2/1，v/v)和0.3ml的kcl终止反应，再以2500rpm的速度震荡7min，以1700xg离心5min，收集下层脂质相，将收集的脂质溶液的溶剂在氮气下吹干，备用，其中缓冲液为0.2m、ph＝7的tris，0.4m的蔗糖，20ug/ul的牛血清蛋白bs)；
26.其中在上述步骤五中，取lpaat体外干燥油样，溶解于20μl的叔丁醇和甲醇混合溶液，取2μl进行lc-ms分析，创建dag和pa线性标准曲线，每种脂质类别的r2》0.99，手动检测峰值保留时间以确保该样本是否属于目标物质，收集lpa，反应不同时间检测pa合成效率，通过计算样本的峰面积减去p19对照的峰面积来比较不同lpaat酶的峰面积，其中，混合溶液中叔丁醇和甲醇的比例为1:1，且混合溶液中含有10mm丁羟甲苯，色谱条件：waters behc8色谱柱(100
×
2.1mm，2.7μm)；流动相：a相为乙腈-甲醇-水(5:4:1，v/v，含0.2％甲酸，10mmol/l甲酸胺和8mmol/l磷酸)；b相为异丙醇-乙腈-水(15:3:1，v/v，含0.2％甲酸，10mmol/l甲酸胺和8mmol/l磷酸)；流速：200μl/min；柱温：40℃；进样量：2μl；质谱条件：电喷雾离子源(esi)，负离子扫描模式，干燥气体温度和流速分别为210℃和15l/min，喷雾器电压为20psi，鞘气流速和温度分别为10l/min和350℃，喷嘴电压1000v，离子气流温度和流
速为350℃和10l/min，喷雾器压强20psi，喷嘴电压1000v，毛细管电压3000v，二级离子漏斗的高低压辐射频率分别为120khz、180khz。
27.梯度洗脱程序见下表：
28.时间/mina相/％b相/％099129915802084060123070141090
29.基于上述，本发明的优点在于，该法简单且快捷，避免了昂贵且具有放射性的底物对人体的伤害，实现了对目标脂质化合物的高通量分析并准确定量，并进一步扩宽了了lc-ms方法在油脂合成动力学方面的应用，本发明还适用于其他脂类如动物脂类的酶促反应分析。
30.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。