包括胞苷类似物的反义RNA编辑寡核苷酸的制作方法

包括胞苷类似物的反义rna编辑寡核苷酸
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技术领域
5.本发明涉及医药领域。具体地，涉及rna编辑领域，其中通过单链反义寡核苷酸(aon)靶向细胞中的rna分子，以特异性地改变靶rna分子中存在的靶核苷酸。更具体地，本发明涉及rna-编辑aon，其包括修饰的核苷酸以改善其体内和体外rna编辑效果。


背景技术：

6.rna编辑是一个自然过程，通过该过程，真核细胞通常以位点特异性和精确的方式改变其rna分子的序列，从而将基因组编码的rna库增加几个数量级。对于整个动植物界的真核物种已经描述了rna编辑酶，并且这些过程在管理细胞稳态方面从最简单的生命形式(例如秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans))到人的后生动物中都发挥着重要作用。rna编辑的实例是腺苷(a)到肌苷(i)的转化和胞苷(c)到尿苷(u)的转化，它们分别通过称为作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)和apobec/aid(作用于rna的胞苷脱氨酶)而发生。
7.adar是一种多结构域蛋白质，包括一个催化结构域和两到三个双链rna识别结构域，其取决于所讨论的酶。每个识别结构域识别特定的双链rna(dsrna)序列和/或构象。催化结构域也在识别和结合部分dsrna螺旋方面发挥作用，尽管催化结构域的关键功能是通过核碱基的脱氨基，在靶rna中附近的、或多或少预定的位置将a转化为i。肌苷被细胞的翻译机制解读为鸟苷，这意味着，如果所编辑的腺苷位于mrna或前体mrna的编码区，则它可以编码蛋白质序列。a到i的转化也可能发生在靶mrna的5’非编码序列中，在原始起始位点上游创建新的翻译起始位点，从而产生n-端延长的蛋白质，或者在3’utr或转录物的其它非编码部分中，这可能会影响rna的加工和/或稳定性。此外，a到i的转化可能发生在前体mrna中的内含子或外显子中的剪接元件中，从而改变剪接模式。其结果，可以包括或跳过外显子。催化腺苷脱氨基的酶属于adar酶家族，其包括人脱氨酶hadar1和hadar2，以及hadar3。然而，对于hadar3，尚未显示脱氨酶活性。
8.已经对使用寡核苷酸通过应用腺苷脱氨酶编辑靶rna进行了描述(例如woolf等.1995.pnas 92:8298-8302；montiel-gonzalez等.pnas 2013,110(45):18285
–
18290；vogel等.2014.angewandte chemie int ed 53:267-271)。montiel-gonzalez等人(2013)描述的方法的缺点是需要融合蛋白，该融合蛋白由噬菌体λn-蛋白的boxb识别结构域组成，基因融合到截短的天然adar蛋白质的腺苷脱氨酶结构域。它需要用融合蛋白转导靶细胞，
这是一个主要障碍，或者需要用编码工程化腺苷脱氨酶融合蛋白的核酸构建体转染靶细胞以进行表达。vogel等人(2014)描述的系统也有类似的缺点，因为不清楚如何应用该系统而不必先对adar进行基因修饰，随后转染或转化带有靶rna的细胞，以便为细胞提供这种基因工程蛋白。显然，这些系统不容易适用于人(例如在治疗环境中)。woolf等人(1995)的寡核苷酸与靶rna序列100％互补，似乎只在细胞提取物或通过显微注射在非洲爪蟾(xenopus)卵母细胞中起作用，并且严重缺乏特异性：靶rna链中与反义寡核苷酸互补的几乎所有腺苷都被编辑。一种长度为34个核苷酸的寡核苷酸，其中每个核苷酸都携带2
’‑
o-甲基(2
’‑
ome)修饰，在woolf等人(1995)中进行测试并显示无活性。为了提供针对核酸酶的稳定性，还测试了用2
’‑
ome修饰并在5
’‑
和3
’‑
端5个核苷酸处用硫代磷酸酯(ps)键合(linkage)修饰的34-聚体rna。表明该寡核苷酸的中央未修饰区可以促进内源性adar对靶rna的编辑，末端修饰防止外切核酸酶降解。然而，该系统没有显示靶rna序列中特定靶腺苷的脱氨基。如前所述，与反义寡核苷酸中未修饰核苷酸相对的几乎所有腺苷都被编辑(因此，如果反义寡核苷酸的5
’‑
和3
’‑
端5个核苷酸被修饰，则为与中央未修饰区中的核苷酸相对的几乎所有腺苷，或如果没有核苷酸被修饰，则为靶rna链中的几乎所有腺苷)。
9.本领域已知adar可以作用于任何dsrna。通过有时称为“混杂编辑(promiscuous editing)”的过程，该酶将会编辑dsrna中的多个a。因此，需要有绕过这种混杂编辑并且仅靶向靶rna分子中的特定腺苷以成为治疗适用的方法和手段。vogel等人(2014)表明可以通过在寡核苷酸中与不应编辑的腺苷相对的位置处使用2
’‑
ome修饰的核苷酸，并与靶rna上特异性靶向的腺苷直接相对处使用未修饰核苷酸，从而抑制这种脱靶编辑。然而，在不使用与aon具有共价键的重组adar酶的情况下，尚未显示出靶核苷酸处的特定编辑效果。
10.wo2016/097212公开了用于rna靶向编辑的反义寡核苷酸(aon)，其中aon的特征在于与靶rna序列互补的序列(在此称为“靶向部分”)以及存在茎-环结构(在此称为“募集部分”)，其优选与靶rna不互补。将这种寡核苷酸称为“自环(self-looping)aon”。募集部分用于将细胞中存在的天然adar酶募集到通过靶序列与靶向部分杂交形成的dsrna。由于募集部分，不需要缀合的实体或存在修饰的重组adar酶。wo2016/097212将募集部分描述为模拟天然底物(例如glub受体)的茎环结构或已知被adar酶的dsrna结合结构域或z-dna结合结构域识别的z-dna结构。茎环结构可以是由两条单独的核酸链形成的分子间茎环结构，或在单个核酸链内形成的分子内茎环结构。wo2016/097212中描述的募集部分的茎环结构是分子内茎环结构，其在aon本身内形成，并且能够吸引adar。
11.wo2017/220751和wo2018/041973描述了不包括这种茎环结构但与靶区域(几乎完全)互补的aon，除了一个或多个错配核苷酸，或所谓的“摆动(wobbles)”，或“凸起(bulges)
”’
。唯一的错配可以在与靶腺苷相对的核苷酸位点处，但在其它实施方式中，将aon描述为当连接到靶序列区域时具有多个凸起和/或摆动。当精心选择aon的序列以吸引adar时，似乎可以使用缺乏茎环结构的aon和内源性adar酶来实现体外、离体和体内rna编辑。“孤儿核苷酸(orphan nucleotide)”被定义为aon中与靶rna分子中的靶腺苷直接相对的核苷酸，其不携带2
’‑
ome修饰。孤儿核苷酸也可以是dna核苷酸(不携带2’修饰的是糖实体)，其中aon的其余部分确实在糖实体处携带有2
’‑
o-烷基修饰(例如2
’‑
ome)，或直接围绕孤儿核苷酸的核苷酸含有特定的化学修饰(或是dna)，可进一步改善rna编辑效率和/或增加对核酸酶的抗性。通过使用“保护”aon免受破坏的有义寡核苷酸(son)，甚至可以进一步
改善这种效果(在wo2018/134301中描述)。
12.尽管取得了上述成果，仍然需要有可以利用(内源性)细胞通路和具有脱氨酶活性的酶的改进化合物，例如天然表达的adar酶，以更加特异性、更加有效地编辑哺乳动物细胞、甚至整个生物体中的内源性核酸，以减轻疾病。


技术实现要素：

13.本发明涉及一种反义寡核苷酸(aon)，其能够与靶rna分子形成双链核酸复合物，其中双链核酸复合物能够募集adar酶，使靶rna分子中的至少一个靶腺苷脱氨基，其中aon中与靶腺苷直接相对的核苷酸是胞苷类似物，该胞苷类似物在n3位点充当h-键供体。在本发明的aon中使用的优选的胞苷类似物是假异胞苷(pseudoisocytidine)(pic)和本纳碱基z(benner’s base z)(dz)。根据本文公开的教导可以使用的其它优选的胞苷类似物是5-羟基c-h 、5-氨基c-h 和8-氧代a(syn)。优选地，胞苷类似物不携带2
’‑
ome或2
’‑
moe核糖修饰。在优选的方面，本发明的aon还包括一个或多个在核糖的2’位置处包括取代的核苷酸，其中取代选自：-oh；-f；可被一个或多个杂原子间断的取代或未取代的、直链或支链的低级(c1-c10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基；-o-、s-或n-烷基；-o-、s-或n-烯基；-o-、s-或n-炔基；-o-、s-或n-烯丙基；-o-烷基-o-烷基；-甲氧基；-氨基丙氧基；-甲氧基乙氧基；-二甲氨基氧乙氧基；和-二甲氨基乙氧基乙氧基。在另一个优选方面，所募集的adar酶是内源性酶，优选为内源性adar2酶。
14.在另一实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其包括根据本发明的aon和药学上可接受的载体或稀释剂。
15.在另一实施方式中，本发明涉及根据本发明的aon、或根据本发明的药物组合物，用于治疗或预防遗传性疾病，优选地选自：囊性纤维化、hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(a1at)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、cadasil综合征、charcot-marie-tooth病、慢性阻塞性肺病(copd)、远端脊髓性肌萎缩症(dsma)、duchenne/becker肌营养不良症、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、因子v leiden相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特氏综合征、亨廷顿氏舞蹈病、炎症性肠病(ibd)、遗传性多凝集反应综合征、leber先天性黑蒙、lesch-nyhan综合征、lynch综合征、马凡氏综合征、粘多糖贮积症、肌营养不良症、i型和ii型肌强直性营养不良症、神经纤维瘤病、a、b和c型尼曼-匹克病、ny-eso1相关癌症、peutz-jeghers综合征、苯丙酮尿症、pompe病、原发性纤毛病、凝血酶原突变相关疾病例如凝血酶原g20210a突变、肺动脉高压症、(常染色体显性)色素性视网膜炎、sandhoff病、严重联合免疫缺陷综合征(scid)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌萎缩症、stargardt病、泰-萨二氏病(tay-sachs disease)、usher综合征(例如i型、ii型和iii型usher综合征)、x染色体连锁免疫缺陷病、sturge-weber综合征和癌症。
16.在另一实施方式中，本发明涉及一种使细胞内靶rna分子中存在的靶腺苷脱氨基的方法，该方法包括以下步骤：为细胞提供根据本发明的aon或根据本发明的药物组合物；允许aon与靶rna分子退火以形成能够在细胞内募集内源性adar酶的双链核酸复合物；允许adar酶使靶rna分子中的靶腺苷脱氨基；和任选地鉴定靶rna分子中脱氨基的腺苷的存在。在又一实施方式中，本发明涉及一种使靶rna分子中存在的至少一个靶腺苷脱氨基的方法，
该方法包括以下步骤：提供根据本发明的aon；允许aon与靶rna分子退火以形成双链核酸复合物；允许哺乳动物adar酶使靶rna分子中的靶腺苷脱氨基；和任选地鉴定靶rna分子中脱氨基的腺苷的存在。
附图说明
17.现将参照附图仅通过示例的方式描述本发明的一个或多个实施方式，其中：
18.图1示出与dsrna结合的adar2 e488q突变体的晶体结构以及488位的谷氨酰胺(gln)与孤儿胞苷之间的接触。
19.图2示出在488位具有谷氨酸(glu)的野生型adar2与孤儿胞苷之间的质子化依赖性接触。
20.图3(左侧)示出在488位具有谷氨酸(glu)的野生型adar2与在n3处提供氢键供体以与谷氨酸残基相互作用的胞苷类似物“假异胞苷”(pic)之间的相互作用。右侧示出胞苷类似物pic和本纳碱基z(dz)的结构，表明n3处存在氢(正常胞苷中不存在)。
21.图4示出两种胞苷类似物5-羟基胞苷-h (左)和5-氨基胞苷-h (中)以及腺苷类似物8-氧代腺苷(右)，模拟本文所述的胞苷类似物。
22.图5示出靶小鼠idua rna序列(5’到3’；seq id no:2)，靶腺苷略向上。在靶序列下方，给出29nt向导rna反义寡核苷酸(从3’到5’；seq id no:1)。n代表孤儿核苷酸(与靶腺苷相对)，其可以是正常的(脱氧)胞苷，或本文所述的胞苷类似物，例如pic或dz。
23.图6示出动力学分析的结果，其对携带与靶腺苷相对的正常胞苷(“c”)的aon和携带与靶腺苷相对的假异胞苷(pic)的aon进行比较。
24.图7示出动力学分析的结果，其对携带与靶腺苷相对的正常胞苷(脱氧-c，或此处：“dc”)的aon和携带与靶腺苷相对的本纳碱基z(dz)的aon进行比较。
25.图8示出动力学分析的结果，其对以下三个aon进行比较：一个携带与靶腺苷相对的正常胞苷(脱氧-c，或此处：“dc”)，一个携带与靶腺苷相对的本纳碱基及z(dz)作为胞苷类似物的aon，一个携带与靶腺苷相对的脱氧假异胞苷(dpic)作为胞苷类似物。
26.图9示出(a)经过aon靶向的a到i编辑的小鼠mrnaidua序列(下链；5’到3’；seq id no:6)，待编辑的a核苷酸以粗体表示。上链从3’到5’显示rna编辑aon序列(seq id no:7)。与待编辑的a相对的c核苷酸以粗体和下划线表示。(b)示出测试的两个aon，此处从5’到3’(与(a)中的序列相同)。小写的核苷酸是2
’‑
ome修饰的rna核苷酸。大写的核苷酸是dna核苷酸。星号(*)表示硫代磷酸酯(ps)键合。idua287中的正常脱氧胞苷(dc)核苷酸和idua294中的胞苷类似物本纳碱基z(dz)核苷酸以粗体和下划线表示。
27.图10示出在转染后(应用内源性adar)使用aon idua287和idua294在原代小鼠肝成纤维细胞测定中对编辑百分比进行ddpcr分析的结果。
具体实施方式
28.对于改进rna-编辑反义寡核苷酸(aon，有时称为“编辑寡核苷酸”或“eon”)的药代动力学特性，而不对靶rna中靶腺苷的编辑效率产生负面影响，始终存在需求。许多化学修饰存在于aon的生成过程中，其特性并不总是与实现高效rna编辑的要求兼容。在寻找更好的药代动力学特性的过程中，早先发现一些(但不是全部)核苷酸的核糖的2
’‑
o-甲氧基乙
基(或2
’‑
甲氧基乙氧基；或2
’‑
moe)修饰出人意料地似乎与有效的adar接合和编辑兼容(wo2019/1548475)。
29.人adar2的诱变研究表明，与野生型酶相比，残基488处从谷氨酸到谷氨酰胺(e488q)的单个突变，使脱氨基的速率常数增加60倍(kuttan和bass.proc natl acad sci usa 2012.109(48):e3295-3304)。在脱氨基反应期间，adar将编辑后的碱基从其rna双链体中翻转出来，并进入酶活性位点(matthews等，nat struct mol biol 2016.23(5):426-433)。当adar2在优选的上下文(a:c错配)中编辑腺苷时，通常将与靶腺苷相对的核苷酸称为“孤儿胞苷”。adar2 e488q与双链rna(dsrna)结合的晶体结构表明，488位的谷氨酰胺(gln)侧链能够向孤儿胞苷的n3位提供h键(图1)，从而导致adar2 e488q的催化速率增加(kuttan和bass.2012)。在谷氨酸(glu)代替谷氨酰胺(gln)存在于488位的野生型酶中，不存在谷氨酰胺的酰胺基，而是羧酸。为了获得与e488q突变体相同的孤儿胞苷的接触，对于野生型情况，需要质子化才能发生这种接触(图2)。为了利用内源性表达的adar2来纠正疾病相关突变(而不是突变adar2版本，其可能需要过表达和外源施用)，必须使细胞中存在的野生型adar2酶的编辑效率最大化。代替使用酶突变体，本发明的发明人旨在使用具有修饰的rna碱基的aon，特别是在孤儿胞苷的位置，以模拟由e488qadar2突变体观察到的氢键模式。通过用特定的胞苷类似物来代替aon中与靶腺苷相对的核苷酸，这些胞苷类似物将作为n3的h-键供体，可以设想有可能使相同的接触稳定化，认为这提供了突变酶催化速率的增加。图3示出两个胞苷类似物：假异胞苷(也称为“pic”；lu等.j org chem 2009.74(21):8021-8030；burchenal等.(1976)cancer res36:1520-1523)和本纳碱基z(也称为“dz”；yang等.nucl acid res 2006.34(21):6095-6101)，最初选择它们是因为它们在n3处提供氢键供给，对碱基的形状干扰最小。图4示出可以应用于相同目的的其它非限制性碱基类似物。随附的示例示出adar2的动力学分析，该分析在应用具有pic作为与靶腺苷相对的核苷酸的aon后进行，与在该位置携带正常胞苷的aon进行比较。这些实验表明，使用pic孤儿核苷时的脱氨基率比使用携带正常胞苷作为相同位置的aon时的脱氨基率高约1.8倍(图6和8)。还发现，在相同的设置中，将携带与靶腺苷相对的正常胞苷(脱氧-c，或dc)的aon与携带与靶腺苷相对的本纳碱基z类似物(dz)的aon进行比较时，rna编辑也得到改善(图7和8)。在原代小鼠成纤维细胞中使用转染设置，在aon的进一步相同的环境中将脱氧c与dz进行比较时，rna编辑也得到增加(图10)。这些结果表明，发明人确实能够通过使用在孤儿核苷位置携带核苷类似物的aon来提高脱氨基效率，其中类似物的n3位点用作h-键供体位点。
30.除了对核糖2’基团的修饰外，本发明的aon中还可以存在胞苷类似物。aon中的核糖2’基团可以独立地选自2
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h(即dna)、2
’‑
oh(即rna)、2
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ome、2
’‑
moe、2
’‑
f或2
’‑4’
连接(即锁核酸或lna)、或其它2’取代。不同的2’修饰在wo2016/097212、wo2017/220751、wo2018/041973和wo2018/134301中有进一步详细讨论。2
’‑4’
键合可以选自本领域已知的接头，例如亚甲基接头或受限乙基接头。在所有情况下，修饰应与编辑兼容，以便寡核苷酸履行其作为rna编辑aon的作用。通过在与具有核苷酸脱氨酶活性的酶的编辑活性并非不兼容的位置中产生至少一个解锁的核酸(una)核糖修饰，aon可以进一步优化以与具有核苷酸脱氨基活性的酶结合(如pct/ep2020/053283所述，未公开)。在una修饰中，核糖2’和3’碳原子之间没有碳-碳键。因此，una核糖修饰增加了寡核苷酸的局部灵活性(flexibility)。una可以通过改善抗降解性产生例如改善药代动力学特性的效果。una还可以降低毒性，并可以
参与减少脱靶效应。优选地，aon是靶向前体mrna或mrna的rna编辑单链aon，其中靶核苷酸是靶rna中的腺苷，其中腺苷脱氨基成肌苷，肌苷被翻译机制读为鸟苷。优选地，腺苷位于uga或uag终止密码子中，其被编辑为ugg密码子；或者其中两个靶核苷酸是uaa终止密码子中的两个腺苷，该密码子通过两个靶腺苷的脱氨基被编辑成ugg密码子，其中寡核苷酸中的两个核苷酸与靶核酸错配。
31.根据本发明的aon可以包括核苷间键合(internucleoside linkage)修饰。在一实施方式中，一个这样的其它核苷间键合可以是膦酰基乙酸酯、硫代磷酸酯(ps)或甲基膦酸酯(mp)修饰的键合。优选的键合是ps键合。mp键合的优选位置在pct/ep2020/059369(未公开)中加以描述。在另一实施方式中，核苷酸间键合可以是磷酸二酯，其中磷酸二酯的oh基团已被烷基、烷氧基、芳基、烷硫基、酰基、-nr1r1、烯氧基、炔氧基、烯硫基、炔硫基、-s-z 、-se-z 、或-bh3-z 替换，其中r1独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳基，其中z 为铵离子、烷基铵离子、杂芳族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任一者为伯离子、仲离子、叔离子或季离子，或z是一价金属离子，并且优选是ps键合。
32.在本发明的aon中，孤儿核苷酸(与靶腺苷直接相对的核苷酸)通常包括具有2
’‑
oh基团的核糖或具有2
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h基团的脱氧核糖，优选不包括携带2
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ome修饰的核糖。此外，本发明的aon通常在相对于孤儿核苷酸的某些位置处不包括2
’‑
ome修饰，还可以在aon内的其它位置处包括2
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moe修饰。
33.本发明涉及一种使细胞内靶rna分子中存在的至少一种靶腺苷脱氨基的方法，该方法包括以下步骤：向细胞提供根据本发明第一方面的aon或根据本发明第二方面的组合物，允许aon被细胞摄取，允许aon与靶rna分子退火，允许具有核苷酸脱氨酶活性的哺乳动物酶使靶rna分子中的靶核苷酸脱氨基，并且任选地鉴定靶rna分子中脱氨基的核苷酸的存在。优选地，靶rna分子的存在通过以下任一进行检测：(i)对靶序列进行测序，(ii)当靶腺苷位于uga或uag终止密码子中时，其通过脱氨基编辑为ugg密码子，评估功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在，(iii)当两个靶腺苷位于uaa终止密码子中时，其通过两个靶腺苷的脱氨基编辑为ugg密码子，评估功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在，(iv)评估前体mrna的剪接是否通过脱氨基而改变；或(v)使用功能读出(functional read-out)，其中脱氨基后的靶rna编码功能性、全长的、延长和/或野生型蛋白质。因此，本发明还涉及靶向(前体)mrna中存在的提前终止密码子(ptc)的aon，以将终止密码子中存在的腺苷改变为肌苷(读作g)，其继而则导致翻译期间的读-通(read-through)以及全长功能性蛋白质。如本文所述，本发明的教导适用于可以用aon靶向并且可以通过rna编辑治疗的所有遗传性疾病。
34.在优选的实施方式中，根据本发明的aon包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个与互补靶rna区的错配、摆动和/或凸起。当靶腺苷相对的核苷酸是胞苷类似物时，aon与靶rna分子至少错配一次。然而，在优选的方面，aon和靶rna之间存在一个或多个额外的错配核苷酸、摆动和/或凸起。在靶腺苷位置处，这些应该通过细胞中存在的adar增加rna编辑效率。本领域技术人员可以确定在生理条件下杂交是否仍然发生。本发明的aon可以募集(接合)细胞中存在的哺乳动物adar酶，其中该adar酶包括其在野生型酶中发现的天然dsrna结合结构域。根据本发明的aon可以利用内源性细胞通路和天然可用的adar酶，或具有adar活性的酶(可能是尚未鉴定的adar样酶)，以特异性编辑靶rna序列中的靶腺苷。如本
文所公开，本发明的单链aon能够使靶rna分子中的特定靶例如腺苷脱氨基。理想地，至少一个靶核苷酸被脱氨基。另外可选地，1个、2个或3个进一步的核苷酸被脱氨基。将本发明的aon的特征综合起来，不需要修饰的重组adar表达，不需要连接到aon的偶联实体，或与靶rna序列不互补的长募集部分的存在。除此之外，本发明的aon确实允许靶rna分子中存在的靶核苷酸通过包括野生型酶中发现的天然dsrna结合结构域的天然核苷酸脱氨酶进行特异性脱氨基，而没有在rna/aon复合物的其它地方进行混杂编辑的风险。
35.本发明涉及一种aon，其能够与靶rna分子形成双链核酸复合物，其中双链核酸复合物能够募集adar酶，使靶rna分子中的至少一个靶腺苷脱氨基，其中aon中与至少一个靶腺苷直接相对的核苷酸是胞苷类似物，其在n3位点处充当h键供体。优选地，胞苷类似物是假异胞苷(pic)或本纳碱基z(dz)。这些胞苷类似物核苷酸可以是rna或dna形式，或可能在2’位置处经过修饰，如本文进一步概述。可以用于本发明的aon的其它优选的胞苷类似物为5-羟基c-h 、5-氨基c-h 和8-氧代a(syn)。也可用于根据本发明的寡核苷酸的其它胞苷类似物为假异胞苷(pic)、本纳碱基z(dz)、5-羟基c-h 、5-氨基c-h 和8-氧代a(syn)的衍生物，例如胞苷c5甲基、乙基、丙基等，具有硝基以外的取代基(例如烷基、f、cl、br、cn等)的本纳碱基z的变体和在c2处被取代(甲基、乙基、丙基、卤素等)的8-氧代a的变体。在一优选的方面，胞苷类似物不携带2
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ome或2
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moe核糖修饰。在另一优选的方面，根据本发明的aon包括至少一个硫代磷酸酯(ps)、膦酰基乙酸酯和/或甲基膦酸酯(mp)核苷酸间键合。在一优选的方面，双链核酸复合物可以募集内源性adar酶，优选地，其中adar酶是内源性adar2酶。在另一优选的方面，aon包括至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个核苷酸，并且长度为至多100个核苷酸，优选长度为至多60个核苷酸。
36.本发明还涉及一种药物组合物，其包括根据本发明的aon和药学上可接受的载体或稀释剂。这种药学上可接受的载体或稀释剂是本领域技术人员熟知的。
37.在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的aon或根据本发明的药物组合物，用于治疗或预防遗传性疾病，优选地选自：囊性纤维化、hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(a1at)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、cadasil综合征、charcot-marie-tooth病、慢性阻塞性肺病(copd)、远端脊髓性肌萎缩症(dsma)、duchenne/becker肌营养不良症、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、因子v leiden相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特氏综合征、亨廷顿氏舞蹈病、炎症性肠病(ibd)、遗传性多凝集反应综合征、leber先天性黑蒙、lesch-nyhan综合征、lynch综合征、马凡氏综合征、粘多糖贮积症、肌营养不良症、i型和ii型肌强直性营养不良症、神经纤维瘤病、a、b和c型尼曼-匹克病、ny-eso1相关癌症、peutz-jeghers综合征、苯丙酮尿症、pompe病、原发性纤毛病、凝血酶原突变相关疾病例如凝血酶原g20210a突变、肺动脉高压症、(常染色体显性)色素性视网膜炎、sandhoff病、严重联合免疫缺陷综合征(scid)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌萎缩症、stargardt病、泰-萨二氏病、usher综合征(例如i型、ii型和iii型usher综合征)、x染色体连锁免疫缺陷病、sturge-weber综合征和癌症。
38.在另一实施方式中，本发明涉及一种使细胞内靶rna分子中存在的靶腺苷脱氨基的方法，该方法包括以下步骤：为细胞提供根据本发明的aon或根据本发明的药物组合物；
允许aon与靶rna分子退火以形成能够在细胞内募集内源性adar酶的双链核酸复合物；允许adar酶使靶rna分子中的靶腺苷脱氨基；以及任选地鉴定靶rna分子中脱氨基的腺苷的存在。鉴定脱氨基的腺苷存在的任选步骤通过以下进行：对靶rna分子的区域进行测序，其中该区域包括脱氨基的靶腺苷；当靶腺苷位于uga或uag终止密码子中时，评估功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；当两个靶腺苷位于uaa终止密码子中时，评估功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；当靶rna分子是前体mrna时，评估前体mrna的剪接是否通过脱氨基而改变；或使用功能性读出，其中脱氨基后的靶rna分子编码功能性、全长、延长的和/或野生型蛋白质。
39.在又一实施方式中，本发明涉及一种使靶rna分子中存在的至少一个靶腺苷脱氨基的方法，该方法包括以下步骤：提供根据本发明的aon；允许aon与靶rna分子退火以形成双链核酸复合物；允许哺乳动物adar酶使靶rna分子中的靶腺苷脱氨基；以及任选地鉴定靶rna分子中脱氨基的腺苷的存在。
40.双链aon/靶rna分子复合物通过watson-crick碱基配对相互作用。根据本领域可用的教导，技术人员能够确定实现rna编辑的能力水平，并将其与缺乏特定糖和/或键合修饰指定位置的aon进行比较。在另一优选的方面，本发明的aon还包括在核糖的2’位置处包括取代的一个或多个核苷酸，其中取代选自：-oh；-f；-取代或未取代、直链或支链低级(c1-c10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，它们可被一个或多个杂原子间断；-o-、s-或n-烷基；-o-、s-或n-烯基；-o-、s-或n-炔基；-o-、s-或n-烯丙基；-o-烷基-o-烷基；-甲氧基；-氨基丙氧基；-甲氧基乙氧基(2
’‑
moe)；-二甲氨基氧乙氧基；和-二甲氨基乙氧基乙氧基。
41.aon中与靶核苷酸直接相对的核苷酸在本文中定义为“孤儿核苷酸”。在优选的实施方式中，本发明的aon包括至少一个包括2
’‑
ome或2
’‑
moe核糖修饰的核苷酸，并且孤儿核苷酸不携带2
’‑
ome或2
’‑
moe核糖修饰。
42.本发明的aon的长度优选为至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个核苷酸。aon的长度可以取决于存在的结构而变化(发夹结构的aon通常更长，但不存在发夹结构时，aon可以相对“短”，优选包括15个至25个核苷酸)。本发明的aon并非必要地携带募集部分(茎环结构)来吸引adar，但也不排除它。在任何情况下，如本文所述的胞苷类似物可以应用于多种不同的rna编辑aon。此外，优选地，aon短于100个核苷酸，更优选地短于60个核苷酸。
43.在另一实施方式中，本发明涉及根据本发明的aon在制备用于治疗遗传性疾病的药物中的用途，遗传性疾病优选地选自：囊性纤维化、hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(a1at)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、cadasil综合征、charcot-marie-tooth病、慢性阻塞性肺病(copd)、远端脊髓性肌萎缩症(dsma)、duchenne/becker肌营养不良症、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、因子v leiden相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特氏综合征、亨廷顿氏舞蹈病、炎症性肠病(ibd)、遗传性多凝集反应综合征、leber先天性黑蒙、lesch-nyhan综合征、lynch综合征、马凡氏综合征、粘多糖贮积症、肌营养不良症、i型和ii型肌强直性营养不良症、神经纤维瘤病、a、b和c型尼曼-匹克病、ny-eso1相关癌症、peutz-jeghers综合征、苯丙酮尿症、pompe
氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、g-clamp、super a、super t、super g、氨基修饰的碱基或其衍生物；和简并或通用碱基，如2,6-二氟甲苯，或不存在如无碱基位点(例如1-脱氧核糖、1,2-双脱氧核糖、1-脱氧-2-o-甲基核糖、氮杂核糖)。如本文所用，术语“腺嘌呤”、“鸟嘌呤”、“胞嘧啶”、“胸腺嘧啶”、“尿嘧啶”和“次黄嘌呤”是指碱基本身。术语“腺苷”、“鸟苷”、“胞苷”、“胸苷”、“尿苷”和“肌苷”是指与(脱氧)核糖基糖连接的碱基。
49.本发明的寡核苷酸可以包括一个或多个携带2
’‑
o-甲氧基乙基(2
’‑
moe)核糖修饰的核苷酸。此外，aon优选包括一个或多个不携带2
’‑
moe核糖修饰的核苷酸，并且其中2
’‑
moe核糖修饰位于不阻止具有核苷酸脱氨酶活性的酶使靶核苷酸脱氨基的位置。在另一优选的方面，aon在不包括2
’‑
moe核糖修饰的位置处包括2
’‑
o-甲基(2
’‑
ome)核糖修饰，和/或其中寡核苷酸在不包括2
’‑
moe核糖修饰的位置处包括脱氧核苷酸。aon可以包括一个或多个在2’位包括2
’‑
moe、2
’‑
ome、2
’‑
oh、2
’‑
脱氧、2
’‑
f或2
’‑4’‑
键合(即锁核酸或lna)的核苷酸。2
’‑4’
键合可以选自本领域已知的接头，例如亚甲基接头或受限乙基接头。不同的2’修饰在wo2016/097212、wo2017/220751、wo2018/041973、wo2018/134301、wo2019/219581和wo2019/158475中进一步详细讨论。在所有情况下，修饰应与编辑兼容，以便寡核苷酸履行其作为编辑寡核苷酸的作用。当一个位置包括una核糖修饰时，该位置可以具有包括上述相同修饰的2’位，即2
’‑
moe、2
’‑
ome、2
’‑
oh、2
’‑
脱氧、2
’‑
f或2
’‑4’‑
键合(即锁核酸或lna)。同样，在所有情况下，修饰应与编辑兼容，以便寡核苷酸履行其作为编辑寡核苷酸的作用。在本发明的所有方面，具有核苷酸脱氨酶活性的酶优选为adar1或adar2。在高度优选的实施方式中，aon是靶向前体mrna或mrna的rna编辑寡核苷酸，其中靶核苷酸是靶rna中的腺苷，其中腺苷脱氨基为肌苷，其通过翻译机制读取为鸟苷。在进一步优选的实施方式中，腺苷位于uga或uag终止密码子中，其被编辑为ugg密码子；或者其中两个靶核苷酸是uaa终止密码子中的两个腺苷，该密码子通过两个靶腺苷的脱氨基被编辑成ugg密码子，其中寡核苷酸中的两个核苷酸与靶核酸错配。本发明还涉及包括本文表征的aon和药学上可接受的载体的药物组合物。
50.术语“胞苷类似物”是指在n3处充当h键供体以与adar2相互作用的任何碱基。这样的胞苷类似物的非限制性实例是假异胞苷(pic)、本纳z(dz)、5-羟基c-h 、5-氨基c-h 和8-氧代a(syn)。技术人员将认识到，基于本公开，在n3处充当h-键供体以与hadar2相互作用并且允许靶腺苷脱氨基的任何碱基都在如本文所用的胞苷类似物的定义内。术语“核苷”是指与(脱氧)核糖基糖连接的碱基，没有磷酸基团。“核苷酸”由核苷和一个或多个磷酸基团组成。因此，术语“核苷酸”是指相应的碱基-(脱氧)核糖基-磷酸接头，以及核糖部分或磷酸基团的任何化学修饰。因此，该术语将包括以下：包括锁定核糖基部分(包括2
’‑4’
桥，包括亚甲基或任何其它基团)的核苷酸、未锁定核酸(una)、包括接头的核苷酸，接头包括磷酸二酯、膦酰基乙酸酯、磷酸三酯、ps、(二)硫代磷酸酯、mp、氨基磷酸酯接头等。有时，术语腺苷和腺嘌呤、鸟苷和鸟嘌呤、胞苷和胞嘧啶、尿嘧啶和尿苷、胸腺嘧啶和胸苷/尿苷、肌苷和次黄嘌呤可互换使用，在一方面指代相应的核碱基，在另一方面指代核苷或核苷酸。有时术语碱基、核苷和核苷酸可互换使用，除非上下文明确要求不同，例如当核苷与相邻核苷连接并且这些核苷之间的键合被修饰时。如上所述，核苷酸是核苷 一个或多个磷酸基团。术语“核糖核苷”和“脱氧核糖核苷”，或“核糖”和“脱氧核糖”如在本领域中所使用。除非上下文另有说明，每当提及“反义寡核苷酸”、“寡核苷酸”或“aon”时，均指寡核糖核苷酸和脱氧寡核糖
核苷酸。每当提及“寡核糖核苷酸”时，它可以包括碱基a、g、c、u或i。每当提及“脱氧寡核糖核苷酸”时，它可以包括碱基a、g、c、t或i。
51.在优选的方面，本发明的aon是包括化学修饰的寡核糖核苷酸并且可以在某些特定位置包括脱氧核苷酸(dna)。术语例如寡核苷酸、寡聚(oligo)、on、寡核苷酸组合物、反义寡核苷酸、aon、(rna)编辑寡核苷酸、eon和rna(反义)寡核苷酸在本文中可以互换使用。每当提及寡核苷酸构建体中的核苷酸时，包括例如胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶和β-d-葡萄糖基-5-羟基-甲基胞嘧啶；当提及腺嘌呤时，包括n6-甲基腺嘌呤和7-甲基腺嘌呤；当提及尿嘧啶时，包括二氢尿嘧啶、4-硫尿嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶；当提及鸟嘌呤时，包括1-甲基鸟嘌呤。每当提及核苷或核苷酸时，都包括呋喃核糖衍生物，例如2
’‑
脱氧、2
’‑
羟基和2
’‑
o-取代的变体，例如2
’‑
o-甲基，以及其它修饰，包括2
’‑4’
桥接变体。每当提及寡核苷酸时，两个单核苷酸之间的键合可以是磷酸二酯键合及其修饰，包括膦酰基乙酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、ps、(二)硫代磷酸酯、mp、氨基磷酸酯(phosphoramidate)接头等。
52.术语“包括”包括“包括/含有”和“由
……
组成”，例如“包括x”的组合物可以仅由x组成，也可以包括一些额外的成分，例如x y。与数值x相关的术语“约”是任选的，并且指，例如x
±
10％。“基本上”一词并不排除“完全
””
，例如“基本上不含y”的组合物可以完全不含y。在相关的情况下，本发明的定义中可以省略“基本上”一词。
53.如本文所用，术语“互补”是指aon在生理条件下与靶序列杂交的事实。该术语并不意味着aon中的每个核苷酸都与靶序列中的相对核苷酸完美配对。换句话说，虽然aon可以与靶序列互补，但aon和靶序列之间可以存在错配、摆动和/或凸起，而在生理条件下，aon仍与靶序列杂交，使得细胞rna编辑酶可以编辑靶腺苷。因此，术语“基本上互补”还指尽管存在错配、摆动和/或凸起，但aon仍在aon和靶序列之间具有足够的匹配核苷酸，从而在生理条件下aon与靶rna杂交。如本文所示，如果在生理条件下aon能够与其靶标杂交，则aon可以是互补的，但也可以包括一个或多个与靶序列的错配、摆动和/或凸起。
54.与核酸序列相关的术语“下游”是指进一步沿3’方向的序列；“上游”一词的意思正好相反。因此，在任何编码多肽的序列中，起始密码子在有义链中位于终止密码子的上游，但在反义链中位于终止密码子的下游。
55.提及“杂交”通常是指特异性杂交，不包括非特异性杂交。特异性杂交可以在选择的实验条件下发生，使用本领域熟知的技术，以确保探针和靶标之间的大部分稳定相互作用为其中探针和靶标具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的序列同一性。本文使用的术语“错配”指双链rna复合物中的相对核苷酸不形成根据watson-crick碱基配对规则的完美的碱基对。错配的核苷酸为g-a、c-a、u-c、a-a、g-g、c-c、u-u对。在一些实施方式中，本发明的aon包括少于四个错配，例如0个、1个或2个错配。摆动碱基对是：g-u、i-u、i-a和i-c碱基对。
56.术语“剪接突变”涉及编码前体mrna的基因中的突变，其中剪接机制功能失调，在某种意义上说从外显子剪接内含子受到干扰，并且由于异常剪接，随后的翻译超出框架，导致编码的蛋白质提前终止。如本文所讨论，这种缩短的蛋白质通常会迅速降解并且不具有任何功能活性。确切的突变不一定是rna编辑的靶标；剪接突变中相邻或附近的腺苷可以是靶核苷酸，其转换为i将剪接突变修复回正常状态。技术人员知晓在对剪接突变位点或区域内的腺苷进行rna编辑之后确定是否恢复正常剪接的方法。
57.根据本发明的aon可以几乎全部进行化学修饰，例如通过提供具有2
’‑
o-甲基化糖部分(2
’‑
ome)和/或具有2
’‑
o-甲氧基乙基糖部分的核苷酸(2
’‑
moe)。然而，孤儿核苷酸是胞苷类似物并且优选不包括2
’‑
ome或2
’‑
moe修饰，在又一个优选的方面，与靶腺苷相对的每个核苷酸侧翼的至少一个相邻的核苷酸不包括2
’‑
ome修饰，在优选的方面，与靶腺苷相对的每个核苷酸侧翼的两个相邻的核苷酸均不包括2
’‑
ome修饰。就rna编辑而言(本领域已知)，其中aon的所有核苷酸都具有2
’‑
ome修饰的完全修饰导致无功能的寡核苷酸，推测是因为它阻碍了靶位置的adar活性。通常，通过提供具有2
’‑
ome基团的相对核苷酸，或通过提供鸟嘌呤或腺嘌呤作为相对碱基，可以保护靶rna中的腺苷免于编辑，因为这两种碱基也能够减少对相对腺苷的编辑。根据本发明，可以容易地使用在寡核苷酸领域中已知的各种化学和修饰。核苷酸之间的常规核苷间键合可以通过磷酸二酯键的单硫代化或二硫代化而改变，分别产生硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。可以有核苷间键合的其它修饰，包括酰胺化和肽接头。在优选的方面，本发明的aon包括15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个或60个核苷酸。
58.本领域已知，rna编辑实体(例如人adar酶)根据多种因素以不同的特异性编辑dsrna结构。一个重要因素是构成dsrna序列的两条链的互补程度。两条链的完美互补通常会导致hadar的催化结构域以非歧视性方式使腺苷脱氨基，或多或少地与其遇到的任何腺苷发生反应。hadar1和2的特异性可以通过引入化学修饰和/或确保dsrna中的一些错配来增加，这推测有助于以尚未明确定义的方式定位dsrna结合结构域。此外，脱氨基反应本身可以通过提供包括与待编辑腺苷相对的错配的aon来增强。通过提供具有与待编辑腺苷相对的胞苷类似物的靶向部分来产生本文公开的错配。按照本技术中的说明，本领域技术人员将能够根据其需求设计寡核苷酸的互补部分。
59.与本发明的aon一起使用的最感兴趣的存在于细胞中的rna编辑蛋白质是人adar2。本领域普通技术人员将会理解，细胞内的编辑实体重定向到其它靶位点的程度可以通过改变根据本发明的aon对编辑分子的识别结构域的亲和力来调节。确切的修饰可以通过一些试错法和/或通过基于aon和编辑分子识别结构域之间的结构相互作用的计算方法来确定。此外，或另外可选地，可以通过aon的给药和给药方案来调节驻留在细胞中的编辑实体的募集和重定向程度。这是由实验者(体外)或临床医生决定的，通常在i和/或ii期临床试验中。
60.本发明涉及真核细胞、优选后生动物、更优选哺乳动物、最优选人细胞中的靶rna序列的修饰。本发明可以用于来自任何器官的细胞，例如皮肤、肺、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、肠道、肌肉、腺体、眼、大脑、血液等。本发明特别适用于修饰与(人)受试者的疾病状态相关的细胞、组织或器官中的序列。细胞可以位于体外、离体或体内。本发明的一个优点是它可以用于活生物体中的原位细胞，但它也可以用于培养中的细胞。在一些实施方式中，细胞进行离体处理，然后被引入到活生物体中(例如，再引入到它们最初源自的生物体中)。本发明还可以用于在所谓的类器官(organoid)内编辑细胞中的靶rna序列。可以认为类器官是体外衍生的三维组织，但使用特定条件则驱动生成单独的、分离的组织(例如，参见lancaster&knoblich,science 2014,vol.345no.6194 1247125)。在治疗环境中，它们很有
用，因为它们可以从患者的细胞中在体外获得，然后可以将类器官作为自体材料重新引入患者体内，比起常规的移植物，所述自体材料被排斥的可能性更小。待治疗的细胞通常具有基因突变。突变可以是杂合的或纯合的。本发明通常用于修饰点突变，例如n到a的突变，其中n可以是g、c、u(在dna水平的t)，优选g到a的突变，或n到c的突变，其中n可以是a、g、u(在dna水平的t)，优选u到c的突变。
61.不希望受理论束缚，据信通过hadar2的rna编辑发生在细胞核中的初级转录物上、转录或剪接过程中或细胞质中，其中例如可以编辑成熟mrna、mirna或ncrna。
62.许多遗传性疾病由g到a突变引起，这些是首选的靶疾病，因为突变的靶腺苷上的腺苷脱氨基将会使突变逆转成密码子，从而产生功能性、全长和/或野生型蛋白质，尤其是当它涉及ptc时。可以用根据本发明的寡核苷酸预防和/或治疗的遗传性疾病的优选实例是其中靶rna中一种或多种腺苷的修饰将带来(潜在)有益变化的任何疾病。特别优选的是usher综合征和cf，更具体地说，优选cftr rna中诱导疾病的ptc中腺苷的rna编辑。cf突变领域的技术人员认识到，在cftr基因中已知1000至2000个突变，包括g542x、w1282x、r553x、r1162x、y122x、w1089x、w846x、w401x、621 1g》t或1717-1g》a。
63.应当清楚，根据本发明的靶向编辑可以应用于任何腺苷，无论它是给定序列中的突变核苷酸还是野生型核苷酸。例如，编辑可以用于产生具有不同特性的rna序列。这些特性可以是编码特性(产生具有不同序列或长度的蛋白质，导致蛋白质特性或功能改变)或结合特性(导致rna本身或靶标或结合配偶体的抑制或过度表达；整个表达途径可以通过在靶rna上重新编码mirna或其同源序列而改变)。蛋白质功能或定位可以通过功能结构域或识别基序而随意改变，包括但不限于信号序列、靶向或定位信号、蛋白水解切割或共翻译或翻译后修饰的识别位点、酶的催化位点、结合配偶体的结合位点、降解或激活的信号等。这些和其它形式的rna和蛋白质“改造(engineering)”，无论是否预防、延迟或治疗疾病或用于任何其它目的，在医学或生物技术中，作为诊断、预防、治疗、研究工具或其它，均涵盖于本发明中。
64.待施用的aon的量、剂量和剂量方案(dosing regimen)可以根据细胞类型到细胞类型、待治疗的疾病、靶群体、给药模式(例如全身与局部相比)、疾病的严重程度和可接受的副作用水平而不同，但是在体外研究、临床前和临床试验中，这些可以并且应该通过试错法来评估。当修饰的序列导致易于检测的表型变化时，这些试验特别明确。可能较高剂量的aon可以竞争结合细胞内adar，从而消耗可以自由参与rna编辑的实体的量，但常规剂量试验将会揭示任何给定aon和给定靶标的这种效应。
65.一种合适的试验技术涉及将aon递送至细胞系或测试生物体，然后在其后的不同时间点取活检样本。可以在活检样本中评估靶rna的序列，随后可以容易地评估具有修饰的细胞的比例。在已进行一次该试验之后，则可以保留知识，并且可以在无需采取活检样本的情况下进行将来的递送。因此，本发明的方法可以包括鉴定细胞的靶rna序列中所需变化的存在的步骤，从而验证靶rna序列已经被修饰。该步骤通常涉及靶rna或其cdna拷贝(或在靶rna是前体mrna的情况下，其剪接产物的cdna拷贝)的相关部分的测序，如上所述，由此可以容易地验证序列变化。另外可选地，该变化可以在蛋白质水平上(长度、糖基化、功能等)或通过某些功能的读出(read-out)例如(诱导型)电流(例如由靶rna编码的蛋白质是离子通道时)来进行评估
60(230-400目)硅胶上进行。1h、
13
c和
31
p nmr在bruker 400mhz nmr上进行。pic构建单元的中间体：
75.i)6-n-(二甲基甲脒基)假异胞苷；
76.ii)5
’‑
o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-6-n-(二甲基甲脒基)假异胞苷；
77.iii)2
’‑
o-(叔丁基)二甲基甲硅烷基-5
’‑
o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-6n(二甲基甲脒基)假异胞苷；和
78.iv)3-[2
’‑
o-(叔丁基)二甲基甲硅烷基-3
’‑
o-(2-氰基乙基-n,n-二异丙基膦)-5
’‑
o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-β-d-呋喃核糖基]-6-n-(二甲基甲脒基)假异胞苷
[0079]
均根据文献步骤，使用本领域技术人员已知的方法合成。
[0080]
使用本领域技术人员已知的方法产生含有pic胞苷类似物的aon。图例中给出了aon的修饰。含有dz胞苷类似物的aon可以根据本领域技术人员已知的方法制造。该aon含有与含有pic的aon相同的修饰。
[0081]
实施例2：对作为rna编辑反义寡核苷酸中的孤儿核苷酸的正常胞苷(c)和假异胞苷(pic)进行比较的动力学adar分析。
[0082]
施用蒸馏去离子水用于所有水性反应和稀释。本纳碱基z购自firebird biomolecular sciences llc，作为脱氧核糖核苷亚磷酰胺。分子生物学级牛血清白蛋白(bsa)和rnase抑制剂购自new england biolabs。sds-聚丙烯酰胺凝胶用molecular dynamics 9400typhon磷光成像仪观察。数据用molecular dynamics imagequant 5.2软件分析。所有maldi分析均在加州大学戴维斯分校质谱设施中使用bruker ultraflextreme maldi tof/tof质谱仪进行。寡核苷酸质量用mongo oligo calculator v2.08测定。除非另有说明，未修饰的寡核苷酸购自dharmacon或integrated dna technologies。
[0083]
对含有胞苷类似物的aon的rna化学合成在犹他大学使用abi394合成仪进行。核苷在适当的循环期间引入。aon的序列是5
’‑
uuu gag acc ucu guc c*ag agu ugu ucu cc-3’(seq id no:1，c*是pic或dz，在图5中显示为n)。单链aon通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，并通过uv阴影进行可视化。从凝胶上切下条带，压碎并在4℃下在0.5m naoac、0.1％十二烷基硫酸钠(sds)和0.1mm edta中浸泡过夜。聚丙烯酰胺片段用0.2μm滤器去除，在-70℃下将rna从75％etoh溶液中沉淀4小时。将溶液以13,000rpm的速度离心20分钟，移除上清液。将rna溶液冻干，重新悬浮在无核酸酶的水中，并通过260nm处的吸光度进行定量。寡核苷酸质量通过maldi tof确认。将纯化的顶部和底部链以10:1的比例添加到杂交缓冲液(180nm编辑链、1.8μm引导链、1x te缓冲液、100mm nacl)中，加热至95℃5分钟，然后缓慢冷却至室温。
[0084]
野生型hadar2得以表达，并且如前所述(matthews等.2016；macbeth and bass.methods enzymol.2007.15(424):319-331)。hadar2的纯化通过在含有20mm tris-hcl，ph 8.0、5％甘油、1mm 2-巯基乙醇、750mm nacl、35mm咪唑和0.01％nonidet p-40的缓冲液中使用法式压滤器裂解细胞来进行。细胞裂解物通过离心(19,000rpm 1小时)澄清。裂解液通过3ml ni-nta柱，然后用20ml裂解缓冲液、洗涤i缓冲液(20nm tris-hcl，ph 8.0，5％甘油，1mm 2-巯基乙醇，750mm nacl，35mm咪唑，0.01％nonidet p-40)、洗涤ii缓冲液(20mm tris-hcl，ph 8.0，5％甘油，1mm 2-巯基乙醇，35mm咪唑，500mm nacl)在三步中洗涤，并用20mm tris-hcl，ph 8.0，5％甘油、1mm 2-巯基乙醇、400mm咪唑、100mm nacl洗脱。
将含有靶蛋白质的级分合并，并浓缩至30-80μm，用于生化分析。蛋白质浓度使用通过sds-聚丙烯酰胺凝胶的sypro橙色染色而可视化的bsa标准品确定。在-70℃下将纯化的hadar2 wt储存在20mm tris-hcl ph 8.0、100mm nacl、20％甘油和1mm 2-巯基乙醇中。
[0085]
使用megascript t7试剂盒(thermofisher)从dna模板转录靶rna。dna消化使用rq1 rnase-free dnase(promega)进行。如上所述纯化经dna酶处理的rna产物。
[0086]
dna模板序列：
[0087][0088]
斜体区域代表t7启动子，粗体大a代表靶腺苷，ggatcc是限制性位点(bamhi)，下划线区域代表靶序列，如图5所示。
[0089]
rt-pcr的引物是“靶fwd”：5
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gct cct ccc atc ctg tgg gct gaa cag t-3’(seq id no:4)和“靶rvs”：5
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cgg ggt gtg cgt ggg tgt cat cac t-3’(seq id no:5)。
[0090]
脱氨基分析在15mm tris-hcl ph 7.5、3％甘油、60mm kcl、1.5mm edta、0.003％nonidet p-40、3mm mgcl2、160u/ml rnasin、1.0μg/ml、0.8nm rna和2nm adar2 wt酶的单周转条件下进行。每个反应溶液在加入酶之前在30℃下孵育30分钟，并允许在30℃下孵育不同时间，然后用190μl 95℃水停止并在95℃下加热5分钟。施用rt-pcr(promega access rt-pcr system)从脱氨基的rna产生cdna。
[0091]
所得cdna使用zymo的dna clean&concentrator试剂盒纯化，并在加州大学戴维斯分校dna测序设施中使用abi prism 3730遗传分析仪用正向pcr引物进行sanger测序。测序峰高在4peaks v1.8中定量。每个实验一式三份进行。从每个数据点中减去相应零时间点的编辑水平作为背景扣除。
[0092]
动力学分析的结果如图6所示，清楚地表明胞苷类似物pic在存在于aon的孤儿碱基位置处时，可以提高靶a的编辑速率。
[0093]
实施例3：对作为rna编辑反义寡核苷酸中的孤儿核苷酸的正常胞苷(脱氧-c；dc)和本纳碱基z(dz)进行比较的动力学adar分析。
[0094]
使用携带本纳碱基z(dz)作为与靶腺苷相对的胞苷类似物的aon进行相同的实验，与不携带这种胞苷类似物的aon(脱氧-c或dc，不同于前面实施例中的c)进行比较。该动力学分析的结果显示在图7中，表明pic和dz之间的脱氨基速率相当(另请参见图6；具有胞苷类似物的两个aon显示出比该位置处没有胞苷类似物的aon高2倍的速率)，尽管携带dz的aon的终点比用dc发现的多少要低一些。提高速率的重要性在于，在细胞中，寡核苷酸(和adar)必须与许多不同的rna加工因子(如剪接因子)竞争，因此更快的速率可以证明对于确保脱氨基反应可以在竞争因子有机会将aon和adar从rna中去除之前进行来说至关重要。
[0095]
实施例4：对作为rna编辑反义寡核苷酸中的孤儿核苷酸的正常胞苷(脱氧-c；dc)与本纳碱基z(dz)和脱氧假异胞苷(dpic)进行比较的动力学adar分析。
[0096]
使用携带本纳碱基z(dz)或脱氧假异胞苷(dpic)作为与靶腺苷相对的胞苷类似物的aon进行与上述相同的实验，与不携带这种胞苷类似物(脱氧-c；在此为dc)的aon进行比较。该动力学分析的结果如图8所示，表明与dc相比，dz和dpic的终点更高。需要注意的是，对于该实验合成的aon与之前的实施例不同。重要的是，携带dz作为孤儿核苷酸的aon具有比dc更快的动力学，这在图7中也可见。此外，携带dpic作为孤儿核苷酸的aon具有比携带dc作为与靶腺苷相对的孤儿核苷酸的aon更快的动力学。
[0097]
实施例5：在转染携带dc和dz作为孤儿核苷酸的aon后，确定细胞中的rna编辑。
[0098]
发明人接下来使用内源性adar研究了在细胞中含有胞苷类似物本纳碱基z(dz)作为孤儿核苷酸的aon在rna编辑方面是否也比携带脱氧-c(dc)的相同aon更有效。如上所述，测试小鼠idua mrna中相同腺苷的特定编辑。图9中给出靶序列和互补靶向aon(比图5中的略长)。
[0099]
所选择的细胞是源自在idua基因中携带g到a突变的小鼠品系的原代小鼠肝成纤维细胞，该突变导致提前终止密码子(w392x)的形成。转染前24小时，接种300,000个细胞。根据制造商的说明(以2μl lipofectamine 2000与1μg aon的比例)，使用100nm aon和lipofectamine 2000(invitrogen)转染aon。转染48小时后，使用direct-zol rna miniprep(zymo research)试剂盒根据制造商的说明提取rna。使用maxima逆转录酶试剂盒20(thermo fisher)根据制造商的说明，结合随机六聚体和寡聚-dt引物制备cdna。将cdna稀释3倍，并将1μl该稀释液用作数字液滴pcr(ddpcr)的模板，总输入量为5ng rna。
[0100]
使用biorad的qx-200droplet digital pcr系统进行用于核酸靶序列绝对定量的ddpcr测定。从rt cdna合成反应中获得的1μl稀释cdna用于20μl反应混合物的总混合物，包括用于探针的ddpcr supermix、dutp(bio rad)，和taqman snp基因型测定使用结合以下基因特异性探针的正向和反向引物：正向引物：5
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ctc acagtc atg ggg ctc-3’(seq id no:8，反向引物：5
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cac tgt atg att gct gtc caa c-3’(seq id no:9)，野生型探针(fam nfq标记)：5
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aga aca act ctg ggc aga ggt ctc a-3’(seq id no:10)，和突变探针(hex nfq标记)：5
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aga aca act cta ggc aga ggt ctc a-3’(seq id no:11)。将包括cdna的20μl pcr混合物填充在ddpcrcartridge(biorad)的中间行中。复制物被分成两个cartridge。底部行填充有70μl用于探针的液滴生成油(biorad)。在qx200液滴发生器中生成液滴。将40μl油乳液从cartridge顶行转移到96孔pcr板。pcr 20板用锡箔密封，并使用px1板密封器在170℃下保持4秒，然后执行以下pcr程序：1个循环在95℃下10分钟，40个循环在95℃下保持30秒、63.8℃下1分钟、98℃下10分钟，然后在8℃下储存。用qx200液滴读数器读取和分析板。
[0101]
结果在图10中给出，并证明与相同的aon(唯一的区别是在靶腺苷相对处携带脱氧胞苷(dc))相比，在靶腺苷相对处携带本纳碱基z(dz)的aon具有显著更高的rna编辑百分比。
[0102]
这些结果表明，发明人还能够显示，当aon中与靶腺苷直接相对的核苷酸是在n3位点充当h-键供体的胞苷类似物时，原代小鼠成纤维细胞中rna编辑的效率提高。