用于猪基因编辑sgRNA筛选的体外细胞平台的制作方法

用于猪基因编辑sgrna筛选的体外细胞平台
技术领域
1.本发明属于基因编辑领域。具体涉及一种用于猪的crispr-cas9基因编辑用sgrna筛选的体外细胞平台。


背景技术：

2.猪在解剖学、生理病理学、营养代谢和疾病特征等方面都与人类相似度较高，基因编辑猪现已是疾病发生机制、病理毒理研究、治疗药物评估等众多领域所需的重要动物模型。
3.crispr-cas9基因编辑技术(有时也写作“crispr/cas9基因编辑技术”)，是目前最为主流的基因编辑技术。其基本原理是：通过sgrna(single guide rna)将具有核酸剪切功能的cas9蛋白带到需要编辑的基因组dna处，使cas9蛋白精确剪切dna。其中sgrna主要有2个子区域，一个子区域负责与cas9蛋白相结合，序列相对固定；另一个子区域负责通过碱基互补配对识别基因编辑靶序列，其序列取决于基因编辑靶序列。
4.在基因编辑实践中，尤其是针对猪等繁殖周期较长的大动物的基因编辑中，出于时间和资源成本的考虑，对设计得到的sgrna需要提前在体外进行筛选；用于筛选的物质和技术基础，即为sgrna筛选的体外细胞平台。
5.目前，对猪的基因编辑，尚无高效率的基因编辑sgrna筛选的体外细胞平台。


技术实现要素：

6.本发明要解决的问题是：提供一种高效率的基因编辑sgrna筛选的体外细胞平台。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种猪基因编辑sgrna筛选用细胞，所述细胞是稳定表达cas9基因的猪髋动脉内皮细胞piec、猪肾上皮细胞pk15、猪肾传代细胞ibrs-2或猪睾丸细胞st。
9.如前述的猪基因编辑sgrna筛选用细胞，其制备方法如下：
10.将携带cas9基因的慢病毒载体包装为慢病毒，将慢病毒转染猪髋动脉内皮细胞piec、猪肾上皮细胞pk15、猪肾传代细胞ibrs-2或猪睾丸细胞st即可。
11.如前述的猪基因编辑sgrna筛选用细胞，所述慢病毒载体为phblv-grna-cas9-puro。
12.一种数据平台，所述数据平台是储存有转录组、蛋白质组数据库的计算机；
13.所述转录组、蛋白质组数据库包括：猪髋动脉内皮细胞piec、猪肾上皮细胞pk15、猪肾传代细胞ibrs-2和猪睾丸细胞st这4种细胞以及权利要求1～3任一所述猪基因编辑sgrna筛选用细胞的转录组、蛋白质组数据。
14.一种用于猪基因编辑sgrna筛选的方法，包括如下步骤：
15.1)将候选靶序列合成双链，连接酶切位点，构建到sgrna骨架表达载体的多克隆位点中，得到重组载体；所述sgrna骨架表达载体携带荧光标记基因；
16.2)将重组载体转入权利要求1～3任一所述的猪基因编辑sgrna筛选用细胞；
17.3)流式细胞术筛选带有荧光信号的细胞，进行单克隆培养；
18.4)测序验证。
19.如前述的方法，步骤1)所述sgrna骨架表达载体是phblv-u6-mcs-cmv-zsgreen。
20.如前述的方法，步骤2)所述细胞的选择根据所要编辑的基因在权利要求4所述数据平台中查询到的表达水平决定：可选择基因表达水平相对较高的细胞。
21.如前述的方法，步骤3)所述单克隆培养是在细胞培养容器内表面印制纤连蛋白点阵列，再将带有荧光信号的细胞接种到培养容器内培养，最终得到肉眼可见细胞球；
22.所述纤连蛋白点阵列由4个以上面积225-400μm2的纤连蛋白印迹斑块构成。
23.如前述的方法，步骤2)和3)之间还包括：
24.提取带荧光细胞，提取dna，对靶基因进行pcr扩增，用t7核酸内切酶1酶切，电泳，观察条带分布，出现多条带的为编辑成功。
25.本发明的有益效果：
26.本发明的平台囊括了sgrna筛选的主要关键物质技术要素，包括要用到的细胞、数据平台、筛选方法。所述细胞可以提供crispr-cas9基因编辑必须的cas9蛋白稳定表达，为sgrna筛选提供坚实基础；所述数据平台可以提前帮助确定目的基因在细胞内的表达情况；所述筛选方法整体上可避免选错细胞造成的无效劳动，其中单克隆培养方法可高效将细胞单个分开，且通量高，效率远高于传统的极限稀释法。
27.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
28.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
29.图1：细胞生长状态图；a：piec细胞；b:piec-cas9细胞；c:pk15细胞；d:pk15-cas9细胞；e:st细胞；f：cst-cas9细胞；g：ibrs-2细胞；h：ibrs-2-cas9细胞；标尺＝100μm。
30.图2：cas9蛋白免疫组化；a：piec-cas9细胞ihc图；b：pk15-cas9细胞ihc图；c：ibrs-2-cas9细胞ihc图；d：st-cas9细胞ihc图：标尺＝50μm。
31.图3：cas9稳转猪细胞rna-seq分析结果；a，所有基因表达量的pearson相关系数热图；b，三种大小的fpkm对应基因数量的统计图。
32.图4：cas9稳转猪细胞蛋白表达热图。
33.图5：cas9稳转猪细胞基因、蛋白表达查询网站截图。
34.图6：fah对应sgrna表达质粒电转入piec-cas9细胞后的荧光检测图；a：靶向fah基因2号外显子sgrna质粒经电转24h后明视野(左)和荧光视野(右)的细胞；b：靶向fah基因3号外显子sgrna质粒经电转24h后明视野(左)和荧光视野(右)的细胞；c：靶向fah基因4号外显子sgrna质粒经电转24h后明视野(左)和荧光视野(右)的细胞；标尺＝100μm。
35.图7：rag2对应sgrna表达质粒电转入piec-cas9细胞后的荧光检测图；a：靶向rag2基因开放阅读框后的#1号sgrna质粒质粒经电转24h后明视野(左)和荧光视野(右)的细胞；b：靶向rag2基因开放阅读框后的#2号sgrna质粒质粒经电转24h后明视野(左)和荧光视野
(右)的细胞；c：a：靶向rag2基因开放阅读框后的#3号sgrna质粒质粒经电转24h后明视野(左)和荧光视野(右)的细胞；标尺＝100μm。
36.图8：t7核酸内切酶1切实验筛选高效sgrna；a：示fah-sgrna打靶效果；#1指靶向fah基因的2号外显子；#2指靶向fah基因的3号外显子；#3指靶向fah基因的4号外显子；b：示rag2-sgrna打靶效果；#1，#2，#3，分别代表靶向rag2基因李开放阅读框内的三条sgrna序列。m＝marker；wt＝wide type。
37.图9：本发明单细胞克隆培养原理示意图。
38.图10：单细胞克隆培养过程监测图；a：微阵列视野图；b：细胞种植后12h；c：细胞种植24h；d：细胞种植48h；e、f：细胞种植96h；g：经吹打分离得到的一个单细胞克隆球；标尺＝100μm。
39.图11：基因敲除的测序图。
具体实施方式
40.具体实施方式中，sgrna骨架表达载体phblv-u6-mcs-cmv-zsgreen；cas9表达质粒采用phblv-grna-cas9-puro，均为慢病毒载体。
41.实施例1 cas9稳定表达细胞的筛选
42.通常在crispr-cas9基因编辑操作中，需要将sgrna和cas9基因同时转入细胞。为了提高基因编辑sgrna筛选效率，本发明构建一种稳定表达cas9蛋白的细胞。
43.要判断cas9基因是否成功转入细胞且能稳定表达，首先需要通过筛选携带cas9基因的慢病毒载体上的标记基因。
44.用于cas9转化的phblv-grna-cas9-puro载体携带嘌呤霉素抗性基因。为了找到适用于嘌呤霉素筛选这种方式的猪的细胞，发明人将phblv-grna-cas9-puro载体包装为慢病毒，转入9种目的细胞[小香猪皮肤细胞(ssc-s2)，家猪皮肤细胞(ssc-s1)，小耳猪肾细胞(sepfk)，小耳猪肺细胞(sep-l1)，猪肾上皮细胞(pk15)，猪髋动脉内皮细胞(piec)，小型猪肾细胞(mpk)，猪睾丸细胞(st)，猪肾传代细胞(ibrs-2)]，检测其是否能在嘌呤霉素筛选下正常生长和增殖。
[0045]
经过慢病毒转染以及嘌呤霉素抗性筛选两个过程，仅piec，pk15，st，ibrs-2四种猪细胞可以承受实验所需周期。piec，pk15，st，ibrs-2四种猪细胞在转染慢病毒后，可以在有嘌呤霉素环境中连续7天正常生长，与未转染慢病毒的细胞在无嘌呤霉素环境中的生长状况无显著差别(图1)。
[0046]
而ssc-s2，sepfk，ssc-s1，sep-l1，mpk这5种细胞，在经过慢病毒转染以及加入嘌呤霉素筛选两个连续过程后，细胞基本不增殖，状态较差，死亡较多，无法承受抗性筛选，无法构建成cas9稳定表达细胞株。
[0047]
为进一步证实稳转细胞的cas9表达情况，利用免疫组化对稳转细胞进行验证，直观可见piec，pk15，st，ibrs-2四种细胞均高效表达cas9蛋白(图2)。
[0048]
因此，最终经过对常见猪细胞株的筛选实验，获得piec-cas9，pk15-cas9，st-cas9，ibrs-2-cas9四种猪cas9稳转细胞。
[0049]
实施例2 cas9稳转猪细胞rna-seq(rna测序)分析
[0050]
基于illumina测序平台，发明人对piec/pk15/ibrs-2/st四株细胞系以及对应的
cas9稳转细胞即piec-cas9/pk15-cas9/ibrs-2-cas9/st-cas9进行rna-seq测序，并且进行比较分析。为了反映样本间基因表达的相关性，本研究计算了每两个样品之间所有基因表达量的pearson相关系数，并将这些系数以热图的形式反映出来，如图3所示。从图3a可以看出piec与piec-cas9，pk15与pk15-cas9，ibrs-2与ibrs-2-cas9，st与st-cas9，呈现相关性最高，pearson相关系数均在0.9以上，而piec/pk15/ibrs-2/st四种细胞之间基因表达相关性则相对较低。
[0051]
为了更直观地展示每个样品在不同fpkm区间的基因数目，发明人对fpkm(fpkm《＝1、fpkm 1～10、fpkm》＝10)的三种情况进行了基因数目的统计，如图3b所示。表明不同细胞存在不同基因的表达量区别，说明利用细胞筛选靶向猪基因组的sgrna要根据基因表达情况，选定不同的猪细胞进行实验，更有益于筛选并验证出靶基因的sgrna打靶效果。同时，由于慢病毒是随机整合到细胞基因组，因此会无法避免的造成原有细胞基因组的微小改变，而引入cas9蛋白后，细胞基因表达量虽有所改变，但与对应的野生型细胞相比较仍然显示出最高的相关性。
[0052]
总之，rna-seq结果显示，cas9稳转细胞和野生型细胞的基因表达谱改变较小。本发明的piec-cas9/pk15-cas9/ibrs-2-cas9/st-cas9四种细胞接近猪细胞的原始状态，可以作为筛选猪的基因编辑sgrna。
[0053]
注：fpkm，全称：fragments per kilobase per million，fpkm是将比对到基因的片段(fragments)数除以比对到基因组的所有read数(以百万为单位)与rna的长度(以kb为单位)所得数值，可直观反映基因表达水平。
[0054]
实施例3猪cas9稳定表达细胞株蛋白质组定量分析
[0055]
运用lc-ms/ms质谱以及采用tmt标记定量技术结合生物信息学分析，对猪piec-cas9/pk15-cas9/ibrs-2-cas9/st-cas9稳转细胞进行蛋白质组定量分析，获得稳转细胞蛋白组表达情况。四株细胞鉴定到的蛋白总数为3824，由蛋白图谱部分热图可见四种cas9稳转细胞的蛋白表达差异(图4)。为方便流程化检索，发明人搭建了常见猪细胞系基因以及蛋白表达检索平台pigenediter。网页链接为：https://www.omicsolution.org/wukong/pigenediter/，网址页面局部如图5。
[0056]
利用该平台可以快速查询目的细胞基因/蛋白表达水平，综合二者表达情况，快速确定靶基因表达较高的cas9稳转猪细胞进行sgrna体外效率验证。
[0057]
实施例4猪fah和rag2基因敲除用sgrna筛选实例
[0058]
通过pigenediter检索平台，fah基因在piec-cas9细胞中fpkm为61.59，远高于其余cas9稳定表达细胞；rag2基因在piec-cas9细胞fpkm为0.03，高于其余cas9稳定表达细胞。因此，用于构建fah/rag2双基因敲除的细胞选定为piec-cas9。
[0059]
1.候选靶序列确认
[0060]
在fah和rag2基因外显子编码区寻找sgrna靶序列，原则如下：
[0061]
(1)序列通式为5'-n(20)ngg-3'，其中n(20)表示20个连续的碱基，其中每个n表示a或t或c或g，符合上述规则的靶序列位于正义链或反义链；
[0062]
(2)针对fah基因，选择基因fah的5个外显子编码区序列；
[0063]
(3)如果存在多种剪切体，则在共有外显子编码区进行选择。针对rag2基因，由于该基因没有明显的外显子和内含子之分。因此选择其开放阅读框之后的序列。
[0064]
(4)利用在线序列分析工具(http://crispr.mit.edu/)分析以上fah靶序列在猪基因组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的靶序列，根据评分进一步挑选，所挑选的靶序列在fah基因上是唯一的；同样的原则，利用在线序列分析工具(https://sg.idtdna.com/site/order/designtool/index/crispr_sequence)分析以上rag2靶序列在猪基因组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的靶序列，根据评分进一步挑选，所挑选的靶序列在rag2基因上是唯一的。
[0065]
对fah基因前5个外显子编码区序列进行sgrna设计，在选择sgrna时尽量选择其打靶序列唯一，即没有脱靶位点，并且软件评分较高的序列，经初步筛选汇总获得表1靶序列合集；针对rag2基因，由于该基因没有明显的外显子、内含子之分，选择其开放阅读框之后的序列进行sgrna设计，根据筛选原则汇总获得表2靶序列合集。
[0066]
表1.fah-sgrna靶序列合集
[0067]
[0068]
[0069][0070]
表2.rag2-sgrna靶序列合集
[0071]
[0072][0073]
(表1序列编号1～50的序列依次对应核苷酸序列表中的seq id no.1～50；表2序列编号1～40的序列依次对应核苷酸序列表中的seq id no.51～90)
[0074]
2.sgrna电转
[0075]
根据sgrna设计软件所示综合评分，以及结合打靶基因特性，选择3条fah-sgrna，分别打靶2号，3号，4号外显子序列；以及3条开放阅读框后的rag2-sgrna，随后通过细胞实验筛选出有效的靶向sgrna。
[0076]
将前述靶序列(除去末尾3个碱基，即pam序列ngg)合成双链，并接上酶切位点序列，分别构建到sgrna骨架表达载体phblv-u6-mcs-cmv-zsgreen的多克隆位点(mcs)中，通过电转进入cas9稳定表达的猪髋动脉内皮细胞(piec)，培养24h，显微镜下观察细胞生长状况，以及绿色荧光(图6，图7)。
[0077]
3.sgrna初步筛选
[0078]
流式细胞仪分选带有荧光的细胞，为候选阳性细胞。
[0079]
优选地，还要加上t7错配酶切实验。具体的：
[0080]
电转48h后，收集细胞，提取细胞dna基因组，分别对fah-sgrna以及rag2-sgrna靶序列进行pcr扩增，随后用t7核酸内切酶1剪切，再电泳。
[0081]
由图8a可见，靶向fah基因2号外显子以及靶向4号外显子的sgrna为t7核酸内切酶1切阳性，表明sgrna有效对靶序列基因片段进行切割，引入了突变。由图8b所示，#1号rag2-sgrna为t7核酸内切酶1切阳性，表明对靶基因片段进行了有效切割。
[0082]
根据t7核酸内切酶1切结果，以及sgrna选择原则，即选用比较靠前的外显子靶序
列。因此选择靶向fah基因2号外显子(表1中编号17的靶序列)的sgrna(简称sgrna-a)以及靶向rag2开放阅读框内的#1号靶序列(表2中编号1的靶序列)的sgrna(简称sgrna-b)作为基因编辑用sgrna。
[0083]
4.单克隆培养
[0084]
目前获得单克隆细胞的常用方法主要是极限稀释法，然而该方法获得的单克隆往往混有其他细胞，无法真正获得由一个细胞分化而来的细胞群。另外，即使通过极限稀释法或者流式细胞术将一个细胞分置到一个孔中进行培养，由于细胞生长条件的区别，在单个细胞的环境中，细胞往往也无法正常分裂增殖。
[0085]
区别于“极限稀释法”，本发明采用的是图案微阵列培养技术，具体包括如下步骤(图9为主要步骤的示意图)：
[0086]
(1)使用激光蚀刻特定图案硅片为模板，倒模获得聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)印章，制备出具有外凸矩形微阵列(单个矩形面积225-400μm2)的pdms印章。
[0087]
(2)将200μl浓度为100μg/ml的纤连蛋白(fibronectin,fn)溶液涂布于印章表面，室温孵育20分钟后洗去多余的溶液。
[0088]
(3)37℃孵箱中干燥，然后将装满50ml水的离心管倒置压在印章上，给予一定压力，使图案印压于细胞非贴附培养皿内底表面，待图案形成后移去印章。
[0089]
(4)图案干燥后，加入体积分数1％pluronic f-127室温孵育2小时，封闭剩余培养皿内底表面的空间。制作好的微阵列培养皿在使用前，先用pbs清洗3次，保证培养皿基底不能完全干燥，然后再接种细胞。
[0090]
(5)将经过流式分选带有荧光的1
×
103个细胞种植到微阵列培养皿中连续监测细胞生长。
[0091]
(6)种植第五天开始细胞球经过摇晃或移液枪轻轻吹打后自动成球脱落；将脱落的细胞球进行稀释，肉眼即可看见悬浮的细胞球；将单个细胞球吸出进行扩增培养，即快速获得单细胞克隆。
[0092]
培养基底表面微阵列显微视野如图10a所示。由图10b可见在固定位置上清晰可见单个细胞以及分裂增殖了的细胞正贴壁生长。在24h至48h内(图10c、d)，细胞开始由贴壁状态转为成三维球状生长，渐渐成约50μm的细胞球。在96h以后细胞球几乎不再继续增长，保持在约100μm的大小,个别细胞球开始松动，欲脱离原有位置(图10e、f)。图10g为经吹打分离得到的一个单细胞克隆球。
[0093]
5.测序验证
[0094]
本实施例随机将三个单细胞克隆球进行扩增培养后，进行测序分析，分别得到一个fah单基因纯合突变和一个rag2单基因纯合突变细胞株(图11)，以及一个杂合突变细胞株。
[0095]
结果说明，本发明的方法成功筛选得到了猪fah和rag2基因敲除用sgrna。
[0096]
综上，本发明的基因编辑sgrna筛选平台，能够快速、高效地实现sgrna的筛选，在基因编辑猪的应用中具有良好前景。