呼吸道合胞病毒(RSV)为肺病毒科(family Pneumoviridae)(正肺病毒属(genus Orthopneumovirus))的有包膜的反义单链RNA病毒。RSV具有双层脂质包膜，其中包埋糖蛋白，包括融合(F)糖蛋白和粘附(G)糖蛋白。RSV有两个亚型A和B，它们在粘附(G)糖蛋白的抗原的结构方面不同。该粘附(G)糖蛋白负责使病毒粒子特异性吸附到细胞表面上。在病毒进入到宿主细胞期间，融合(F)糖蛋白诱导病毒和细胞膜融合，以递送核衣壳到细胞质中。融合(F)糖蛋白进一步与硫酸乙酰肝素直接相互作用并且可以参与病毒与宿主细胞的附着。
融合(F)糖蛋白作为前体多肽F0合成并且在N端具有信号肽，所述信号肽用于将易位复合体转运到内质网的膜。在将氨基酸链馈送通过膜之后，C端处的疏水性序列实现F0蛋白在膜中的锚定且信号肽被裂解掉。此后，蛋白在其通过高尔基体(Golgi apparatus)转运期间糖基化。F0蛋白裂解为氨基端F2部分和F1蛋白也在高尔基体中发生。裂解位点位于碱性氨基酸的片段与疏水性结构域之间。在裂解之后，长度为约25个氨基酸的此疏水性结构域形成F1蛋白的N端且介导在吸收之后病毒与细胞膜的合并。F2蛋白质通过二硫桥键与F1蛋白保持连接。
在裂解之后，病毒粒子膜中的功能融合(F)糖蛋白保持亚稳定的融合前构象，可能直到病毒与宿主细胞膜结合为止。融合(F)糖蛋白随后经活化以起始一系列构象变化，使得发生融合。在融合之后，F呈现高度稳定的融合后构象。
RSV为在全世界传播的一种病原体。其导致呼吸道感染，尤其影响上呼吸道的粘膜以及气管和支气管的纤毛上皮。病毒复制发生在呼吸道粘膜的纤毛上皮细胞中。上皮细胞被由融合(F)糖蛋白引起的合胞体形成和身体自身免疫反应可逆地损坏。RSV感染可以通过接触感染(smear infection)或飞沫感染(droplet infection)传播。RSV的感染是高度传染性的；在一毫升的唾液中，存在至多106个感染性病毒粒子。潜伏期为约2到8天。呼吸道合胞病毒的感染可在从健康成人中的无症状病例到早产婴儿、免疫功能不全患者和老年人中的严重并发症的范围内变化。RSV为，尤其在婴儿和幼龄儿童中，急性下呼吸道感染所致的住院的主要起因。据估计，RSV相关的急性下呼吸道感染的数目为约3.3千万例/年，在5岁以下儿童中引起超过3百万例住院和59,600例院内死亡。
目前没有可用的针对RSV的有效抗病毒疗法。治疗主要涉及症状管理和支持性护理。吸入式皮质类固醇可能有助于减少RSV相关的细支气管炎症状。利巴韦林(Ribavirin)，一种阻断病毒复制的核苷类似物，在严重RSV感染病例中开处，但对RSV负荷的减少几乎或完全没有显著效果。此外，利巴韦林非常昂贵、在动物中具有致畸作用并且妊娠中不可服用(Ganz 2009)。
在预防RSV感染的情况下，帕利珠单抗(Palivizumab)(1998年授权)为用于预防RSV的第一种和唯一的市售产品。其为与RSV的融合(F)糖蛋白结合并且预防病毒感染宿主细胞的人源化单克隆抗体。帕利珠单抗专门用于包括早产婴儿和罹患慢性肺部疾病者在内的严重疾病风险高的人群的RSV感染的季节性免疫预防。帕利珠单抗由于其高费用(5kg婴儿五次剂量的帕利珠单抗花费大约$5600)和需要重复施用而在临床应用中具有局限性(IAN 1998；Homaira等人2014)。与医学领域中的大多数抗体一样，其生产是成本密集型且复杂的。因此，其仅可供用于工业化国家的高风险患者。迄今为止，RSV感染既不存在有效疫苗也不存在有效疗法。
尽管有自从RSV的发现开始进行的研究尝试，但尚未开发出低成本预防或治疗性方法。第一个使用福尔马林灭活的RSV(FI-RSV)的RSV疫苗临床试验结果令人失望，其造成呼吸道疾病加重而不是提供保护，这一结果减缓了RSV疫苗的开发(Kapikian等人1969)。开发针对RSV的有效疫苗或抗体的许多其它尝试未能在临床前或临床阶段提供保护。
因此，迄今为止，对具有成本效益的针对RSV的新颖临床抗病毒剂的医疗需求尚未得到满足。缺乏RSV感染的可靠治疗仍是世界范围内的显著问题。
所述问题通过以下解决：长度为25个氨基酸或更少的本发明的肽，其包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(SEQ ID No:1)，以及长度为25个氨基酸或更少的本发明的肽，其包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14(SEQ ID No:2)。所述问题进一步通过以下解决：包含核酸骨架和至少两个肽部分的本发明的纳米结构，其中所述至少两个肽部分中的每一个的序列独立地选自本发明的肽的序列，以及与其相关的药物组合物、核酸、方法和用途。
RSV的新颖的肽抑制剂展示体外和体内功效。已证实这些肽的鼻内递送使得感染小鼠中病毒负荷的显著减少。对于本发明的方法，选择中和表位()为目标并且使用计算方法设计RSV融合的数种肽抑制剂。所设计的肽特异性地与F蛋白的融合前构象的位点结合并且阻止其转变为融合后状态。在结合之后，F蛋白无法再执行其融合功能，并且因此可以阻断宿主细胞的RSV感染。
本发明新颖且高度选择性的短合成肽可以用作针对RSV感染的预防剂和/或治疗剂。肽可以单独使用或与靶向RSV的相同或不同蛋白的其它病毒抑制剂组合使用。为了增加结合功效，在一个实施例中，肽可以与本发明的核酸纳米结构，如DNA纳米结构缀合。那些纳米结构可以充当骨架材料，并且与常见抗体相比，结合位点(肽)的数目和其间的距离可以是可变的。由于RSV-F为三聚表面蛋白，故优选地选择三臂DNA纳米结构且用三条新RSV-F结合肽修饰，但其它配置也是可能的。由于DNA的持续长度(persistence length)可以是50nm，因此臂可以是刚性的。然而，中心接合点可以是柔性的并且随并入的未配对的碱基，例如3或5个额外胸腺嘧啶而改变。另外，所述肽与DNA的连接可以改进其溶解度和针对蛋白酶的稳定性。
本发明的肽可以充当到目前为止针对RSV的唯一可用来预防的单克隆抗体帕利珠单抗的具有成本效益的替代物。通过本发明的肽和本发明的纳米结构的预防提供了预防高风险群体中RSV感染的有吸引力的策略。
本发明的肽提供多种优点。肽的抗病毒作用机制涉及通过将RSV-F蛋白质固定于其亚稳定的融合前构象中而防止RSV与目标细胞膜融合，因此使其适合于RSV预防。此外，肽靶向RSV表面糖蛋白(F)减少了不合需要的副作用。此外，本发明的肽中的短肽序列提供比抗体或蛋白更简单且更便宜的生产机会。此外，肽比合成分子更安全并且毒性更低，并且肽在不同储存条件下比抗体更稳定。此外，在鼻内施用之后所展现的体内功效允许将肽直接非侵入性递送到作用部位。这将最小化副作用、减少所需剂量且使医院环境之外的应用成为可能。
另外，肽可以与其它抗病毒剂组合使用以实现协同作用。
在实例中，为了增强其抗病毒活性，将那些肽中的三条与三臂DNA结构缀合以实现多价结合。
本发明的肽展现有利的线性短序列并且展示抗RSV的特异性活性，同时仍允许多个位置的修饰，例如通过与核酸骨架结合和/或通过用非天然氨基酸替换氨基酸，从而保护其免于体内或体外降解。
确切地说，本发明的肽和纳米结构可用于抑制RSV进入哺乳动物细胞中。在一个优选实施例中，本发明的肽和纳米结构可用于在体外抑制RSV进入哺乳动物细胞中。在一个优选实施例中，本发明的肽和纳米结构可用于在体内抑制RSV进入哺乳动物细胞中。
此外，本发明的肽和纳米结构可用于抑制RSV扩散。在一个优选实施例中，本发明的肽和纳米结构可用于在体外抑制哺乳动物细胞中的RSV扩散。在一个优选实施例中，本发明的肽和纳米结构可用于在体内抑制哺乳动物中的RSV扩散。
在一个实施例中，本发明涉及一种长度为25个氨基酸或更少的肽，其包含序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(SEQ ID No:1)
其中
X1为Leu、Val或Ile或其非天然或天然类似物，
X2为Val或其非天然或天然类似物，
X3为Val或其非天然或天然类似物，
X4为天然或非天然氨基酸，
X5为天然或非天然氨基酸，
X6为天然或非天然氨基酸，
X7为Tyr或其非天然或天然类似物，
X8为Leu、Val或Ile或其非天然或天然类似物，
X9为Pro或其非天然或天然类似物，
X10为天然或非天然氨基酸，
X11为天然或非天然氨基酸，
X12为天然或非天然氨基酸，
X13为Asp或Glu或其非天然或天然类似物，
并且其中依据SEQ ID No:1所示的序列中的至少一个氨基酸不同于序列LVVSTTYLPHYFD(SEQ ID No:3)中在对应位置处的氨基酸，
或其肽模拟物或翻转-反向肽。
术语“肽”可以在最广泛意义上理解为通过肽键连接的氨基酸单体链。
术语“肽模拟物”可以在最广泛意义上理解为具有如肽的类似特性但通常具有更高(生物)稳定性的肽的任何模拟物。在本发明意义上的肽模拟物的实例为部分或完全基于β氨基酸部分、N-乙酰化氨基酸部分(例如N-甲基化氨基酸部分)和类肽(即，聚-N-取代的甘氨酸基部分)的所述分子结构。优选地，如果肽为肽模拟物，那么肽的所有氨基酸部分为一种类型的氨基酸类似物(例如，全部为β氨基酸部分、全部为N-乙酰化氨基酸部分或全部为N-取代的甘氨酸基部分)。同样地，如果肽为D-肽类似物，那么序列的所有氨基酸部分为D-氨基酸部分。
术语“翻转-反向肽”将由所属领域的技术人员无疑义地理解。在翻转-反向肽中，对应序列反转并且使用D-氨基酸部分而非L-氨基酸部分。
包含SEQ ID No:1所示的序列的所述肽或其免疫原性肽模拟物或翻转-反向物具有25个氨基酸或更少的长度，并且可以优选地具有20个氨基酸或更少，更优选地15个氨基酸或更少并且最优选地13个氨基酸或更少的长度。举例来说，肽的长度可以是25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14或13个氨基酸。优选地，包含SEQ ID No:1所示的序列的肽或其免疫原性肽模拟物或翻转-反向物的长度在13与25、13与20、13与19、13与18、13与15、14与25、14与20、14与19或14到16个氨基酸之间。
术语“氨基酸”在其最广泛意义上理解包括含有至少一个胺(-NH2)和至少一个羧基(-COOH)官能团以及对每个氨基酸具有特异性的侧链(R基团)的有机化合物。此外，术语“氨基酸”在其最广泛意义上理解包括天然和非天然氨基酸。本文所使用的氨基酸的单字母和三字母代码如果未另外指示，则为所属领域的技术人员通常使用和众所周知的那些。
术语“天然氨基酸”在其最广泛意义上理解包括蛋白原性(proteinogenic)氨基酸、已知在蛋白质中天然存在但不为蛋白原性的其它氨基酸以及天然存在但通常不在蛋白质中发现的氨基酸。在一优选实施例中，天然氨基酸是蛋白原性氨基酸。
蛋白原性氨基酸通常由翻译机制使用以组装蛋白质并且对所属领域的技术人员已知，如丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、吡咯赖氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、硒半胱氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸。
如在整个本发明中所使用，术语“为天然氨基酸”可以在最广泛意义上理解为属于上文所定义的天然氨基酸的群组的任何氨基酸可以置于此位置。
术语“非天然氨基酸”在其最广泛意义上理解包括来源于实验室合成并且不天然存在的氨基酸。非天然氨基酸为所属领域的技术人员众所周知。举例来说，其可包括D-氨基酸、高氨基酸、β-高氨基酸、N-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸和/或非天然侧链变异氨基酸。
优选地，药物化学中使用并且可根据本发明使用的氨基酸的非天然和天然类似物概述于以下中：Blaskovich M.A.T.(《药物化学中的不寻常氨基酸(Unusual Amino Acids in Medicinal Chemistry)》；《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》2016,59,10807-10836.DOI:10.1021/acs.jmedchem.6b00319)，其内容以引用的方式并入本文中。
适合非天然氨基酸例如是2-氨基丁酸(2-Abu)、2-氨基-2-环己基甘氨酸(Chg)、环丙基-丙氨酸(Cpa)、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hle)、β-环己基丙氨酸(Cha)、炔丙基甘氨酸(Pra)、正缬氨酸(Nva)、α-氨基异丁酸(Aib)、1-氨基环丙烷甲酸(Acpc)、高苯丙氨酸(HoPhe)、苯基甘氨酸(PhG)、3-碘-酪氨酸(Tyr3-I)、3,5-二碘-酪氨酸(Tyr3,5-I2)、高酪氨酸(hTyr)、4-甲氧基高酪氨酸(hTyr-Me)、6-羧基-赖氨酸(6-cl)、N(6)-乙酰基-赖氨酸(Aly)、半胱氨酸-S-二氧化物(csd)、硒半胱氨酸(cse)、羟基-半胱氨酸(cso)、3-亚磺酸基-丙氨酸(csw)、4-甲基-组氨酸(hic)、3-羟基-脯氨酸(3hyp)、4-羟基-脯氨酸(4hyp)、5-羟基-脯氨酸(5hyp)、4-氧代吡咯烷-2-甲酸、犬尿氨酸(kyn)、环丝氨酸、N-三甲基-赖氨酸(N3l)、N-二甲基赖氨酸(mlz)、硒甲硫氨酸(mse)、3-硝基酪氨酸(3-NO2)、3-氨基二环[2.2.1]-庚烷-2-甲酸、3-氨基二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酸、2-氨基环庚烷甲酸、6-氨基-3-环己烯-1-甲酸、2-氨基-2-甲基环己烷甲酸、2-(氨基)辛二酸、(2-茚满基)-甘氨酸、五氟-苯丙氨酸、2-溴-苯丙氨酸、4-溴-苯丙氨酸、2-氯-苯丙氨酸、3-氯-苯丙氨酸、4-氯-苯丙氨酸、2,4-二氯-苯丙氨酸、3,4-二氯-苯丙氨酸、2-氟-苯丙氨酸、3-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸、3,4-二氟-苯丙氨酸3,5-二氟-苯丙氨酸、2-氰基-苯丙氨酸、3-氰基-苯丙氨酸、2-甲基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、4-甲基-苯丙氨酸、4-氨基-苯丙氨酸、2-硝基-苯丙氨酸、4-硝基-苯丙氨酸、β-(2-喹啉基)-丙氨酸、β-(4-噻唑基)-丙氨酸、β-(2-噻吩基)-丙氨酸、N-(4-氨基丁基)-甘氨酸、2-甲氧基-苯丙氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸、1-氨基环丁烷甲酸、1-(氨基)环己烷甲酸、1-(氨基)环丙烷甲酸、2-氨基-1,2,3,4-四氢萘-2-甲酸、烯丙基-甘氨酸、环丙基-甘氨酸、2-噻吩基-甘氨酸、3-噻吩基-甘氨酸、环己基-甘氨酸、3-[3,4-双(三氟甲基)苯基]-丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-苯丙氨酸、3-(三氟甲基)-苯丙氨酸、4-(三氟甲基)-苯丙氨酸、β-苯基-苯丙氨酸、5-氟-色氨酸、5-羟基-色氨酸、5-甲氧基-色氨酸和5-甲基-色氨酸。
如在整个本发明中所使用，术语“为非天然氨基酸”可以在最广泛意义上理解为属于上文所定义的非天然氨基酸的群组的任何氨基酸可以置于此位置。
如在整个本发明中所使用，术语“或其非天然或天然类似物”可以在最广泛意义上理解为对应位置处的氨基酸可以被属于如上文所定义的非天然或天然氨基酸的群组的具有类似物理化学特性的任何氨基酸替换。然而，替换也可独立于物理化学特性进行。
举例来说，在Leu、Val或Ile被其非天然或天然类似物替换的情况下，类似物可以是具有类似物理化学特性，例如氨基酸残基的尺寸相当或氨基酸残基内的疏水性含量相当或其组合的任何非天然或天然氨基酸。然而，Leu、Val或Ile的替换也可独立于物理化学特性进行。在一优选实施例中，Leu的天然类似物为大体积的疏水性脂肪族氨基酸，更优选地选自Val和Ile。在另一优选实施例中，Val的天然类似物为大体积的疏水性脂肪族氨基酸，更优选地选自Leu和Ile。在另一优选实施例中，Ile的天然类似物为大体积的疏水性脂肪族氨基酸，更优选地选自Val和Leu。
优选地，Val和Leu的非天然类似物独立地选自疏水性非天然氨基酸。举例来说，Val、Ile或Leu的非天然类似物可独立地选自2-Abu、Nle、Chg和Cpa，如实例中所展示。
更优选地
-Val的非天然类似物独立地选自Nle、Hle、Cha、Pra、Nva、Aib、Acpc、ABu、Bug、Chg、Cpa、HoPhe和PhG，
-Leu的非天然类似物独立地选自Chg、Nle、Hle、Cha、Pra和Cpa，和/或
-Tyr的非天然类似物独立地选自Tyr3-I和Tyr3,5-I2。
举例来说，在Val被其非天然或天然类似物替换的情况下，类似物可以是具有类似物理化学特性，例如氨基酸残基的尺寸相当或氨基酸残基内的疏水性含量相当或其组合的任何非天然或天然氨基酸。然而，Val的替换也可独立于物理化学特性进行。
举例来说，在Tyr被其非天然或天然类似物替换的情况下，类似物可以是具有类似物理化学特性，例如氨基酸残基的尺寸相当或氨基酸残基内的亲水性或芳香族含量相当或其组合的任何非天然或天然氨基酸。然而，Tyr的替换也可独立于物理化学特性进行。举例来说，Tyr3-I或Tyr3,5-I2可用作非天然类似物。举例来说，Phe可用作Tyr的天然类似物。
举例来说，在Pro被其非天然或天然类似物替换的情况下，类似物可以是具有类似物理化学特性，例如氨基酸残基的尺寸相当或氨基酸残基内的疏水性或亲水性含量相当或其组合的任何非天然或天然氨基酸。然而，Pro的替换也可独立于物理化学特性进行。举例来说，羟基脯氨酸可以用作Pro的类似物。Pro的非天然类似物为所属领域中已知的。优选地，Pro的非天然类似物独立地选自以下(出于说明性目的展示Pro)：
举例来说，在Asp或Glu被其非天然或天然类似物替换的情况下，类似物可以是具有类似物理化学特性，例如氨基酸残基的尺寸相当或氨基酸残基内的亲水性或酸性含量相当或其组合的任何非天然或天然氨基酸。然而，Asp或Glu的替换也可独立于物理化学特性进行。Asp和Glu的非天然类似物为所属领域中已知的。优选地，Asp或Glu的非天然类似物独立地选自α-甲基天冬氨酸、γ-羧基-谷氨酸、高谷氨酸和2-氨基-庚二酸。更优选地，Asp的非天然类似物为α-甲基天冬氨酸。此外，更优选地，Glu的非天然类似物独立地选自γ-羧基-谷氨酸、高谷氨酸和2-氨基-庚二酸。下文展示Glu和Asp的这些非天然类似物的结构以及Asp和Glu的结构：
此外，这些类似物可以是结构和/或功能类似物，其中结构类似物可以在最广泛意义上理解为具有与所置换的氨基酸类似的结构，但相对于某一组分与所置换的氨基酸不同的结构。功能类似物可以在最广泛意义上理解为具有类似物理、化学或生物化学特性的结构。
如在整个本发明中所使用，术语“被非天然或天然类似物置换”可以在最广泛意义上理解为至少一个氨基酸被属于如上文所定义的非天然或天然氨基酸的群组的任何氨基酸替换。非天然或天然类似物可具有类似物理化学特性，但也可能非天然或天然类似物可不具有类似物理化学特性。举例来说，替换也可独立于物理化学特性进行，如以上Val和Leu的情况下所描述。类似物可以进一步为结构和/或功能类似物。
类似物理化学特性可例如包括氨基酸残基的尺寸相当、氨基酸残基内的疏水性或亲水性含量相当或酸性或碱性组分的含量相当或其组合。此外，类似物理化学特性还可包括上文所提到的疏水性或亲水性含量或酸性或碱性组分的类似配置。
举例来说，“被非天然或天然类似物置换”可具有以下意义：非极性氨基酸可以被另一非极性氨基酸替换，尤其脂肪族大体积非极性氨基酸可以被另一脂肪族大体积非极性氨基酸替换，并且芳香族非极性氨基酸可以被另一芳香族非极性氨基酸替换。在此情形下，非极性氨基酸可以选自下组：G(Gly)、A(Ala)、V(Val)、P(Pro)、L(Leu)、I(Ile)、M(Met)、W(Trp)和F(Phe)。脂肪族非极性氨基酸可以选自下组：G(Gly)、A(Ala)、V(Val)、P(Pro)、L(Leu)、I(Ile)和M(Met)。大体积脂肪族非极性氨基酸可以选自下组：V(Val)、L(Leu)、I(Ile)和M(Met)。芳香族非极性氨基酸可以选自下组：W(Trp)和F(Phe)。
举例来说，“被非天然或天然类似物置换”也可具有以下意义：极性(不带电)氨基酸可以被另一极性(不带电)氨基酸替换，尤其脂肪族极性(不带电)氨基酸可以被另一脂肪族极性(不带电)氨基酸替换。在此情形下，极性(不带电)氨基酸可以选自下组：S(Ser)、T(Thr)、Y(Tyr)、C(Cys)、N(Asn)、U(Sec，硒半胱氨酸基)、O(Pyl，吡咯赖氨酸基)和Q(Gln)。脂肪族极性(不带电)氨基酸可以选自下组：S(Ser)、T(Thr)、C(Cys)、N(Asn)、U(Sec)、O(Pyl)和Q(Gln)。优选地，S(Ser)可被T(Thr)置换，且反之亦然，且Q(Gln)可被N(Asn)置换，且反之亦然。
举例来说，“被非天然或天然类似物置换”也可具有以下意义：碱性氨基酸可以被另一碱性氨基酸替换。
在此情形下，碱性氨基酸可以选自下组：K(Lys)、R(Arg)和H(His)。优选地，K(Lys)可被R(Arg)置换，且反之亦然。
举例来说，“被非天然或天然类似物置换”也可具有以下意义：酸性氨基酸可以被另一酸性氨基酸替换。在此情形下，酸性氨基酸可以选自下组：D(Asp)和E(Glu)。
举例来说，“被非天然或天然类似物置换”也可具有以下意义：包括相反电荷的相互作用的极性氨基酸可以是替换的相当氨基酸。可彼此交换的所述氨基酸可以选自下组：S(Ser)、T(Thr)、Y(Tyr)、C(Cys)、N(Asn)、Q(Gln)、K(Lys)、R(Arg)、H(His)、U(Sec)、O(Pyl)、D(Asp)和E(Glu)。
举例来说，“被非天然或天然类似物置换”也可具有以下意义：小尺寸的氨基酸可以被另一小尺寸的氨基酸置换。在此情形下，小尺寸的氨基酸可以选自下组：A(Ala)、G(Gly)和S(Ser)。
举例来说，“被非天然或天然类似物置换”也可具有以下意义：至少部分极性氨基酸可以被另一至少部分极性氨基酸替换，尤其脂肪族至少部分极性氨基酸可以被另一脂肪族至少部分极性氨基酸替换，并且芳香族至少部分极性氨基酸可以被另一芳香族至少部分极性氨基酸替换。芳香族至少部分极性氨基酸可以选自下组：Y(Tyr)、W(Trp)和F(Phe)。
术语“其中依据SEQ ID No:1所示的序列中的至少一个氨基酸不同于序列LVVSTTYLPHYFD(SEQ ID No:3)中在对应位置处的氨基酸”可以在最广泛意义上理解为依据SEQ ID No:1所示的序列在其位置X1到X13中的至少一个处具有并非与序列LVVSTTYLPHYFD(SEQ ID No:3)中的对应位置处的氨基酸相同氨基酸的氨基酸。如果两个氨基酸的氨基酸残基在任何种类的特征方面不同，如不同官能团、不同分子结构、不同官能团配置、不同化学键结等，则其可不相同。确切地说，不同氨基酸可独立地为缺失、替换或插入。在一优选实施例中，不同氨基酸为替换，如独立地被不同天然或非天然氨基酸，或氨基酸的天然或非天然类似物替换。
如果SEQ ID No:1的仅一个氨基酸不同于SEQ ID No.3所示的序列的其对应位置，那么其可以是选自X1到X13的任何位置处的氨基酸。在此情况下，优选地，不同于SEQ ID No.3所示的序列的对应位置的SEQ ID No:1的一个氨基酸可以在选自X1、X2、X3、X6、X7、X8、X9、X11、X12和X13的任何位置处，更优选地在选自X1、X2、X3、X7、X8、X9、X12和X13的任何位置处，又更优选地在选自X1、X2、X3、X7、X8、X9和X13的任何位置处，且最优选地在选自X1、X3、X7和X13的任何位置处。
如果SEQ ID No:1的两个或更多个氨基酸不同于SEQ ID No.3所示的序列的其对应位置，那么其可以位于选自X1到X13的位置的任何组合处。优选地，不同于SEQ ID No.3所示的序列的对应位置的SEQ ID No:1的两个或更多个氨基酸可以在选自X1、X2、X3、X6、X7、X8、X9、X11、X12和X13的位置的任何组合处，更优选地在选自X1、X2、X3、X7、X8、X9、X12和X13的位置的任何组合处，又更优选地在选自X1、X2、X3、X7、X8、X9和X13的位置的任何组合处，且最优选地在选自X1、X3、X7和X13的位置的任何组合处。
一般来说，SEQ ID No:1的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸可以不同于SEQ ID No.3所示的序列的对应位置。优选地，SEQ ID No:1的至少1到10个、更优选地1到8个、又更优选地1到7个并且最优选地1到4个氨基酸可不同于SEQ ID No.3所示的序列的对应位置。
然而，应理解，具有SEQ ID No:1所示的序列的肽中的一个或多个氨基酸可以与SEQ ID No.3所示的序列的对应位置相同。举例来说，SEQ ID No:1的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸可以与SEQ ID No.3所示的序列的对应位置相同。优选地，SEQ ID No:1的至多1到10个、更优选地1到8个、又更优选地1到7个并且最优选地1到4个氨基酸与SEQ ID No.3所示的序列的对应位置相同。
优选地，依据SEQ ID No:1所示的序列的氨基酸N端和/或C端i)对应于SEQ ID No:17所示的序列，或ii)对应于与其异源的序列。
如本文所用，在最广泛意义上，“异源的序列”可以是由其原始形式，即SEQ ID No:17所示的序列修饰的序列。异源序列的修饰可以通过例如定点突变诱发或通过在化学合成中添加异源氨基酸来进行。
SEQ ID No:17所示的序列下文展示。
(SEQ ID NO:17)
优选地，依据SEQ ID No:1所示的序列与序列LVVSTTYLPHYFD(SEQ ID No:3)具有至多99％、98％、97％、96、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％或50％序列同一性。
如本文所用，术语“至多99％氨基酸同一性”意指所讨论的氨基酸序列具有特征在于在100个氨基酸的片段内，至多99个氨基酸残基与待比较的序列相同的氨基酸序列。
根据本发明的序列同一性可以例如通过序列比对方法以序列比较形式测定。序列比对的方法在所属领域中众所周知且包括各种程序和比对算法。此外，NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)可从若干来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD))和因特网，以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。相对于例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸序列的根据本发明的突变体的同一性百分比通常使用具有标准设置的NCBI Blast blastp来表征。或者，序列同一性可使用具有标准设置的软件GENEious来测定。比对结果可例如使用自由端空位作为比对类型和Blosum62作为代价矩阵的全局比对方案，从软件Geneious(版本R8)导出。
依据SEQ ID No:1的肽任选地在肽的N端和/或C端处包含1或2个另外的氨基酸，所述氨基酸与SEQ ID No:17所示的序列对应位置异源。
这些1或2个另外的氨基酸可用作连接子氨基酸，例如用于将肽连接到固体支撑物，例如用于体外诊断目的，或用于提供下文所描述的本发明的核酸骨架。
在另一实施例中，本发明涉及一种长度为25个氨基酸或更少的肽，其包含序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14(SEQ ID No:2)
其中
X1为Leu、Val或Ile或其非天然或天然类似物，
X2为Val或其非天然或天然类似物，
X3为Val或其非天然或天然类似物，
X4为天然或非天然氨基酸，
X5为天然或非天然氨基酸，
X6为天然或非天然氨基酸，
X7为Tyr或其非天然或天然类似物，
X8为Leu、Val或Ile或其非天然或天然类似物，
X9为Pro或其非天然或天然类似物，
X10为天然或非天然氨基酸，
X11为天然或非天然氨基酸，
X12为天然或非天然氨基酸，
X13为Asp或Glu或其非天然或天然类似物，
X14为天然或非天然氨基酸，
并且其中依据SEQ ID No:2所示的序列中的至少一个氨基酸不同于序列LVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID No:5)中在对应位置处的氨基酸，
或其肽模拟物或翻转-反向肽。
包含SEQ ID No:2所示的序列的所述肽或其免疫原性肽模拟物或翻转-反向物可具有25个氨基酸或更少，优选地20个氨基酸或更少，更优选地15个氨基酸或更少并且最优选地14个氨基酸或更少的长度。举例来说，肽的长度可以是25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15或14个氨基酸。优选地，包含SEQ ID No:1所示的序列的肽或其免疫原性肽模拟物或翻转-反向物的长度在15与25、15与20、15与19、15与18、15与17、14与25、14与20、14与19或14到16个氨基酸之间。
术语“其中依据SEQ ID No:2所示的序列中的至少一个氨基酸不同于序列LVVSTTYLPHYFD(SEQ ID No:5)中在对应位置处的氨基酸”可以在最广泛意义上理解为依据SEQ ID No:2所示的序列在其位置X1到X14中的至少一个处具有并非与序列LVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID No:5)中的对应位置处的氨基酸相同氨基酸的氨基酸。如果两个氨基酸的氨基酸残基在任何种类的特征方面不同，如不同官能团、不同分子结构、不同官能团配置、不同化学键结等，则其可不相同。确切地说，不同氨基酸可独立地为缺失、替换或插入。在一优选实施例中，不同氨基酸为替换，如独立地被不同天然或非天然氨基酸，或氨基酸的天然或非天然类似物替换。
上述本发明的肽相同或对应的实施例适用。
如果SEQ ID No:2的仅一个氨基酸不同于SEQ ID No.5所示的序列的其对应位置，那么其可以是选自X1到X14的任何位置处的氨基酸。在此情况下，优选地，不同于SEQ ID No.5所示的序列的对应位置的SEQ ID No:2的一个氨基酸可以在选自X1、X2、X3、X6、X7、X8、X9、X11、X12、X13和X14的任何位置处，更优选地在选自X1、X2、X3、X7、X8、X9、X12、X13和X14的任何位置处，又更优选地在选自X1、X2、X3、X7、X8、X9和X13的任何位置处，且最优选地在选自X1、X3、X7和X13的任何位置处。
如果SEQ ID No:2的两个或更多个氨基酸不同于SEQ ID No.5所示的序列的其对应位置，那么其可以位于选自X1到X14的位置的任何组合处。优选地，不同于SEQ ID No.5所示的序列的对应位置的SEQ ID No:2的两个或更多个氨基酸可以在选自X1、X2、X3、X6、X7、X8、X9、X11、X12、X13和X14的位置的任何组合处，更优选地在选自X1、X2、X3、X7、X8、X9、X12、X13和X14的位置的任何组合处，又更优选地在选自X1、X2、X3、X7、X8、X9和X13的位置的任何组合处，且最优选地在选自X1、X3、X7和X13的位置的任何组合处。
一般来说，SEQ ID No:2的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸可以不同于SEQ ID No.5所示的序列的对应位置。优选地，SEQ ID No:2的至少1到10个、更优选地1到8个、又更优选地1到7个并且最优选地1到4个氨基酸可不同于SEQ ID No.5所示的序列的对应位置。
然而，应理解，具有SEQ ID No:2所示的序列的肽中的一个或多个氨基酸可以与SEQ ID No.5所示的序列的对应位置相同。举例来说，SEQ ID No:2的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸可以与SEQ ID No.5所示的序列的对应位置相同。优选地，SEQ ID No:2的至多1到10个、更优选地1到8个、又更优选地1到7个并且最优选地1到4个氨基酸与SEQ ID No.5所示的序列的对应位置相同。
优选地，依据SEQ ID No:2所示的序列的氨基酸N端和/或C端i)对应于SEQ ID No:17所示的序列，或ii)对应于与其异源的序列。
优选地，依据SEQ ID No:2所示的序列与序列LVVSTTYLPHYFD(SEQ ID No:5)具有至多99％、98％、97％、96、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％或50％序列同一性。
依据SEQ ID No:2的肽任选地在肽的N端和/或C端处包含1或2个另外的氨基酸，所述氨基酸与SEQ ID No:17所示的序列对应位置异源。
优选地，本发明涉及一种根据本发明的肽，其中独立地：
X1为Leu、Val、Ile、Chg或2-Abu，
X2为Val、Chg、Cpa或Nle，
X3为Val、Chg、Cpa或Nle，
X4为Ser，
X5为Thr，
X6为Thr，
X7为Tyr、Tyr3-I或Tyr3,5-I2，
X8为Leu、Val、Ile、Chg或2-Abu，
X9为Pro，
X10为His，
X11为Tyr，
X12为Phe，
X13为Asp、Glu或Aad，或
X14为Asn，
或其肽模拟物或翻转-反向肽。
在一优选实施例中，本发明涉及本发明的肽，其具有20个氨基酸或更少的长度，
或其肽模拟物或翻转-反向肽。
更优选地，本发明的肽具有19个氨基酸或更少，又更优选17个氨基酸或更少，再更优选15个氨基酸或更少并且最优选14个氨基酸或更少的长度。
在另一优选实施例中，本发明涉及本发明的肽，其中依据SEQ ID No:1所示的序列中的2个或更多个氨基酸不同于序列LVVSTTYLPHYFD(SEQ ID No:3)中在对应位置处的氨基酸，或其中依据SEQ ID No:2所示的序列中的2个或更多个氨基酸不同于序列LVVSTTYLPHYFD(SEQ ID No:5)中在对应位置处的氨基酸，
或其肽模拟物或翻转-反向肽。
在另一优选实施例中，本发明涉及本发明的肽，其中SEQ ID No:1或2所示的序列中的至少一个氨基酸被所述肽中的其非天然或天然类似物置换，
或其肽模拟物或翻转-反向肽。
一般来说，SEQ ID No:1或2所示的序列中的至少一个氨基酸可以被其非天然或天然类似物置换。
一般来说，SEQ ID No:1的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸可以被其非天然或天然类似物置换。优选地，SEQ ID No:1的1到10个、更优选地1到8个、又更优选地1到7个并且最优选地1到4个氨基酸可以被其非天然或天然类似物置换。
一般来说，SEQ ID No:2的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸可以被其非天然或天然类似物置换。优选地，SEQ ID No:2的1到10个、更优选地1到8个、又更优选地1到7个并且最优选地1到4个氨基酸可以被其非天然或天然类似物置换。
在又一优选实施例中，本发明涉及本发明的肽，其中在一个或多个选自X1、X2、X3、X7、X8、X9和X13的位置处SEQ ID No:1或2所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的其非天然或天然类似物置换。
在实例中在Ala筛选实验中发现，X1、X2、X3、X7、X8、X9和X13对于抗病毒活性是重要的。因此，优选地，这些位置处的氨基酸分别独立地选自SEQ ID No:3或5中在对应位置处的氨基酸或其天然或非天然类似物。所述具有一种或多种其天然或非天然类似物的肽在体外和体内展现极好抗病毒活性(参见例如图5和7)。
一般来说，在一个或多个选自X1到X13的位置处SEQ ID No:1所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的其非天然或天然类似物置换。优选地，在一个或多个选自X1、X2、X3、X6、X7、X8、X9、X11、X12和X13的位置处，更优选在一个或多个选自X1、X2、X3、X7、X8、X9、X12和X13的位置处，又更优选在一个或多个选自X1、X2、X3、X7、X8、X9和X13的位置处，并且最优选在一个或多个选自X1、X3、X7和X13的位置处SEQ ID No:1所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的其非天然或天然类似物置换。
此外，优选地，在一个或多个选自X4、X5、X6、X10、X11和X12的位置处SEQ ID No:1所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的其非天然或天然类似物置换。或者，在一个或多个选自X4、X5、X6、X10、X11和X12的位置处SEQ ID No:1所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的并非其类似物的非天然或天然氨基酸置换。
一般来说，在一个或多个选自X1到X14的位置处SEQ ID No:2所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的其非天然或天然类似物置换。优选地，在一个或多个选自X1、X2、X3、X6、X7、X8、X9、X11、X12、X13和X14的位置处，更优选在一个或多个选自X1、X2、X3、X7、X8、X9、X12、X13和X14的位置处，又更优选在一个或多个选自X1、X2、X3、X7、X8、X9和X13的位置处，并且最优选在一个或多个选自X1、X3、X7和X13的位置处SEQ ID No:1所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的其非天然或天然类似物置换。
此外，优选地，在一个或多个选自X4、X5、X6、X10、X11、X12和X14的位置处SEQ ID No:2所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的其非天然或天然类似物置换。或者，在一个或多个选自X4、X5、X6、X10、X11、X12和X14的位置处SEQ ID No:2所示的序列中的至少一个氨基酸被肽中的并非其类似物的非天然或天然氨基酸置换。
在再另一优选实施例中，本发明涉及本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽，其中所述肽：
-包含L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物，
-包含至少一个主链修饰的氨基酸，
-为环状分子，
-包含至少一个非肽部分，优选地选自偶合基团、PEG部分、可检测标记、保护性基团、脂质部分和糖部分，或包含更翻译后修饰中的一个，和/或
-与骨架共价或非共价结合。
在一优选实施例中，本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以进一步包含仅L-氨基酸或仅D-氨基酸或其组合。
根据SEQ ID NO:1的本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个D-氨基酸，由此剩余氨基酸为L-氨基酸。优选地，根据SEQ ID NO:1的本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含1到10，更优选地1到8，又更优选地1到7并且最优选地1到4个D-氨基酸，由此剩余氨基酸为L-氨基酸。
根据SEQ ID NO:2的本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个D-氨基酸，由此剩余氨基酸为L-氨基酸。优选地，根据SEQ ID NO:2的本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含1到10，更优选地1到8，又更优选地1到7并且最优选地1到4个D-氨基酸，由此剩余氨基酸为L-氨基酸。
如在整个本发明中所使用，术语“L-氨基酸”和“D-氨基酸”可以在最广泛意义上理解为氨基酸的中心碳原子周围的两种不同对映异构体(立体异构体)，由此按照惯例，这些对映异构体被称为L-形式和D-形式，类似于左旋和右旋构型。
在一优选实施例中，本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以进一步包含至少一个主链修饰的氨基酸。
根据SEQ ID NO:1的本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个主链修饰的氨基酸，由此剩余氨基酸未主链修饰。优选地，根据SEQ ID NO:1的本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含1到10，更优选1到8，又更优选1到7，并且最优选1到4个主链修饰的氨基酸，由此剩余氨基酸未主链修饰。
一般来说，根据SEQ ID NO:2的本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个主链修饰的氨基酸，由此剩余氨基酸未主链修饰。优选地，根据SEQ ID NO:2的本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含1到10，更优选1到8，又更优选1到7，并且最优选1到4个主链修饰的氨基酸，由此剩余氨基酸未主链修饰。
如在整个本发明中所使用，术语“主链修饰的氨基酸”可以在最广泛意义上理解为主链经修饰的氨基酸。如在整个本发明中所使用，肽的术语“主链”可以在最广泛意义上理解为一起形成分子的连续链的最长的一串共价键结原子，其在肽中通常具有重复序列-NH-CαH-(C＝O)-。
这些修饰的实例为翻译后修饰，其通常在细胞核中DNA转录到RNA的过程之后核糖体的蛋白质合成之后进行。如果人工合成肽，那么也可以在体外添加这些修饰。主链的修饰可以例如是与主链的共价连接。主链的修饰可以例如靶向酰胺N、C＝O或Cα或延长肽的N端或C端。
主链修饰可以是化学保守修饰(如L-氨基酸到D-氨基酸的转化或酰胺氮的甲基化)和对主链的实质改变(包括唑杂环的形成)。其它主链修饰可能需要某一氨基酸的存在并且涉及此氨基酸的特定残基。
在另一优选实施例中，本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以是环状分子。如在整个本发明中所使用，在肽或其肽模拟物或翻转-反向肽的情形下术语“环状分子”可以在最广泛意义上理解为连接以形成环的一系列原子。
优选地，肽或其肽模拟物或翻转-反向肽的所有或一部分氨基酸形成环。举例来说，肽或其肽模拟物或翻转-反向肽的至少2个或更多个氨基酸可以形成环。
举例来说，所述环可以通过肽的N端与肽的C端共价结合而形成。此外，所述环还可通过共价连接氨基酸侧链而形成。肽可以在固体支撑物上环化。可使用多种环化试剂，如HBTU/HOBt/DIEA、PyBop/DIEA、PyClock/DIEA。头接尾肽可以在固体支撑物上制造。在某一适合点处的C端的脱除保护基允许通过与脱除保护基的N端的酰胺键形成进行树脂上环化。一旦发生环化，肽就可以通过酸解从树脂裂解并且纯化。
确切地说，在实例6和图8中展现本发明的肽的环化不会不利地影响体外抗病毒活性。在实例6中测试的肽通过肽的N端与肽的C端共价结合而形成环。
在另一优选实施例中，本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以包含至少一个非肽部分，优选地选自偶合基团、PEG部分、可检测标记、保护性基团、脂质部分和糖部分，或包含更翻译后修饰中的一个。
如在整个本发明中所使用，术语“非肽部分”可以在最广泛意义上理解为不是肽或氨基酸的部分。非肽部分的实例为偶合基团、PEG部分、可检测标记、保护性基团、脂质部分和糖部分。用于将非肽部分添加到本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽的适合方法包括固相合成(SPPS)。SPPS允许通过氨基酸衍生物在不溶性多孔支撑物上的连续反应快速组装肽链。固体支撑物由与新生肽链连接的用反应性基团(如胺或羟基)官能化的小型聚合树脂珠粒组成。举例来说，取决于所使用的侧链和保护策略，使用在其N端和侧链上使用适当保护基，如Boc(酸不稳定)或Fmoc(碱不稳定)保护的待与肽链N端偶合的氨基酸。举例来说，碳化二亚胺，如二环己基碳化二亚胺(DCC)和二异丙基碳化二亚胺(DIC)可以用于酰胺键形成。或者，作为实例，可使用丙烷膦酸酐作为酰胺键形成的试剂。
“偶合基团”理解为反应性化学部分，其允许与另一部分，例如非肽部分共价键联。举例来说，偶合基团可以是叠氮基或叠氮赖氨酸。举例来说，包含叠氮基的肽可以通过与DBCO偶合的核酸骨架分子一起培育而与本发明的核酸骨架共价结合，如以下所描述：M.等人(《国际分子科学杂志(Int.J.Mol.Sci.)》2018,19,3482；doi:10.3390/ijms19113482)
举例来说，PEG部分可以理解为可以添加到本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽中的一个或多个聚乙二醇(PEG)的链。通常，PEG可添加到例如在肽的C端或N端处或在氨基酸侧链处的末端羧基或氨基。添加PEG的适合氨基酸为例如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。PEG通常可使用标准酰胺键形成与肽连接，但键联化学的其它方法也是可能的(如硫醇-马来酰亚胺、肟接合或点击化学)。
适合的可检测标记为适用于体外和/或体内检测的部分，并且对于技术人员来说是已知的。检测可以如在发光，尤其荧光的情况下是直接的，或在酶或其底物的情况下是间接的。因此，可采用适合于间接或间接检测的可检测标记。
如本文所用，“可检测标记”、“标记”、“标记部分”或“可检测标记部分”是指能够产生用于直接或间接检测的信号的任何物质。因此，标记部分可以直接或间接检测。对于直接检测，适用于本发明的标记部分可以选自任何已知的可检测标记基团，如发色团、化学发光基团(例如吖啶酯或二氧杂环丁烷)、电化学发光化合物、染料或荧光染料(例如荧光素、香豆素、罗丹明(rhodamine)、噁嗪、试卤灵(resorufin)、花青和其衍生物)、发光金属络合物，如钌或铕络合物，和放射性同位素。
在间接检测系统中，生物亲合(bioaffine)结合对的第一搭配物是本发明的肽的标记部分；即，第一搭配物与本发明的肽共价结合。适合的结合对的实例为半抗原或抗原/抗体，生物素或生物素类似物，如氨基生物素、亚氨基生物素或去硫生物素/抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，糖/凝集素，核酸或核酸类似物/互补核酸，和受体/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。优选的第一结合对成员包括半抗原、抗原和激素。同样优选的是半抗原，如标签(tag)，地高辛(digoxin)和生物素和其类似物。所述结合对的第二搭配物，例如抗体、抗生蛋白链菌素等通常经标记以允许直接检测，例如通过如上文所提及的标记部分。
因此，在一优选实施例中，标记部分是用于直接标记或用于间接标记的标记部分。
在一优选实施例中，标记部分选自(a)选自下组的直接标记部分：发色团、化学发光基团(例如吖啶酯或二氧杂环丁烷)、电化学发光化合物、染料、荧光染料(例如荧光素、香豆素、罗丹明、噁嗪、试卤灵、花青和其衍生物)、发光金属络合物，如钌或铕络合物，和放射性同位素；(b)或间接检测系统的搭配物中的一个，优选地其中标记部分为选自下组的结合对的成员中的一个：(i)半抗原或抗原/抗体，(ii)生物素或生物素类似物，如氨基生物素、亚氨基生物素或去硫生物素/抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，(iii)糖/凝集素，(iv)核酸或核酸类似物/互补核酸，和(v)受体或受体片段/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。
优选的作为适合于间接检测的标记部分的第一结合对成员包括半抗原、抗原和激素。同样优选的是半抗原，如地高辛和生物素和其类似物。所述结合对的第二搭配物，例如抗体、抗生蛋白链菌素等通常经标记以允许直接检测，例如通过如上文所提及的直接标记部分；然而，也有可能采用与本发明的肽共价结合的抗体和使用经标记抗原或半抗原以用于检测。在结合对成员的以上描述中，术语抗体理解为涵盖抗体和其抗原结合片段。
在一优选实施例中，标记部分是用于直接标记的标记部分，甚至更优选地，标记部分是荧光部分或染料。
适合荧光部分(或染料)在所属领域中已知并且涵盖荧光素、Cy 3、Cy5、Cy5.5、Cy2、Cy3.5、Cy3b、Cy7、Alexa Fluor染料；呫吨衍生物，如罗丹明、俄勒冈绿(Oregon green)、曙红或德克萨斯红(Texas red)；花青衍生物，如花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫羰花青和部花青；萘衍生物，如丹磺酰基和普罗丹(prodan)衍生物；香豆素衍生物；噁二唑衍生物，如吡啶噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；芘衍生物，如级联蓝；噁嗪衍生物，如尼罗红(Nile red)、尼罗蓝、甲苯基紫、噁嗪170；吖啶衍生物，如原黄素、吖啶橙、吖啶黄；芳基次甲基衍生物，如金胺、结晶紫、孔雀绿；四吡咯衍生物，如卟吩、酞菁和胆红素。
适合的用于标记的放射性同位素(radioactive isotope/radioisotope)和用所述放射性标记来标记本发明的化合物的方法为技术人员已知。举例来说，可使用以下同位素中的一个：64Cu、14C、3H、32P、33P、123I、125I和131I。
举例来说，64Cu标记的肽可以用于ImmunoPET以用于体内检测和体内诊断目的。举例来说，肽可以用PEG部分，如直链10kDa聚(乙二醇)(PEG)16通过标准琥珀酰亚胺酯-氨基化学和适合螯合剂，如螯合剂DOTA NHS(单1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)修饰。此外，缀合物可以与氯化铜(II)-64一起培育以用于放射性标记，如以下所描述：Santangelo,P.J.等人(《全身immunoPET揭露在病毒血症和抗逆转录病毒疗法处理的猕猴中的活性SIV动力学(Whole-body immunoPET reveals active SIV dynamics in viremic and antiretroviral therapy-treated macaques.)》《自然方法(Nature methods)》第12,5卷(2015):427-32.doi:10.1038/nmeth.3320)。
在抗体或抗原结合片段用作间接系统抗体/抗原或半抗原的成员的情况下，对表位或半抗原具有特异性的抗体或抗原结合片段可以与本发明的肽共价结合，或表位或半抗原可以与本发明的肽结合。相应地，对应其它成员可例如用荧光标记直接标记以用于后续检测。
如在整个本发明中所使用，术语“保护性基团”可以在最广泛意义上理解为通过官能团的化学修饰引入分子中，以获得后续化学反应中的化学选择性，或例如在随后的反应步骤中保护此官能团不受化学变化影响的化学基团。羧酸基保护的实例为酯，如甲酯或苯甲酯。胺可以由9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧基羰基保护基(Boc)保护。保护基的其它实例为所属领域的技术人员众所周知。
举例来说，添加到本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽中的脂质部分可产生氨基酸衍生物，如N-棕榈酰基-半胱氨酸(例如Pam3Cys、Pam2Cys)、O-酰基丝氨酸、N-棕榈酰基赖氨酸或脂氨基酸(LAA)。可以添加到本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽中的脂质部分为所属领域的技术人员众所周知。
举例来说，添加到本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽中的糖部分可以是葡萄糖基、甘露糖基或2-脱氧葡萄糖基。可以添加到本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽中的其它糖部分为所属领域的技术人员众所周知。
如在整个本发明中所使用，术语“翻译后修饰”可以在最广泛意义上理解为在蛋白质生物合成之后本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽的修饰。翻译后修饰通常发生于氨基酸侧链上或本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽的C端或N端处。翻译后修饰可以通过酶或非酶体内或体外添加。添加翻译后修饰的方法为所属领域的技术人员众所周知。
翻译后修饰的实例为磷酸化、乙酰化、N-连接糖基化、酰胺化、羟基化、甲基化、O-连接糖基化、泛素化、吡咯烷酮羧酸、硫酸化、二硫键形成、单或二氧化、脱氨基、脱酰胺、异构化、S-亚硝基化、棕榈酰化、环化、γ-羧基化、N-豆蔻酰化、N-乙酰化、SUMO化或甲基化。翻译后修饰的其它实例为所属领域的技术人员众所周知。
在另一优选实施例中，本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以与骨架共价或非共价结合。
本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以结合的适合的骨架例如对于本发明的纳米结构下文提到，或为所属领域的技术人员众所周知。
如在整个本发明中所使用，术语“与骨架共价结合”可以在最广泛意义上理解为本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽通过化学键与骨架连接，所述化学键涉及原子之间的电子对的共享。
如在整个本发明中所使用，术语“与骨架非共价结合”可以在最广泛意义上理解为本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽通过电磁相互作用，如疏水性作用与骨架连接。
在另一优选实施例中，本发明涉及本发明的肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
VVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID No:6)
IVVSTTYLPHYFDN(SEQ ID No:7)
[2-Abu]VVSTTYLPHYFDN(SEQ ID No:8)
LV[Chg]STTYLPHYFDN(SEQ ID No:9)
LVVSTT[Tyr3-I]LPHYFDN(SEQ ID No:10)，
[Chg][Cpa]VSTT[Tyr3,5-I2]LPHYFDN(SEQ ID No:11)，
[Chg][Nle][Chg]STTYLPHYFDN(SEQ ID No:12)，
或其肽模拟物或翻转-反向肽。
用于产生本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽的方法为所属领域的技术人员已知。除化学合成，例如上文所描述的SPPS以外，可使用重组表达，尤其由天然蛋白原性氨基酸组成的肽的重组表达。举例来说，本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以使用恰当引物、克隆程序和宿主细胞通过重组表达产生。
举例来说，本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽可以通过细菌表达，例如通过在大肠杆菌中表达以重组方式产生，任选地随后后续纯化。重组表达还可以在真核细胞，例如选自昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞的真核细胞中进行。所述真核表达系统对于技术人员是众所周知的。
或者，本发明的肽可以通过所属领域中已知的方法，如固相肽合成，例如使用如上文所描述的Fmoc策略或Boc策略通过化学合成来产生。
如果本发明的肽或其肽模拟物或翻转-反向肽包含一种或多种非天然氨基酸，那么其可以通过化学合成产生。然而，还可能通过重组表达制备肽的一部分，并且随后通过体外化学合成来修饰天然氨基酸或添加非天然氨基酸。
在另一实施例中，本发明涉及一种纳米结构，其包含：
a)核酸骨架；和
b)至少两个肽部分，其中所述至少两个肽部分中的每一个的序列独立地选自本发明所述的肽的序列，
其中所述核酸骨架选自下组：
i)线性核酸骨架，其中所述至少两个肽部分各自连接在所述核酸骨架的不同末端处或附近；和
ii)分支核酸骨架，其中所述至少两个肽部分各自与所述骨架的不同分支连接。
在实例8和图10中展现本发明的纳米结构展现针对RSV的抗病毒活性且可用于治疗、预防治疗或改善RSV感染。此外，实例10和图12指示本发明的纳米结构中肽与DNA骨架的连接可在体内通过消除聚集来增加肽的生物可用性。
核酸骨架
根据本发明的纳米结构的核酸骨架优选地由双链核酸构成。优选地，核酸骨架的核酸在足够长度上是双链的以在生理条件下保持稳定。因此，线性核酸骨架优选地由在生理条件下彼此粘接的两个核酸构成。优选地，两个核酸在生理条件下保持稳定的足够长度上，并且更优选地在包含至少12个碱基的片段长度上彼此粘接。然而，应理解，线性骨架可以视需要在其内部或在其末端上含有单链片段以改变骨架的刚度或增加结合的自由度。核酸的此单链部分的长度优选地为25个或更少核苷酸，更优选地20个或更少核苷酸，甚至更优选地15个或更少核苷酸，又更优选地10个或更少核苷酸，并且最优选地5个或更少核苷酸。技术人员能够确定何时需要所述单链片段并且视需要设计核酸。
核酸骨架以及其合成和用于产生纳米结构的方法在所属领域中已知并且例如描述于WO 2018/215660中。
当核酸骨架分支时，每一分支优选地由在生理条件下保持稳定的足够长度上，且更优选地在包含至少12个碱基的片段长度上的双链核酸在生理条件下形成。然而，应理解，即使核酸骨架的分支是双链的，形成分支点的一部分的核酸的部分仍可以是单链的。可实际上需要单链核苷酸的短片段以容纳分支点。还应理解，分支骨架可以视需要在分支内或在其末端上含有单链片段以改变分支的刚度或增加结合的自由度。在分支点、在分支内或在分支末端处的核酸的此单链部分的长度优选地为25个或更少核苷酸，更优选地20个或更少核苷酸，甚至更优选地15个或更少核苷酸，又更优选地10个或更少核苷酸，并且最优选地5个或更少核苷酸。技术人员能够确定何时需要所述单链片段并且视需要设计核酸。
所属领域的技术人员还将显而易见，在不破坏链之间的粘接的情况下，可容许两条链之间的一些错配。优选地，彼此粘接以形成核酸骨架的两个核酸在其粘接的片段内(即，线性骨架的全长和从分支骨架的分支点到分支末端)具有至少70％、更优选地80％、又更优选地90％、甚至更优选地95％并且最优选地100％的互补序列。
优选地，骨架的核酸链中的每一个由选自包括下组的核酸构成：DNA和其化学稳定化的变异体、RNA和其化学稳定化的变异体、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)或异核酸(XNA；即非天然部分置换糖分子的一类核酸)。XNA的类别包括例如CeNA、ANA、FANA、TNA、HNA、LNA、GNA和PNA，且其中许多的结合亲和力描述于例如Pinheiro,V.B.等人(《能够遗传和进化的合成基因聚合物(Synthetic Genetic Polymers Capable of Heredity and Evolution)》.(2012)《科学》,336,341-344)。更优选地，骨架的核酸链中的每一个由选自包括下组的核酸构成：DNA和其化学稳定化的变异体、RNA和其化学稳定化的变异体、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和异核酸(XNA)。
在一优选实施例中，本发明所述的纳米结构的特征进一步在于核酸骨架的核酸在足够长度上是双链的以在生理条件下保持稳定，骨架的核酸链中的每一个由选自包括下组的核酸构成：DNA和其化学稳定化的变异体、RNA和其化学稳定化的变异体、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和异核酸(XNA)。
DNA或RNA的化学稳定化变异体的适合实例为所属领域中已知的并且包括硫代磷酸酯-DNA和2'-MeO-RNA。
优选地，链中的每一个由不同核酸构成。优选地，至少一条链包含若干不同类型的核酸。天然核酸杂交物的稳定性可以例如通过添加非天然核苷酸，例如LNA和PNA来增加。这些提供更多稳定性，这是因为其允许两条核酸链之间的更强结合和/或因为其不大可能由酶降解。优选地，因此，核酸的至少一条链包含至少2％、更优选地至少5％、甚至更优选地至少10％、又更优选地至少15％并且最优选地至少20％的非天然核苷酸。这些非天然核苷酸可以全部在链中彼此紧邻或穿插于天然核苷酸当中。
然而，优选地，每一链在其整个长度上由一种核酸构成。更优选地，核酸骨架的至少两个、三个、四个、五个或最优选全部核酸链由相同核酸构成。核酸骨架的核酸链优选地由DNA或RNA构成。DNA和RNA是尤其优选的核酸，因为其易于操纵、生产便宜且经极充分研究。因此，充分理解其特性，并且可以容易地调节所述链的核苷酸组成以获得核酸骨架的所要特性(长度、柔性、粘接强度等)。由于其高通用性和稳定性，最优选的核酸为DNA。
核酸骨架的极大优点为，一旦产生了个别链，骨架就可在核酸的混合物经历适当杂交条件时自组装。这可以在将肽部分连接到不同的核酸链之前进行。或者，可以将肽连接到预形成核酸骨架以便获得根据本发明的纳米结构。
优选地，核酸骨架通过化学修饰进一步稳定化。所述化学修饰的实例为骨架的两个个别核酸链之间的共价键。其它化学修饰为所属领域的技术人员众所周知。所述修饰提供具有较高稳定性的核酸骨架。
优选地，纳米结构包含至少一个可检测标记。可检测标记可以是允许检测携带标记的纳米结构的存在的任何缀合分子。上文在肽的情形下公开了适合的可检测标记。相同优选实施例适用于本发明的肽。包含可检测标记的纳米结构尤其可用于诊断。可检测标记允许用户在诊断分析中检测是否存在或不存在纳米结构。纳米结构可以用于体外和体内诊断目的。可检测标记可以与纳米结构的核酸骨架或肽结合。可检测标记还可以例如是呈例如荧光氨基酸形式的肽的整体部分。标记可以共价或非共价与纳米结构结合。
纳米结构的核酸骨架优选地分支。因此，其优选地包含超过两个末端。其优选地包含三个分支。因为每个分支具有一个末端，所以具有三个分支的核酸骨架也包含三个末端。然而，根据本发明的纳米结构不限于具有三个分支的核酸骨架。核酸骨架可以实际上具有四个、五个、六个、七个、八个、九个或甚至十个或更多个分支。这些分支中的每一个可以潜在地携带至少一个肽部分，所述肽部分可以与在生理条件下RSV的表面上表达的分子结合。优选地，核酸骨架的分支中的每一个与所述肽部分中的至少一个连接。核酸骨架的分支的最优数目取决于待使用纳米结构的应用。
优选地，至少一个肽部分与核酸骨架的基本上每个分支连接。
在本发明的上下文中，词语“基本上”应理解为至少80％，优选地85％，更优选地90％，甚至更优选地95％，又更优选地98％，并且最优选地100％。
优选地，核酸骨架的分支中的每一个从同一分支点(从单一接合点)发出。在替代方案中，优选地，核酸骨架包含超过一个分支点并且骨架的不同分支并非全部从同一分支点发散。这仅对于具有超过三个分支的纳米结构是可能的。当纳米结构包含超过三个分支时，其因此可包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个分支点。可能的分支点的数目取决于纳米结构的分支的数目。核酸骨架中具有超过一个分支点的可能性提供纳米结构形状和设计的更多灵活性。实际上，其允许调节纳米结构的几何形状并且将肽部分相对于彼此安置在恰好所需的位置中。
具有分支核酸骨架的纳米结构优选地包含与骨架中存在的分支一样多的个别核酸。这可以如下表示：具有n个分支的分支核酸骨架优选地包含n个以形成核酸骨架的方式杂交的核酸链，其中n>3。在此情况下，个别核酸中的每一个能够与骨架的另一核酸基本上从其末端到分支点杂交，并且能够与骨架的核酸中的至少另一个基本上从分支点到基本上其另一端杂交。在核酸骨架包含多于一个分支点的情况下，跨越多于一个分支点的个别核酸与核酸骨架的多于两个其它核酸杂交。
在替代方案中，优选地，核酸骨架由单一核酸组成。优选地，纳米结构的末端中的至少一些实际上是可以连接至少一个肽部分的环。具有仅一个核酸链的纳米结构的一个优点是与包含若干核酸链的纳米结构相比，其产生起来甚至更容易且因此可能更便宜且更快速。另一优点为具有较少末端的核酸对降解更具抗性，因为大部分核酸酶是使核酸从其末端或双链中断口降解的核酸外切酶。仅包含一个末端的核酸可以例如通过使用连接酶将结构中极为接近的两个末端连接在一起而产生。或者，其可通过对每一纳米结构使用单一核酸来产生。
优选地，每个分支具有200nm、优选地100nm、更优选地50nm、甚至更优选地25nm、又更优选地10nm并且最优选地5nm的如最接近的分支点与分支的末端之间的距离所定义的最大长度。纳米结构的每个分支的长度还可以长度范围表示。因此，优选地，纳米结构的每个分支的长度在2nm与200nm之间，更优选地在3nm与100nm之间，甚至更优选地在3.5nm与50nm之间，又更优选地在4nm与25nm之间，最优选地在4.5nm与10nm之间并且又最优选地5nm。此外，核酸骨架的分支的长度可以属于其的核苷酸的数目表示。优选地，核酸骨架的分支长度为约5到50个，更优选约10到35个，并且最优选约10到25个核苷酸。
优选地，选择核酸骨架的分支中的每一个的长度以便提供具有结合其目标的最优结合几何形状的纳米结构。此外，优选地，核酸骨架的不同分支具有不同长度。然而，进一步优选地，核酸骨架的所有分支具有相同长度。
此外，优选地，选择核酸骨架的核酸序列以便提供刚性臂和柔性分支点。
术语“分支”和“臂”在本发明的纳米结构的情形下可互换地使用。
可以通过提供某一长度的双链分支获得刚性分支或臂。双链核酸核酸的刚度由材料术语“持续长度”定义。如果双链片段比持续长度短得多，那么其实际上是刚性的。如果其长得多，那么其实际上是柔性的。对于双链DNA，持续长度为50nm。技术人员将能够测量或计算纳米结构中所使用的任何其它核酸的持续长度。优选地，因此，分支中的每一个的长度是其持续长度的50％或更小，优选地40％或更小，更优选地35％或更小，甚至更优选地30％或更小，又更优选地25％或更小，并且最优选地20％或更小。
肽部分
优选地，与核酸骨架连接的至少两个肽部分各自与在呼吸道合胞病毒表面上表达的分子结合。优选地，与核酸骨架连接的至少两个肽部分各自在生理条件下以小于500μM的平衡解离常数(KD)与在呼吸道合胞病毒表面上表达的分子结合。优选地，此KD小于200μM，更优选地小于100μM，甚至更优选地小于50μM，又更优选地小于40μM，又更优选地小于30μM，并且最优选地小于25μM。
优选地，肽部分各自与RSV融合(F)糖蛋白结合。优选地，肽部分各自在生理条件下以30μM或更小、优选地20μM或更小、更优选地15μM或更小、甚至更优选地10μM或更小、又更优选地5μM或更小并且最优选地1μM或更小的KD与RSV融合(F)糖蛋白结合。
在一优选实施例中，在生理条件下，肽部分各自以10μM或更小的KD与RSV融合(F)糖蛋白结合，
用于测定平衡解离常数KD的方法在所属领域中是众所周知的(参见例如Memczak,H.等人《用于流感病毒结合抑制剂的抗血凝素抗体衍生的先导肽(Anti-Hemagglutinin Antibody Derived Lead Peptides for Inhibitors of Influenza Virus Binding)》.(2016)公共科学图书馆·综合(PLoS One)11)。举例来说，可使用表面等离子体共振测量。
在本文的上下文中“生理条件”广泛地应理解为其中正常肽、蛋白质和核酸以其天然形式存在，即其未变性的条件。技术人员能够针对本发明的每一肽、纳米结构和呼吸道合胞病毒确定这些条件是什么。生理条件一般为可在活生物体内发现或与活生物体相容的温和条件。广泛地，生理条件通常为pH温和(在5与9之间，但优选地在6与8之间)，盐浓度为约8克/升，且温度不超过60℃，但优选地，其不超过50℃或甚至更优选地40℃的条件。
优选地，肽部分中的每一个为13到25个氨基酸，更优选地14到22个氨基酸，甚至更优选地16到20个氨基酸并且最优选地18到19个氨基酸的肽。在任何情况下，优选的个别肽部分具有小于25，优选地小于22，更优选地小于20，并且最优选地小于15个氨基酸。举例来说，肽部分中的每一个为13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸的肽。
本发明纳米结构的优点中的一个为结构的肽组分与例如抗体相比通常较小。典型抗体的每条重链和轻链分别包含超过400个和超过200个氨基酸。因此，比较起来，本发明的纳米结构的肽部分一般较小。实际上，每个分支15个核苷酸和每个分支上一个肽的典型3分支结构为大约35kDa。这通常表示典型抗体尺寸的仅约五分之一。除了较高设计灵活性之外，此小尺寸使本发明的纳米结构可用抗体成本的一小部分产生。产生纳米结构的两个组分，即核酸链，尤其DNA，和短肽相对简单且便宜。肽部分可实际上优选地通过固相肽合成，优选地使用Fmoc策略或Boc策略产生。类似地，DNA链可以通过固相合成以高质量和数量产生。相比之下，抗体从动物或细胞培养物产生和回收。这是昂贵的，并且所述产生方法引起不同批次之间的潜在较大变化。相比而言，由于不涉及生物物质且因此可更紧密地控制每一产生参数，纳米结构的产生变化小得多。
优选地，纳米结构的至少两个肽部分各自与在RSV表面上表达的不同分子结合。优选地，当纳米结构携带多于两个肽部分时，肽部分中的每一个与在RSV的表面上表达的不同分子结合。然而，优选地，纳米结构的至少两个肽部分与在RSV表面上表达的相同分子(例如寡聚蛋白)结合。此外，优选地，纳米结构的所有肽部分与在RSV的表面上表达的相同分子结合。此外，优选地，给定纳米结构的所有肽部分是相同的。
在纳米结构上具有与相同分子结合的两个或更多个肽部分的优点在于纳米结构可受益于两个或更多个部分的协作结合作用。这允许纳米结构与病毒之间的更强结合，前提是不同肽部分之间的距离允许所述结合。与核苷酸骨架连接的肽部分越多，纳米结构与病毒的潜在结合亲和力越高，并且因此纳米结构在感染的治疗中的潜在作用越大，并且使用纳米结构检测病毒的方法的潜在灵敏度越好。本发明的纳米结构优于抗体的另一优点从而是其可允许与超过两种目标分子协作结合。
导致病毒抑制的机制为通过根据本发明的纳米结构连接的若干肽的结合。这产生阻止病毒结合或进入细胞的被阻断的病毒受体。
根据本发明的适当RSV结合肽的实例为包含以下或由以下组成的肽：SEQ ID NO:1、2、4和6到12中任一个所示的序列，或其肽模拟物或翻转-反向肽。其它实例可以包括来源于以下的肽：相对于全呼吸道合胞病毒粒子或在呼吸道合胞病毒表面上出现的特定蛋白，例如呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白的噬菌体呈现筛选，与呼吸道合胞病毒表面上的蛋白结合的肽的计算机模型化，或衍生自负责与病毒表面上的蛋白的结合相互作用的抗体的活性CDR区的序列的蛋白。
在一优选实施例中，肽部分包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1、2、4和6到12中的任一个所示的序列，或其肽模拟物或翻转-反向肽。
与核酸骨架连接的肽部分可以相同或可以不同。此外，优选地，与核酸骨架连接的所有肽部分可相同。
优选地，核酸骨架是分支的并且包含至少三个肽部分。此外，优选地，核酸骨架是分支的并且至少三个肽部分各自与核酸骨架的分支连接。此外，优选地，核酸骨架为分支的并且至少三个肽部分各自与核酸骨架的不同分支连接。
在一优选实施例中，核酸骨架是分支的，并且至少三个肽部分各自与核酸骨架的不同分支连接，优选地其中骨架的所有分支从单一接合点发出。
在另一优选实施例中，核酸骨架是分支的，并且至少三个肽部分各自与核酸骨架的不同分支连接，其中骨架的所有分支从单一接合点发出，并且其中核酸骨架的每个分支的长度为约10到25个核苷酸。
在另一优选实施例中，核酸骨架是分支的，并且三个肽部分各自通过肽部分的N端、肽部分的C端或通过氨基酸侧链与核酸骨架的不同分支连接。
DNA结构的设计过程
DNA结构可以通过如WO 2018/215660中所描述的方法或通过所属领域的技术人员已知的任何方法来设计。
在另一优选实施例中，本发明的纳米结构的特征进一步在于
-所述核酸骨架的核酸在足够长度上是双链的以在生理条件下保持稳定，所述骨架的核酸链中的每一个由选自下组的核酸构成：DNA和其化学稳定化的变异体、RNA和其化学稳定化的变异体、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和异核酸(XNA)，
-在生理条件下，所述肽部分各自以10μM或更小的KD与RSV融合(F)糖蛋白结合，
-所述肽部分包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1到16中任一个所示的序列，或其翻转-反向肽，
-所述核酸骨架是分支的，并且至少三个肽部分各自与所述核酸骨架的不同分支连接，优选地其中所述骨架的所有分支从单一接合点发出，
-所述核酸骨架是分支的，并且至少三个肽部分各自与所述核酸骨架的不同分支连接，其中所述骨架的所有分支从单一接合点发出，并且其中所述核酸骨架的每个分支的长度为约10到25个核苷酸，和/或
-所述核酸骨架是分支的，并且三个肽部分各自通过所述肽部分的N端、所述肽部分的C端或通过氨基酸侧链与所述核酸骨架的不同分支连接，
其中所述纳米结构任选地进一步包含可检测标记。
在另一实施例中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构，和任选一种或多种药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
术语“药学上可接受的佐剂”在其最广泛意义上理解为包括自身具有极少或无药理学作用，但当同时给药时可增加其它药物的功效或效力的药物。
适合的赋形剂为例如水、蛋白酶抑制剂、肽酶抑制剂、核酸酶抑制剂或能够裂解本发明的肽或纳米结构的任何酶，以及缓冲化合物，如磷酸盐、Tris或HEPES。药物组合物可进一步包含稳定剂，尤其，其中组合物为水性液体，如水性溶液。其它适合药学上可接受的佐剂、赋形剂和稳定剂为所属领域的技术人员众所周知。
药物组合物可进一步包含靶向RSV的相同或不同蛋白的额外病毒抑制剂、用于治疗呼吸道感染的其它活性剂和/或一般抗病毒剂。适合的额外活性剂为例如抗体，如帕利珠单抗。药物组合物可进一步包含用于(预防性)治疗细支气管炎、肺炎、哮喘和/或急性中耳炎的额外活性剂，如雾化高渗盐水或沙丁胺醇。适合的活性剂或一般抗病毒剂为所属领域的技术人员众所周知的。
在另一实施例中，本发明涉及一种核酸，其包含编码本发明所述的肽，尤其由天然蛋白原性氨基酸组成的肽的序列。
在又一实施例中，本发明涉及本发明所述的肽，或本发明所述的纳米结构，或本发明所述的药物组合物，或本发明所述的核酸，其用作药物。
在本发明的含义中，“用作药物”可以在最广泛意义上理解为使用本发明所述的肽，或本发明所述的纳米结构，或本发明所述的药物组合物，或本发明所述的核酸以治疗疾病或病状，但也作为预防治疗或用于改善。优选地是用于治疗呼吸道感染。优选地，本发明的纳米结构用于治疗呼吸道合胞病毒(RSV)感染。
在另一实施例中，本发明涉及本发明所述的肽，或本发明所述的纳米结构，或本发明所述的药物组合物，或本发明所述的核酸，其用于治疗、预防治疗或改善呼吸道合胞病毒(RSV)感染。
确切地说，实例9和图11中的数据表明本发明的肽在生物条件下在长时间内稳定。肽从而尤其可用于人类和哺乳动物体内应用，用于治疗性和预防性目的。
实例9和图11展现本发明的肽尤其可用于预防治疗RSV感染。
此外，关于在RSV施加之前用本发明的肽预处理细胞的实例7和图9中的数据表明本发明的肽可用于预防治疗RSV感染。
在又一实施例中，本发明涉及一种治疗、预防治疗或改善有需要的受试者的呼吸道合胞病毒(RSV)感染的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本发明所述的肽，或本发明所述的纳米结构，或本发明所述的药物组合物，或本发明所述的核酸。
确切地说，本发明的肽和纳米结构可用于抑制RSV进入哺乳动物细胞中。在一个优选实施例中，本发明的肽和纳米结构可用于在体外抑制RSV进入哺乳动物细胞中。在一个优选实施例中，本发明的肽和纳米结构可用于在体内抑制RSV进入哺乳动物细胞中。
此外，本发明的肽和纳米结构可用于抑制RSV扩散。在一个优选实施例中，本发明的肽和纳米结构可用于在体外抑制哺乳动物细胞中的RSV扩散。在一个优选实施例中，本发明的肽和纳米结构可用于在体内抑制哺乳动物中的RSV扩散。
因此，在一个优选实施例中，通过抑制RSV进入哺乳动物细胞和/或通过抑制哺乳动物体内RSV扩散来治疗、预防治疗或改善呼吸道合胞病毒(RSV)感染。
术语“治疗”可以在最广泛意义上理解为用本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸治疗的受试者已经感染呼吸道合胞病毒。治疗可以在感染的任何阶段进行，例如在潜伏期间或当呼吸道合胞病毒(RSV)感染的症状可见或在疾病进行中时或当感染几乎消退或已变得慢性时。
术语“预防治疗”可以在最广泛意义上理解为用本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸治疗的受试者未感染呼吸道合胞病毒。预防治疗的意图可以是预防感染。
术语“改善”可以在最广泛意义上理解为受感染受试者的病状的任何改进，例如经治疗受试者中的症状的减少或RSV的病毒负荷的减少。
受试者可以是任何哺乳动物，包括人类。优选地，受试者为人类。
本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸可以任何方式施用，包括但不限于经口服、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜、局部、通过吸入、通过经颊或鼻内或其组合施用。肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下和肌肉内。在一优选实施例中，根据常规程序将组合物配制为适于鼻内或静脉内施用到人类的药物组合物。
通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因(lidocaine)，以使注射部位处的疼痛减轻。一般来说，成分单独地或混合在一起以单位剂型来供应，例如呈在指示活性剂的数量的气密密封式容器，如安瓿或药囊中的干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。在组合物将通过输注施用的情况下，其可用含有无菌药用级水或生理盐水的输注瓶施配。在组合物通过注射施用的情况下，可提供用于注射的无菌水或生理盐水的安瓿以使得可在施用之前混合成分。
优选地，本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明的核酸经配制用于鼻内施用。肽、纳米结构和药物组合物可以配制为例如作为鼻用滴剂的液体形式、喷雾或适合于吸入、粉末、乳膏或乳液。对于直接施加，肽、纳米结构或药物组合物优选地在适合于以鼻用滴剂或气雾剂形式分配肽或纳米结构的容器中供应。
在一更优选实施例中，本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明的核酸通过吸入或喷雾施用。
优选地，本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸经配制用于向受试者肺部施用的方法，所述方法包括：分散包含本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸的干粉组合物或可吸入配制物，以形成气雾剂；并且通过受试者吸入气雾剂将气雾剂递送到受试者的肺部，从而确保向受试者的肺部递送根据本发明的化合物。通常，气雾剂递送到受试者气道的支气管内空间。
举例来说，本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的本发明的核酸通过干粉吸入器或通过定剂量吸入器递送。
本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明的本发明所述的核酸可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括由游离羧基形成的那些盐，如衍生自以下的那些盐：盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等；由游离胺基形成的那些盐，如衍生自以下的那些盐：异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等；和衍生自以下的那些盐：钠、钾、铵、钙和氢氧化铁等。
将在治疗特定病症或病状中有效的本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸的量将取决于病症或病状的性质，并且可以通过标准临床技术确定。另外，可以任选地采用体外分析以帮助识别最优剂量范围。配制物中采用的确切剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应根据医师判断和每个患者的情况来决定。
然而，用于静脉内施用的适合剂量范围一般为约20到500微克活性化合物/千克体重。用于鼻内施用的适合剂量范围一般为约0.01pg/kg体重到1mg/kg体重。有效剂量可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推。
在整个本发明中，术语“有效量”意指以足以获得所要治疗效果的量施用给定分子或化合物。
在又一实施例中，本发明涉及本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸作为体外RSV抗病毒剂的用途。
术语“体外”可以在最广泛意义上理解为使用在生物情境外，例如，在受试者的身体外或以从其生物情境分离的样品进行。体外使用可例如在实验室器具，如试管、烧瓶、皮氏培养皿(Petri dish)和微量滴定板中进行。其它适合的体外使用为所属领域的技术人员众所周知。
术语“RSV抗病毒剂”可以在最广泛意义上理解为本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构或本发明所述的药物组合物或本发明所述的核酸靶向RSV和/或其组分中的至少一种，如呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白。
在一优选实施例中，用作RSV抗病毒剂是通过抑制RSV进入哺乳动物细胞和/或通过抑制哺乳动物细胞中的RSV扩散来实现。
在再一实施例中，本发明涉及本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构作为检测RSV的体外诊断剂的用途。
术语“诊断剂”可以在最广泛意义上理解为适合于检测RSV和/或区分此病毒与其它病毒或感染的试剂。体外诊断剂通常应用于体外环境，例如从受试者收集的样品，如上文所描述。从受试者收集样品的方法为所属领域的技术人员众所周知。
术语“检测RSV”可以在最广泛意义上理解为包括RSV的定性和定量测量。定性测量可以在最广泛意义上理解为测量样品中任何完整RSV和/或其组分中的一种，如呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白的存在。然而，检测也可作为样品的定量测量进行，其中测定此样品的病毒负荷和/或样品中RSV组分，如呼吸道合胞病毒融合(F)糖蛋白的数目。
在另一实施例中，本发明涉及本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构，其用于诊断呼吸道合胞病毒(RSV)感染。
术语“诊断RSV感染”可以在最广泛意义上理解为察看是否有呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起受试者的症状和病征。RSV感染的诊断可以通过检测体内RSV的存在进行。诊断可以在体内或体外进行。
体内诊断可例如用适合放射性同位素进行。适合的用于标记的放射性同位素和用所述放射性标记来标记本发明的化合物的方法为技术人员已知。举例来说，可使用以下同位素中的一种：64Cu、14C、3H、32P、33P、123I、125I和131I。
在一个优选实施例中，可以使用正电子发射断层扫描(PET)进行体内诊断。
举例来说，64Cu标记的肽可以用于ImmunoPET以用于体内检测和体内诊断目的。举例来说，肽可以用PEG部分，如直链10kDa聚(乙二醇)(PEG)16通过标准琥珀酰亚胺酯-氨基化学和适合螯合剂，如螯合剂DOTA NHS(单1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)修饰。此外，缀合物可以与氯化铜(II)-64一起培育以用于放射性标记，如以下所描述：Santangelo,P.J.等人(《全身immunoPET揭露在病毒血症和抗逆转录病毒疗法处理的猕猴中的活性SIV动力学》；《自然方法》第12,5卷(2015):427-32.doi:10.1038/nmeth.3320)。
或者，可使用另外已知的体内成像方法，如磁共振成像，例如使用超顺磁粒子或顺磁离子，如Gd3 ，或
术语“体内”可以在最广泛意义上理解为诊断对受试者进行，例如在其身体上或其生物情境下。RSV感染的诊断可以通过使用本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构检测受试者中RSV的存在来进行。
如上文所描述对来自生物情境的样品执行体外诊断。通常从相关受试者收集体外诊断所需的样品。用于收集样品的方法为所属领域的技术人员众所周知。RSV感染的诊断可以通过使用本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构检测已经从受试者取得的样品中RSV的存在来进行。
诊断可例如包括各种信息片段的关联，随后模式的辨识和区分。
在另一实施例中，本发明涉及一种检测呼吸道合胞病毒是否存在于样品中的方法，其包括以下步骤：
a.向所述样品中添加适当量的本发明所述的肽或本发明所述的纳米结构，其中所述肽或所述纳米结构的肽部分在生理条件下与表达于待检测的RSV病毒的表面上的融合(F)糖蛋白结合；
b.在生理条件下培育在a.中获得的混合物；和
c.检测所述肽或纳米结构是否已与所述病毒的所述表面结合，其中所述纳米结构与所述病毒的结合指示所述样品中所述病毒的存在。
RSV的存在的检测可取决于所使用的检测方法和检测装置的检测极限。
所述方法中的样品可为已从受试者取得的样品。因此，此方法可以用于诊断RSV感染。当对样品进行所述方法时，所述方法体外进行。
步骤a.
本发明的肽或纳米结构可以使用所属领域的技术人员已知的普通实验室器具，如移液管添加。
在步骤a中将“适当量”的本发明所述的肽或纳米结构添加到样品中包括当与在生理条件下在RSV表面上表达的融合(F)糖蛋白结合时足以引起可检测信号的量的样品。由于各种检测方法和检测装置具有不同检测极限，因此适当量可变化。所属领域的技术人员通常知道适合的检测方法和检测装置，且可相应地调适肽或纳米结构的适当量。
举例来说，本发明的肽可以5到100μM、优选地10到80μM、更优选地15到60μM并且最优选地20到40μM的浓度添加。
上文描述了在本发明的上下文中且在此方法中使用的术语“生理条件”。关于此实施例，生理条件可不仅取决于病毒和肽或纳米结构所需的环境条件，而且还尤其取决于研究样品。
步骤b.
培育条件对应于针对步骤a所描述的生理条件。优选地，培育时间为1小时到7天，优选地24小时到5天，又更优选地40小时到72小时，最优选地约48小时。
步骤c.
对纳米结构是否已经结合到病毒表面的检测可进一步例如通过微量热泳(MST)或一些其它适当方式检测病毒表面上的纳米结构的核酸来进行。
可使用的其它分析为无标记检测分析，例如表面等离子体共振(SP)或石英晶体微天平(QCM)；表面声波(SAW)，其中直接检测与用纳米结构修饰的表面的病毒结合；电化学检测，例如病毒与定位于叉指电极之间的纳米结构结合时的阻抗变化；报告子(H RP，荧光团)缀合核酸分析；酶联免疫吸附分析(ELISA)；荧光淬灭，病毒与染料标记的纳米结构的结合影响荧光的情况下；或基于条带的免疫诊断测试(例如，在纸上)。所属领域的技术人员将能够在每一情况下确定何为最适当检测方法。
优选地，使用感染抑制分析，更优选地，基于RSV的斑块减少分析。在HEp-2细胞接种之后24小时，细胞感染RSV和抑制剂(肽-缀合DNA纳米结构)并且培育约24到72小时，优选48小时。可以例如通过使用RSV特异性抗体免疫细胞化学染色之后对病毒斑块计数来测试宿主细胞的病毒感染。
适合的感染抑制分析例如基于或为发色染色。举例来说，可以使用免疫细胞化学染色或酶分析。举例来说，可使用例如酶联免疫吸附分析(ELISA)的技术。
用于产生本发明的纳米结构的DNA链的方法为所属领域的技术人员众所周知。举例来说，本发明的纳米结构的DNA链可以通过固相合成产生。肽部分可以如上文所描述，例如通过固相肽合成，优选地使用Fmoc策略或Boc策略来产生。所属领域的技术人员已知其它方法。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。尽管在本发明的实践中可以使用类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但本文描述优选的方法和材料。此外，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，且并不打算限制本发明的范围。
如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数指代物。类似地，词语“包含”、“包括”、“含有”和“涵盖”应被包含性地而不是排他性地解释。类似地，除非上下文另外明确指示，否则词语“或”打算包括“和”。术语“多个”是指两个或更多个。
以下附图和实例打算说明本发明的各种实施例。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。所属领域的技术人员将显而易见，可在不脱离本发明的范围的情况下得到各种等效物、进行改变和修改，且由此应理解所述等效实施例将包括在本文中。
图例
图1：所用抑制实验的流程。人上皮细胞(HEp-2)上的RSV斑块减少分析。在感染之前24小时将HEp-2细胞接种于96孔板中(左)。第二天，细胞感染RSV(中间，白色箭头)。同时，将浓度20μM的肽添加到细胞(中间，黑色箭头)。通过使用RSV特异性单克隆抗体免疫细胞化学染色之后对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性(右，黑格箭头)。
图2：体外截短肽针对RSV的抗病毒活性。图在其y轴上展示各种不同截短肽的序列，各自由其自己的条表示。x轴显示相较于对应DMSO对照组的感染百分比。感染水平由相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±(标准差)SD产生的每一条表示。
图3：体外LVVSTTYLPHYFDN肽针对RSV的抗病毒活性。在图3A中，测定针对RSV(ATCC VR-26-长病毒株(Long strain))的抗病毒活性。在斑块减少分析中，细胞用肽(顶部行)或作为对照组的DMSO(底部行)处理。添加到细胞的肽浓度从左到右：80μM，40μM和20μM。通过使用RSV特异性单克隆抗体免疫细胞化学染色之后对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。在图3B中，定量肽LVVSTTYLPHYFD针对RSV(ATCC VR-26-长病毒株)的抗病毒活性。图的x轴展示以μM为单位的肽浓度(从左到右：10μM，20μM，40μM和80μM)。y轴展示呈百分比的相较于DMSO对照组的感染率的每一样品的感染率。通过使用RSV特异性单克隆抗体免疫细胞化学染色之后对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。感染水平由相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±(标准差)SD产生的每一条表示。
图4：LVVSTTYLPHYFDN肽的丙氨酸扫描。图在其y轴上展示肽的序列，各自由其自己的条表示。无变化的LVVSTTYLPHYFDN肽在顶部。下方为其中从上到下LVVSTTYLPHYFDN的位置1到14用丙氨酸置换(以“A”标记)的序列。x轴显示相较于对应DMSO对照组的感染百分比。感染水平由相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±(标准差)SD产生的每一条表示。
图5：具有非天然氨基酸修饰的肽的体外抗病毒活性。所用肽序列在图右上的关键词中列出。每一序列左边方块中的图案对应于条中使用的图案。图的x轴展示以μM为单位的所应用的对应肽的肽浓度。y轴展示呈百分比的相较于对应DMSO对照组的感染率的每一样品的感染率。感染水平由相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±SD产生的每一条表示。
图6：新颖DNA-肽构建体与RSV的结合。图6A展示所用ELISA的流程，从左到右进行。单一化合物不呈代表性尺度。TMB＝3,3',5,5'-四甲基联苯胺，HRP＝辣根过氧化酶。图6B展示与DNA偶合的肽6和肽12的ELISA结果。图的x轴表示不同样品，y轴展示吸光度。“仅抗RSV抗体”和“抗RSV抗体 RSV”表示内部ELISA对照组和不具有图6A中所描述的组分。其它三个样品具有图6A中所描述的所有组分。每一条由一式三份平均值±SD产生。
图7：体内肽的鼻内施用对RSV感染的作用。图的x轴展示不同小鼠组，同时y轴展示呈RSV拷贝/45ng总RNA的小鼠肺中的病毒负荷。每个数据点表示单一小鼠：朝上的半填充三角形各自表示模拟处理对照小鼠，朝下的填充三角形各自表示接受肽6的小鼠，且方块各自表示接受肽12的小鼠。几何平均值以条给出。显著差异通过单因素方差分析(One-Way ANOVA)随后图基检验(Tukey test)(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)计算。LOD：检测极限。在本实验中，LOD为50个RSV拷贝。
图8：RSV抑制性环肽的体外抗病毒功效。在分析之前24小时将人上皮细胞(HEp-2)接种于96孔细胞培养板(104个细胞/孔)。序列在图中展示的肽(具有序列CETALVVSTTYLPHYFDNC；SEQ ID No:46的肽的环肽)或对应量的DMSO媒剂对照物与RSV混合，在37℃下培育10分钟且随后添加到细胞。细胞上的最终浓度为0.625-80μM。通过对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。展示相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±SD。
图9：用RSV抑制性肽预处理细胞的作用。在分析之前24小时将人上皮细胞(HEp-2)接种于96孔细胞培养板(104个细胞/孔)。序列为Ac-LVVSTTYLPHYFDN-NH2(SEQ ID No:5)的肽或对应量的DMSO媒剂对照物在指示浓度下施加于细胞且在37℃下培育3小时。培育之后，细胞保持在相同培养基中或洗涤且将培养基更换成新鲜的。随后，将RSV施加于细胞。通过对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。展示相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±SD。
图10：肽-DNA三聚体针对RSV感染的体外抗病毒功效。带有三个肽抑制剂臂的DNA三聚骨架经合成以一次性靶向所有三个RSV-F次单元。为测试构建肽[Chg][Cpa]VSTT[Tyr3,5-I2]LPHYFDN(SEQ ID No:11)-DNA三聚体相比于未经修饰DNA-三聚体(无结合肽)的抗病毒活性，在分析之前24小时将人上皮细胞(HEp-2)接种于96孔细胞培养板(104个细胞/孔)。DNA构建体或对应量的DMSO媒剂对照物与RSV混合，在37℃下培育10分钟且随后添加到细胞。细胞上的最终浓度为0.009-1.25μM。通过对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。展示相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±SD。
图11：HEp-2细胞上RSV抑制性肽的体外预防作用。在分析之前24小时将人上皮细胞(HEp-2)接种于96孔细胞培养板(104个细胞/孔)。在RSV感染之前，细胞用浓度20μM的序列展示于图中(SEQ ID No:9)的肽或对应量的DMSO媒剂对照物在指示时间点处理。通过对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。展示一式三份平均值±SD。
图12：通过动态光散射的聚集检测。A)肽[Chg][Cpa]VSTT[Tyr3,5-I2]LPHYFDN(SEQ ID No:11)的测量。展示显示为按数目的尺寸分布的1×PBS、10mM MgCl2、0.05％Tween20缓冲液中浓度50μM(曲线1)和两次100μM(曲线2和3)下的测量结果。B)与30bp双链DNA连接的肽[Chg][Cpa]VSTT[Tyr3,5-I2]LPHYFDN(SEQ ID No:11)的测量。展示显示为按数目的尺寸分布的1×PBS、10mM MgCl2、0.05％Tween20缓冲液中浓度0.12μM(曲线1)和1μM(曲线2)下的测量结果。
实例
实例1-肽抑制剂的合理设计和体外筛选
为识别RSV抑制所需的最小肽序列，设计具有重叠序列的一系列20种肽以靶向F蛋白的融合前构象上的抗原性位点()。
如图1中所说明，所设计肽经合成且在基于细胞培养物的斑块减少分析中针对其针对RSV的抑制活性筛选。详细地说，如下在斑块减少分析中评估抗RSV活性：在感染之前24小时将HEp-2细胞接种于96孔板。第二天，细胞感染RSV(ATCC VR-26-长病毒株)。同时，将浓度20μM的肽添加到细胞。通过使用RSV特异性单克隆抗体免疫细胞化学染色之后对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。
具有以下序列的14个氨基酸长的肽：LVVSTTYLPHYFDN经识别能够抑制人上皮细胞上的RSV感染(图2)。
实例2-基于肽浓度的抗RSV活性的测定
在斑块减少分析中评估抗RSV活性。在感染之前24小时将HEp-2细胞接种于96孔板中。第二天，细胞感染RSV-长(图3A和3B)。同时，将浓度10-80μM的肽添加到细胞。通过使用RSV特异性抗体免疫细胞化学染色之后对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。
具有以下序列的14个氨基酸长的肽：LVVSTTYLPHYFDN经识别能够在20μM的浓度下将人上皮细胞上的RSV感染抑制>50％(图3B)。
因此，将具有以下序列的肽：LVVSTTYLPHYFDN选择为用于开发RSV感染抑制剂的先导肽候选物。
实例3-结构-活性关系研究
为了研究个别氨基酸在抑制功能中的作用，进行先导肽的丙氨酸筛选突变诱发(图4)。
详细地说，在斑块减少分析中评估抗RSV活性。在感染之前24小时将HEp-2细胞接种于96孔板中。第二天，细胞感染RSV(约100PFU/孔)。同时，将浓度20μM的肽添加到细胞。在感染后48小时使用RSV特异性抗体免疫细胞化学染色之后对病毒斑块计数。
如图4中所展示，识别出7个涉及针对RSV的抑制活性的关键aa-残基。当这些残基被丙氨酸替换时观测到RSV抑制的显著减少，而剩余7个氨基酸的替换不改变天然肽活性。
实例4-非天然氨基酸的并入
使用肽作为抗病毒剂的主要问题为其低稳定性和快速蛋白酶降解，这可限制其治疗价值。为提高先导肽的稳定性，在多个位置将不同非天然氨基酸引入其序列。非天然氨基酸修饰的肽对蛋白水解裂解抗性更大，且提供体内半衰期和活性的提高。
接下来，在斑块减少分析中评估抗RSV活性。在感染之前24小时将HEp-2细胞接种于96孔板中。浓度10-80μM的肽在37℃下与RSV一起培育10分钟且随后添加到细胞。在感染后48小时使用RSV特异性抗体免疫细胞化学染色之后对病毒斑块计数。图5展示相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±SD(图5)。
发现具有不同非天然氨基酸替换的类似肽保持抗病毒活性(图5)。若干选择的肽候选物进一步体内测试。
新开发的肽6(Ac-[Chg][Cpa]VSTT[Tyr3,5-I2]LPHYFDN-NH2)和12(Ac-[Chg][Nle][Chg]STTYLPHYFDN-NH2)与活性RSV的结合通过酶联免疫吸附分析验证(图6)。
图6A说明所用ELISA的流程。必须注意，单一化合物不呈代表性尺度。与DNA偶合的肽6和肽12的ELISA结果展示于图6B中且揭露RSV强烈地与DNA-肽构建体但非DNA(30bp DNA)相互作用。RSV和/或RSV-抗体与中性抗生物素蛋白的非特异性结合通过使用两个其它对照组排除。
实例5-体内评价
此外，测试设计的肽在体内挑战实验中提供保护的能力。雌性BALB/c小鼠感染RSV且同时用150μg肽处理。感染后五天，定量小鼠肺中的病毒负荷。当相比于模拟处理对照组，用所测试肽处理(图7)都引起处理小鼠肺中病毒负荷的显著减少(1/100-1/1000倍)。
详细地说，9周龄雌性BALB/c小鼠(n＝5/组)同时通过鼻内途径接种106PFU/小鼠的RSV-长病毒株(ATCC VR-26-长病毒株)和150μg的肽6或12。对照组小鼠接受RSV与DMSO-PBS。小鼠在感染后5天处死，且收集其肺。通过RT-qPCR定量肺中的病毒负荷。
结果(图7)揭露设计的肽在体内有效且抑制RSV复制。
实例6-RSV抑制性环肽的体外抗病毒功效.
在分析之前24小时将人上皮细胞(HEp-2)接种于96孔细胞培养板(104个细胞/孔)。序列在图8中展示的肽(环肽CETALVVSTTYLPHYFDNC；SEQ ID No:46)或对应量的DMSO媒剂对照物与RSV混合，在37℃下培育10分钟且随后添加到细胞。细胞上的最终浓度为0.625-80μM。通过对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。结果展示于图8中。展示相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±SD。
结果表明本发明的肽的环化不会不利地影响体外抗病毒活性。
实例7-用RSV抑制性肽预处理细胞的作用.
在分析之前24小时将人上皮细胞(HEp-2)接种于96孔细胞培养板(104个细胞/孔)。序列为Ac-LVVSTTYLPHYFDN-NH2(SEQ ID No:5)的肽或对应量的DMSO媒剂对照物在指示浓度下施加于细胞且在37℃下培育3小时。培育之后，细胞保持在相同培养基中或洗涤且将培养基更换成新鲜的。随后，将RSV施加于细胞。通过对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。结果展示于图9中。展示相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±SD。
结果展现本发明的肽可用于预防治疗RSV感染。
实例8-肽-DNA三聚体针对RSV感染的体外抗病毒功效.
带有三个肽抑制剂臂的DNA三聚骨架经合成以一次性靶向所有三个RSV-F次单元。为测试构建肽[Chg][Cpa]VSTT[Tyr3,5-I2]LPHYFDN(SEQ ID No:11)-DNA三聚体相比于未经修饰DNA-三聚体(无结合肽)的抗病毒活性，在分析之前24小时将人上皮细胞(HEp-2)接种于96孔细胞培养板(104个细胞/孔)。DNA构建体或对应量的DMSO媒剂对照物与RSV混合，在37℃下培育10分钟且随后添加到细胞。细胞上的最终浓度为0.009-1.25μM。通过对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。结果展示于图10中。展示相对于对应DMSO对照组标准化的一式三份平均值±SD。
结果展现本发明的纳米结构展现针对RSV的抗病毒活性且可用于治疗、预防治疗或改善RSV感染。
实例9-HEp-2细胞上RSV抑制性肽的体外预防作用.
在分析之前24小时将人上皮细胞(HEp-2)接种于96孔细胞培养板(104个细胞/孔)。在RSV感染之前，细胞用浓度20μM的序列展示于图12中(SEQ ID No:9)的肽或对应量的DMSO媒剂对照物在指示时间点处理。通过对病毒斑块计数在感染后48小时测定抑制活性。结果展示于图11中。展示一式三份平均值±SD。
结果展现本发明的肽可用于预防治疗RSV感染。确切地说，数据展现肽在生物条件下在长时间内稳定。肽从而可用于人类和哺乳动物体内应用，用于治疗性和预防性目的。
实例10-通过动态光散射的聚集检测.
A)肽[Chg][Cpa]VSTT[Tyr3,5-I2]LPHYFDN(SEQ ID No:11)的测量。结果展示于图12A中。
展示显示为按数目的尺寸分布的1×PBS、10mM MgCl2、0.05％Tween20缓冲液中浓度50μM(曲线1)和两次100μM(曲线2和3)下的测量结果。
B)与30bp双链DNA连接的肽[Chg][Cpa]VSTT[Tyr3,5-I2]LPHYFDN(SEQ ID No:11)的测量。结果展示于图12A中。展示显示为按数目的尺寸分布的1×PBS、10mM MgCl2、0.05％Tween20缓冲液中浓度0.12μM(曲线1)和1μM(曲线2)下的测量结果。
结果表明本发明的纳米结构中肽与DNA骨架的连接可通过消除聚集增加肽体内生物可用性。
参考文献
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序列表
<110> 弗劳恩霍夫应用研究促进协会
<120> 抑制呼吸道合胞病毒感染的生物及合成分子
<130> F72325PC
<150> DE 102019110314.2
<151> 2019-04-18
<160> 46
<170> PatentIn 3.5 版
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含13个氨基酸的本发明的肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Leu、Val或Ile, 或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Val或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(3)
<223> Val或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (4)..(4)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (5)..(5)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (6)..(6)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (7)..(7)
<223> Tyr或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (8)..(8)
<223> Leu、Val或Ile, 或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (9)..(9)
<223> Pro或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (10)..(10)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (11)..(11)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (12)..(12)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (13)..(13)
<223> Asp或Glu, 或者其天然或非天然类似物
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括14个氨基酸的本发明的肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Leu、Val或Ile, 或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Val, 或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(3)
<223> Val, 或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (4)..(4)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (5)..(5)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (6)..(6)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (7)..(7)
<223> Tyr或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (8)..(8)
<223> Leu、Val或Ile, 或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (9)..(9)
<223> Pro或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (10)..(10)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (11)..(11)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (12)..(12)
<223> 天然或非天然氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (13)..(13)
<223> Asp或Glu, 或者其天然或非天然类似物
<220>
<221> 位点
<222> (14)..(14)
<223> 天然或非天然氨基酸
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有13个氨基酸的参考肽
<400> 3
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 4
Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有14个氨基酸的参考肽
<400> 5
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图5的肽
<400> 6
Val Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图5的肽
<400> 7
Ile Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图5的肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Abu
<400> 8
Xaa Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图5的肽
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(3)
<223> Chg: 2-氨基-2-环己基乙酸
<400> 9
Leu Val Xaa Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图5的肽
<220>
<221> 位点
<222> (7)..(7)
<223> TYR3-I
<400> 10
Leu Val Val Ser Thr Thr Xaa Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图5的肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Chg: 2-氨基-2-环己基乙酸
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Cpa: 氰基-丙酸氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (7)..(7)
<223> TYR3,5-I2
<400> 11
Xaa Xaa Val Ser Thr Thr Xaa Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图5的肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Chg: 2-氨基-2-环己基乙酸
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Nle
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(3)
<223> Chg: 2-氨基-2-环己基乙酸
<400> 12
Xaa Xaa Xaa Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 13
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Asn
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 14
Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 15
Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 16
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp
1 5 10 15
<210> 17
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 参考肽
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Arg Asn Tyr
20 25 30
Ile Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile His Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100 105 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
225 230
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 18
Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 19
Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 20
Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 21
Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 22
Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 23
Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 24
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 25
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 26
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 27
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 28
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 29
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 30
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图2的肽
<400> 31
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser
1 5
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 32
Ala Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 33
Leu Ala Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 34
Leu Val Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 35
Leu Val Val Ala Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 36
Leu Val Val Ser Ala Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 37
Leu Val Val Ser Thr Ala Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 38
Leu Val Val Ser Thr Thr Ala Leu Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 39
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Ala Pro His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 40
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Ala His Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 41
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro Ala Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 42
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Ala Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 43
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Ala Asp Asn
1 5 10
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 44
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Ala Asn
1 5 10
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图4的肽
<400> 45
Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp Ala
1 5 10
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图8的肽
<400> 46
Cys Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe
1 5 10 15
Asp Asn Cys
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
