一种含甲基营养型芽孢杆菌的有机活性基质及其制备方法与流程

1.本发明涉及农业的技术领域，具体涉及一种含甲基营养型芽孢杆菌的有机活性基质及其制备方法。


背景技术：

2.农作物秸秆和废弃的蘑菇菌糠数量很多，是目前亟待解决的农业废弃物。基质栽培技术因其省工省力、优质高效等优点正被普遍使用，但基质栽培设施一次性投入较大，且密闭空间内病害发生难以控制，如何将农业废弃物和生防菌结合起来，有效转化为防病有机活性基质，是急需解决的问题。


技术实现要素：

3.针对现有技术中没有关于甲基营养型芽孢杆菌和蘑菇菌糠复合利用的问题，本发明提供一种含甲基营养型芽孢杆菌的有机活性基质及其制备方法，以解决上述问题。本发明利用了申请人前期筛选到一株甲基营养型芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus)knk-1，保藏编号为cgmcc no.16842，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年12月11日，该甲基营养型芽孢杆菌为knk-1已公开于中国专利申请201910183156.0中。平板对峙培养结果表明，该菌对土传病原真菌串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)、灰霉菌(botrytis cinerea)、立枯丝核菌(rhizotonia solani)和引起芹菜黑斑病的交链孢霉(alternaria alternata)具有很好的生防效果。黄瓜盆栽试验结果表明，该菌株能够有效促进黄瓜植株的生长，同时能够在植株根际大量定殖。本发明充分发挥微生物菌促进植物生根、减少病害的特性，利用发酵工程技术将蘑菇菌糠、微生物菌剂、畜禽粪便等有机融合，制备具有微生物活性高、持续有机肥力供给的基质，并成功用于蔬菜育苗。
4.本发明的技术方案为：
5.一种含甲基营养型芽孢杆菌和蘑菇菌糠的有机活性基质，包括甲基营养型芽孢杆菌和蘑菇菌糠发酵物。
6.优选的，所述甲基营养型芽孢杆菌knk-1(bacillus methylotrophicus)，保藏编号为：cgmcc no：16842，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2018年12月11日。此菌株公开于申请人的在先申请(申请号201910183156.0)中。
7.优选的，所述有机活性基质中，甲基营养型芽孢杆菌knk-1的活菌数量≥1.00
×
108cfu/g。
8.一种含甲基营养型芽孢杆菌和蘑菇菌糠的有机活性基质的制备方法，具体步骤如下：
9.(1)将甲基营养型芽孢杆菌knk-1接种到lb培养液中，30℃下，180rpm/min培养24h，得到种子液，浓度为108cfu/ml；
10.(2)用不锈钢发酵罐六连罐对菌株knk-1进行发酵，发酵培养基为糖蜜培养基，装
液量为发酵罐容量的2/3，接种量为6％，温度30℃，搅拌速度为300rpm/min，通气量3l/min，发酵时间2天，得到发酵液；
11.(3)成品粉剂制备：向步骤(2)制备的发酵液中加入硅藻土吸附菌体后，再加入羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、吐温80和黄原胶，混合粉碎后得可湿性粉剂；
12.(4)畜禽粪便处理：收集新鲜畜禽粪便；
13.(5)饼肥处理：将花生饼或芝麻饼或豆饼粉碎，过2mm筛子；
14.(6)将作物秸秆放入粉碎机中进行粉碎，然后与蘑菇菌糠、新鲜畜禽粪便和饼肥于腐熟坑中腐熟，得腐熟物料；蘑菇菌糠、新鲜畜禽粪便和饼肥在腐熟坑内自然腐熟，无需刻意添加微生物；
15.(7)将步骤(6)的腐熟物料与普通育苗基质混合均匀；再加入步骤(3)制成的knk-1成品粉剂，得到含甲基营养型芽孢杆菌和蘑菇菌糠的有机活性基质。
16.优选的，所述步骤(2)中，每1l糖蜜培养基含有以下成分：100ml糖蜜、1g氯化钠、3g尿素，加水定容至1000ml。
17.优选的，所述步骤(3)为：向步骤(2)制备的发酵液中加入10％载体硅藻土(含0.5％葡萄糖)，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体；24h后室温干燥，加入4％羧甲基纤维素钠、7％聚乙烯醇、3.5％吐温80和0.5％黄原胶混合，气流粉碎机粉碎，过325目筛，获得knk-1可湿性粉剂，以上百分含量均为质量百分含量，以发酵液的重量作为基准；
18.优选的，所述步骤(6)为：将作物秸秆粉碎至长度为1～10cm，按比例＝1:1和摊开晾晒后的蘑菇菌糠混匀成混合料，调整水分含量为40％，均匀摆放于1.5-2.0米的腐熟坑中约10～20cm，按体积比例30:1加入适量新鲜畜禽粪便和处理后的饼肥，再均匀摆放10～20cm厚的混合料，再加入适量新鲜畜禽粪便和饼肥，如此循环处理，最后表层用泥土覆盖混合料，发酵30～60天，温度在30～60℃，中间翻倒3次，发酵完成。
19.优选的，所述步骤(7)中，腐熟物料与普通育苗基质的混合比例为质量比1:1。
20.本发明制备的含甲基营养型芽孢杆菌和蘑菇菌糠的有机活性基质用于蔬菜育苗。
21.本发明的有益效果为：
22.本发明主要利用蘑菇菌糠和普通育苗基质的有机结合，通过添加分离筛选出的对土传病原真菌具有抑制作用的甲基营养型芽孢杆菌knk-1，明显减少黄瓜土传病害的发生，显著提高黄瓜植株的生长，促进作物对基质中养分的吸收利用，从而促进作物生长。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1是甲基营养型芽孢杆菌knk-1在lb平板上的的菌落形态。
25.图2是甲基营养型芽孢杆菌knk-1在pda平板上和4种土传病原真菌的对峙培养图。
26.图3是使用实施例2制备的活性基质培育黄瓜苗的效果图。
27.图中，1-knk-1对峙串珠镰刀菌，2-knk-1对峙灰霉菌，3-knk-1对峙立枯丝核菌，4-knk-1对峙交链孢霉，5-普通育苗基质7天育苗效果，6-实施例2制备的活性基质培育苗效果。
具体实施方式
28.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
29.实施例1
30.knk-1对4种土传病原真菌的拮抗作用(对峙培养法)
31.(1)分别用直径为2.5mm的打孔器在培养好的病原真菌菌落边缘打孔获得菌片，备用。
32.(2)挑取knk-1单菌落，分别接种于pda平板距中心2.5cm处的对称两点。pda平板中央接种病原真菌菌片，每个培养皿作为1个重复，每个病原真菌设3个重复，以中心只接种病原真菌菌片的pda平板为对照。培养皿于28℃培养箱中培养5～7d，当对照病原真菌菌丝长满整个培养皿时，测定各处理中病原真菌的菌丝直径，计算knk-1对病原真菌菌丝的抑制率，结果如表1所示。
33.表1培养6天knk-1对4种病原真菌的抑制作用
34.病原真菌菌落直径(cm)抑制率(％)串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)2.4469.50灰霉菌(botrytis cinerea)1.6879.00立枯丝核菌(rhizotonia solani)3.0262.25交链孢霉(alternaria alternata)2.3870.25
35.参见图2，knk-1对4种病原真菌都有很好的抑制作，抑制率均在62.25％以上。其中对灰霉菌的抑制率最高，达79％。通过表1和图2，说明knk-1对多种土传病原真菌有很好的抑制效果。
36.实施例2
37.(1)将甲基营养型芽孢杆菌knk-1接种到lb培养液中，30℃下，180rpm/min培养24h，得到种子液，浓度为108cfu/ml；
38.(2)用60升的机械搅拌不锈钢发酵罐六连罐对菌株knk-1进行发酵，发酵培养基为糖蜜培养基，每1l糖蜜培养基含有以下成分：100ml糖蜜、1g氯化钠、3g尿素；装液量为40l，接种量为6％，温度30℃，搅拌速度为300rpm/min，通气量3l/min，发酵时间2天，得到发酵液；检测甲基营养型芽孢杆菌为1.50
×
109cfu/ml；
39.(3)成品粉剂制备：向步骤(2)制备的发酵液中加入10％载体硅藻土(含0.5％葡萄糖)，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体；24h后室温干燥，加入4％羧甲基纤维素钠、7％聚乙烯醇、3.5％吐温80和0.5％黄原胶混合，气流粉碎机粉碎，过325目筛，获得knk-1可湿性粉剂，以上百分含量均为质量百分含量；
40.(4)畜禽粪便处理：收集新鲜畜禽粪便；
41.(5)饼肥处理：将花生饼或芝麻饼或豆饼粉碎，过2mm筛子；
42.(6)将作物秸秆放入粉碎机中进行粉碎，使其粉碎至长度为1～10cm，按比例＝1:1和摊开晾晒后的蘑菇菌糠混匀成混合料，调整水分含量为40％，均匀摆放于1.5-2.0米的腐
熟坑中约10～20cm，按体积比例30:1加入适量新鲜畜禽粪便和处理后的饼肥，再均匀摆放10～20cm厚的混合料，再加入适量新鲜畜禽粪便和饼肥，如此循环处理，最后表层用泥土覆盖混合料，发酵60天，温度在30～60℃，中间翻倒3次，腐熟完成，得腐熟物料；
43.(7)将步骤(6)的腐熟物料与普通育苗基质按照体积比1:1进行混配，混合均匀；再加入步骤(3)制成的knk-1成品粉剂，得到含甲基营养型芽孢杆菌和蘑菇菌糠的有机活性基质。检测有机活性基质中甲基营养型芽孢杆菌knk-1活菌数量为1.00
×
108cfu/g。
44.实施例3
45.育苗试验
46.育苗试验处理如下：1)普通育苗基质(ck)；2)添加菌株knk-1粉剂的有机活性基质(knk-1)。将黄瓜种子消毒浸种催芽，露白后，埋入两个处理的基质中，每个处理设20棵重复。7天后分别测定相关生长指标：茎粗、株高、地上部鲜重、根部鲜重，详见表2。
47.表2有机活性基质育苗7天对黄瓜苗期生长的影响
48.处理茎粗(mm)株高(mm)地上部鲜重(g)根部鲜重(g)ck2.145.31.450.33knk-12.756.81.730.43
49.根据检测结果可以看出，茎粗、株高、地上部和根部鲜重分别增加了28.57％、25.39％、19.31％和30.30％。本发明制备的含甲基营养型芽孢杆菌和蘑菇菌糠的有机活性基质可有效地提高黄瓜苗期的生长。
50.尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。