一种高效环保的杀菌剂的制作方法

1.本发明属于杀菌剂技术领域，涉及一种高效环保的杀菌剂。


背景技术：

2.目前许多医院或诊所在处理各种伤口和对医疗器械清洗消毒都用到医用酒精(75％乙醇)或医用双氧水(3％过氧化氢)，这两种溶液都是非常常见的杀菌溶液，但是它们的杀菌原理是不同的。
3.乙醇作用于细菌细胞首先起到脱水作用，乙醇分子进入到蛋白质分子的肽链环节，其蛋白质发生变性沉淀。乙醇还具有很强的渗透作用，能破环细菌的细胞壁和微生物酶系统。
4.双氧水具有氧化性并且不稳定，当它与皮肤、口腔和黏膜的伤口、脓液或污物相遇时，立即分解生成氧。这种尚未结合成氧分子的氧原子，具有很强的氧化能力，与细菌接触时，能破坏细菌菌体，杀死细菌。


技术实现要素：

5.本发明解决的技术问题在于提供一种高效环保的杀菌剂，能够将医用酒精、医用双氧水的杀菌效率进一步提高，而且毒性小、绿色、无刺激。
6.本发明是通过以下技术方案来实现：
7.一种高效环保的杀菌剂，该杀菌剂的杀菌成分包括乙醇、过氧化氢、聚六亚甲基双胍盐酸盐和小檗碱；其中乙醇的体积浓度为45～75％，过氧化氢的质量浓度为1～7％，聚六亚甲基双胍盐酸盐的质量浓度为0.01～0.07％、小檗碱的浓度为4～20g/l。
8.进一步的，乙醇的体积浓度为75％，过氧化氢的质量浓度为3％，聚六亚甲基双胍盐酸盐的质量浓度为0.03％、小檗碱的浓度为12g/l。
9.在对器械进行消杀时，将器械浸泡在杀菌剂中12小时或24小时。
10.进一步，在使用时还可按一定比例进行稀释。
11.若将器械浸泡12小时，则杀菌剂按15:100的体积比稀释；
12.若将器械浸泡24小时，则杀菌剂按5:100的体积比稀释。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
14.本发明提供的高效环保的杀菌剂，将乙醇和过氧化氢按一定浓度混合不但没有大的反应发生，而且混合后的杀菌效率有所提高，再加入一定浓度聚六亚甲基双胍盐酸盐以进一步提高杀菌效率。本发明进一步优选，确定三者最优配比为75％乙醇 3％双氧水 0.03％聚六亚甲基双胍盐酸盐，将这三者的组合称为化学杀菌剂；并在此基础上添加天然杀菌剂小檗碱，结果表明杀菌效率进一步得到了提高，最后确定小檗碱的最优浓度为12g/l。
15.在37℃条件下，对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效率，医用酒精杀菌效率分别为52.67％和52.89％；医用双氧水杀菌效率分别为61.66％和65.25％；而本发明最优
配比的乙醇、双氧水、聚六亚甲基双胍盐酸盐的杀菌效率分别为88.35％和89.43％；而在加入小檗碱之后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效率分别为98.50％与98.72％；检测结果表明本发明的杀菌效率具有显著的提高；而在37℃条件下利于细菌的生长，那么如果在室温下或低温，杀菌效果会更好。
16.本发明提供的高效环保的杀菌剂，使用的乙醇易挥发、h2o2分解生成h2o和o2，聚六亚甲基双胍盐酸盐刺激性小、毒性低、溶液易于处理；因此本发明的杀菌剂具体毒性小、杀菌效率高、用量小、成本低的特点，而且还能够做到安全、绿色、无刺激，同时利于保护环境。对于医疗器械的杀菌消毒和清洗，使用本发明的杀菌剂将会是很好的选择。
附图说明
17.图1为不同浓度的乙醇与od值关系曲线；
18.图2为不同浓度的双氧水与od值关系曲线；
19.图3为不同浓度的聚六亚甲基双胍盐酸盐与od值关系曲线；
20.图4为本发明的化学杀菌剂作用大肠杆菌12小时的od值测定检测图；
21.图5为本发明的化学杀菌剂作用大肠杆菌24小时的od值测定检测图；
22.图6为本发明的化学杀菌剂作用金黄色葡萄球菌12小时的od值测定检测图；
23.图7为本发明的化学杀菌剂作用金黄色葡萄球菌24小时的od值测定检测图；
24.图8-1、8-2分别为加入不同浓度小檗碱之后新型杀菌剂与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌od值关系曲线
25.图9-1、9-2分别为新型混合杀菌剂不同加入量作用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌12小时的od值的关系曲线；
26.图10-1、10-2分别为新型混合杀菌剂不同加入量作用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌24小时的od值的关系曲线。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
28.聚六亚甲基双胍盐酸盐(phmb)是近年来新开发研究的化学消毒剂，其具有阳离子的表面活性性能与优良杀菌性能。为了改进医用酒精、医用双氧水杀菌的效果，本发明提出将这三种化学杀菌剂进行组合，并在聚六亚甲基双胍盐酸盐溶液添加天然抗菌剂小檗碱，以提高杀菌效果。
29.由于乙醇具有还原性，可以被氧化成为乙醛甚至进一步被氧化为乙酸。而低浓度双氧水是无色、有少量刺激性气味的液体，既具有氧化性还具有还原性。因此本发明首先考虑两者混合时是否发生反应，是否会影响杀菌效果。
30.外伤口常见的细菌有大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，破伤风杆菌等，本发明将以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为实验菌，向实验菌加入不同浓度的混合杀菌剂来测定其od值，绘制以od值为因变量浓度为自变量的关系曲线，来确定每种试剂的最优比例和最优加入量。
31.本发明将在常温温度下来进行测定不同试剂混合是否发生反应，37℃温度下测定其杀菌消毒效果。拟采用控制变量法进行75％乙醇与1％、3％、5％、7％浓度双氧水混合与
3％双氧水与50％、60％、70％、80％浓度乙醇混合的实验。拟采用正交实验法进行45％、55％、65％、75％浓度乙醇，1％、3％、5％、7％浓度双氧水与0.01％、0.03％、0.05％、0.07％浓度聚六亚甲基双胍盐酸盐混合的实验。
32.1、细菌的活化与培养
33.(1)实验仪器与试剂
34.lb固体培养基，lb液体培养基，1000μl移液枪，5ml移液枪，250ml量筒，枪头，试管，试管塞，100ml量筒，培养皿，报纸，纱布，酒精灯，恒温培养箱，高压灭菌锅，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，1000ml锥形瓶，500ml锥形瓶，1000ml烧杯，玻璃棒，722型分光光度计，比色皿，超纯水。
35.(2)lb固体与液体培养基的制备
36.lb固体培养基：称取10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、18g琼脂于1000ml烧杯中，向其加入少量蒸馏水并用玻璃棒使之溶解，定容至1000ml处。
37.lb液体培养基：称取10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠于1000ml烧杯中，向其加入少量蒸馏水并用玻璃棒使之溶解，定容至1000ml处。将1000ml lb液体培养基分为300ml与700ml装入锥形瓶中。
38.(3)灭菌处理
39.将上述所配制的lb固体与液体培养基、塞上塞子的试管、枪头、100ml量筒、250ml量筒用纱布和报纸封起来，套上皮筋放入高压灭菌锅灭菌2个小时后取出，放置室温下。
40.(4)细菌画线与培养
41.在灭菌台将lb固体培养基分别适量倒入10个培养皿中，用酒精灯杀菌后的接种环挑少量大肠杆菌(金黄色葡萄球菌)于培养皿中，画线。将画完线的培养皿封起来放入恒温培养箱培养12个小时。将培养12个小时的细菌用酒精灯杀菌后的接种环挑取部分大肠杆菌(金黄色葡萄球菌)单菌落于300ml lb液体培养基中，用原纱布和报纸将锥形瓶封好放入37℃恒温摇床中设置摇速为150r/min摇12小时。
42.(5)细菌od值的测定与稀释
43.在灭菌台中，将摇床摇好的大肠杆菌(金黄色葡萄球菌)用5ml移液枪量取细菌液3.5ml于1cm比色皿中。大肠杆菌最大吸收波长λ为600nm，金黄色葡萄球菌最大吸收波长λ为550nm。在波长λ＝600nm(550nm)用lb液体培养基做参比平行三次测定其od值。
44.根据朗伯-比尔定律(beer-lambert law)，吸光度最优范围在0.2-0.8之间，因为菌液浓度很大，测出od值大于0.8，所以要将菌液按比例用lb液体培养基进行稀释至od值在该范围内。
45.(6)杀菌剂的加入与测定
46.在灭菌台中，将稀释好的菌液用5ml移液枪吸取4ml加入试管中，随后用1000μl移液枪向试管中加入400μl不同浓度的杀菌剂，三只试管只加入稀释好的菌液不加入杀菌剂为对照试剂，塞好塞子并用记号笔做好标记。用报纸和皮筋将试管封好放入37℃恒温摇床中设置摇速为150r/min摇12小时。12小时后将试管按顺序放入试管架上，以lb液体培养基为参比试剂，用722型分光光度计测定其od值，平行三次。
47.2、75％乙醇与1％、3％、5％、7％浓度双氧水混合反应与杀菌效果的测定
48.(1)实验仪器与试剂
49.无水乙醇，胶头滴管，30％过氧化氢，碳酸钠固体，2,4-二硝基苯肼，25ml吸量管，5ml吸量管，2ml吸量管，蒸馏水，200μl移液枪，1000μl移液枪，枪头，50ml比色管。
50.(2)实验步骤
51.a)用吸量管与移液枪量取37.50ml无水乙醇与1.67ml、5.00ml、8.33ml、11.67ml30％过氧化氢分别加入50ml比色管中，用蒸馏水定容至刻度线并摇匀观察实验现象，贴上标签并将混合溶液在阴凉处放置30天。
52.b)用胶头滴管分别吸取少量放置30天的混合杀菌剂于试管中，向其中加入2,4-二硝基苯肼试剂，观察现象，看是否有黄色晶形沉淀生成。
53.c)另取一份上述同样的混合杀菌溶液，向其分别加入碳酸钠固体，观察实验现象，看是否有气泡产生。
54.d)将75％乙醇与1％、3％、5％、7％浓度双氧水混合杀菌剂分别加入400μl到含有4ml菌液的试管中，测定其杀菌效果。
55.(3)实验现象
56.a)两种溶液在上述不同浓度混合都无明显现象。
57.b)放置30天后的混合液加入2,4-二硝基苯肼试剂都无明显现象，没有黄色晶形沉淀产生。
58.c)放置30天后的混合液加入碳酸钠固体都无明显现象，没有气泡生成。
59.(4)杀菌效果
60.大肠杆菌的检测结果如表1所示。
61.表1大肠杆菌od值测定
[0062][0063]
金黄色葡萄球菌的检测结果如表2所示。
[0064]
表2金黄色葡萄球菌od值测定
[0065][0066]
通过实验可以得出，在室温下75％乙醇与1％、3％、5％、7％双氧水混合没有将乙醇氧化成乙醛或乙酸(排除了双氧水对75％乙醇氧化，以避免影响影响杀菌效果)。通过实验数据可以得出，与75％乙醇和3％双氧水溶液单试剂相比，75％乙醇与1％、3％、5％、7％浓度双氧水混合杀菌效果更好，加入杀菌剂后绝大部分溶液杀菌效率在80％以上。
[0067]
在75％乙醇浓度不变的条件下，随着双氧水浓度的增加od值先减小后增加，3％浓度双氧水杀菌效果最优，因此在该实验方案中最优试剂为75％乙醇与3％双氧水混合杀菌剂。
[0068]
3、3％双氧水与50％、60％、70％、80％浓度乙醇混合反应与杀菌效果的测定
[0069]
(1)实验仪器与试剂
[0070]
无水乙醇，胶头滴管，30％过氧化氢，碳酸钠固体，2,4-二硝基苯肼，25ml吸量管，5ml吸量管，2ml吸量管，蒸馏水，200μl移液枪，1000μl移液枪，50ml比色管。
[0071]
(2)实验步骤
[0072]
a)用吸量管与移液枪量取5.00ml30％过氧化氢与25.00ml、30.00ml、35.00ml、40.00ml无水乙醇分别加入50ml比色管中，用蒸馏水定容至刻度线并摇匀观察实验现象，贴上标签并将混合杀菌试剂在阴凉处放置30天。
[0073]
b)用胶头滴管分别吸取放置30天的混合杀菌剂于试管中，向其中加入2,4-二硝基苯肼试剂，观察现象，看是否有黄色晶形沉淀生成。
[0074]
c)另取一份上述同样的混合杀菌溶液，向其分别加入碳酸钠固体，观察实验现象，看是否有气泡产生。
[0075]
d)将3％双氧水与50％、60％、70％、80％浓度乙醇混合杀菌剂分别加入400μl到含有4ml菌液的试管中，测定其杀菌效果。
[0076]
(3)实验现象
[0077]
a)两种溶液在上述不同浓度混合都无明显现象。
[0078]
b)放置30天后的不同浓度混合液加入2,4-二硝基苯肼试剂都无明显现象，没有黄色晶形沉淀产生。
[0079]
c)放置30天后的混合液加入碳酸钠固体都无明显现象，没有气泡生成。
[0080]
(4)杀菌效果
[0081]
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌od值测定分别如表3、表4所示。
[0082]
表3大肠杆菌od值测定
[0083][0084]
表4金黄色葡萄球菌od值测定
[0085][0086]
通过实验可以得出，在室温下3％双氧水与50％、60％、70％、80％乙醇混合没有将乙醇氧化成乙醛或乙酸。
[0087]
通过实验数据可得出，与75％乙醇和3％双氧水溶液的单试剂相比，3％双氧水与50％、60％、70％、80％浓度乙醇混合杀菌效果较好，杀菌效率均在80％以上。
[0088]
结果表明，在3％双氧水浓度不变的情况下，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对不同浓度的乙醇的od值均影响不大，起决定性杀菌效果的试剂为双氧水。
[0089]
4、45％、55％、65％、75％浓度乙醇，1％、3％、5％、7％浓度过氧化氢与0.01％、0.03％、0.05％、0.07％浓度聚六亚甲基双胍盐酸盐、小檗碱混合反应与杀菌效果的测定
[0090]
(1)实验仪器与试剂
[0091]
无水乙醇，胶头滴管，30％过氧化氢，20％聚六亚甲基双胍盐酸盐，碳酸钠固体，2,4-二硝基苯肼，25ml吸量管，5ml吸量管，2ml吸量管，蒸馏水，200μl移液枪，1000μl移液枪，50ml比色管。
[0092]
(2)乙醇、过氧化氢和聚六亚甲基双胍盐酸盐混合系列配比如下所示：
[0093][0094]
①
用吸量管与移液枪按照上述试剂加入量进行量取，分别加入50ml比色管中，用蒸馏水定容至刻度线并摇匀观察实验现象，贴上标签并将混合杀菌试剂在阴凉处放置30天。
[0095]
②
用胶头滴管分别吸取放30天的杀菌剂于试管中，向其中加入2,4-二硝基苯肼试
剂，观察现象，看是否有黄色晶形沉淀生成。
[0096]
③
另取一份上述同样杀菌剂，向其分别加入碳酸钠固体，观察实验现象，看是否有气泡产生。
[0097]
④
将16组杀菌剂分别加入400μl到含有4ml菌液的试管中，测定其杀菌效果。
[0098]
(3)实验现象
[0099]
a)16组溶液在上述不同浓度混合都无明显现象。
[0100]
b)放置30天后的16组杀菌剂加入2,4-二硝基苯肼试剂无明显现象，没有黄色晶形沉淀产生。
[0101]
c)放置30天后的16组杀菌剂加入碳酸钠固体无明显现象，没有气泡生成。
[0102]
(4)杀菌效果
[0103]
16组杀菌剂的大肠杆菌od值测定如表5所示。
[0104]
大肠杆菌正交试验的od值测定如表6所示。
[0105]
16组杀菌剂的金黄色葡萄球菌od值测定如表7所示。
[0106]
金黄色葡萄球菌正交试验的od值测定如表8所示。
[0107][0108]
表5 16组杀菌剂的大肠杆菌od值测定
[0109]
表6大肠杆菌正交的od值测定
[0110][0111]
表7 16组杀菌剂的金黄色葡萄球菌od值测定。
[0112]
表8金黄色葡萄球菌正交的od值测定
[0113]
[0114][0115]
基于上述检测结果，得到如图1所示的不同浓度的乙醇与od值关系曲线；图2所示的不同浓度的双氧水与od值关系曲线；图3所示的不同浓度的聚六亚甲基双胍盐酸盐与od值关系曲线；
[0116]
通过实验现象可以得出，在室温下45％、55％、65％、75％浓度乙醇，1％、3％、5％、7％浓度双氧水与0.01％、0.03％、0.05％、0.07％浓度聚六亚甲基双胍盐酸盐(小檗碱)混合没有将乙醇氧化成乙醛或乙酸。
[0117]
通过实验数据可得出，与乙醇和双氧水混合溶液相比，加入适当浓度的聚六亚甲基双胍盐酸盐杀菌效率有明显提高，部分混合杀菌剂的杀菌效率可以达到90％以上，比75％与3％双氧水纯溶液杀菌效率高。
[0118]
对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来说，乙醇的浓度从低到高都对其od值影响变化不大，双氧水的浓度从低到高其od值都是先减小后增大，聚六亚甲基双胍盐酸盐的浓度从低到高其od值也都是先减小后增大。
[0119]
对于该混合杀菌剂来说，不同浓度的乙醇od值变化不大，起决定性杀菌效果为双氧水和聚六亚甲基双胍盐酸盐。虽然不同浓度乙醇od值变化不大但乙醇具有抑菌效果而且75％乙醇抑菌效果最好，所以在该实验方案中最优试剂为75％乙醇 3％双氧水 0.03％聚六亚甲基双胍盐酸盐 0.06％小檗碱混合杀菌剂。
[0120]
6、最优试剂加入量的选择与杀菌效率的测定
[0121]
(1)实验仪器与试剂
[0122]
无水乙醇，30％过氧化氢，25ml吸量管，5ml吸量管，2ml吸量管，蒸馏水，200μl移液枪，1000μl移液枪，50ml比色管。
[0123]
(2)实验步骤
[0124]
①
用吸量管与移液枪量取37.50ml无水乙醇、5.00ml30％过氧化氢和75μl聚六亚甲基双胍盐酸盐分别加入50ml比色管中，用蒸馏水定容至刻度线并摇匀。
[0125]
②
根据杀菌剂加入的步骤，将该最优混合杀菌剂分别按200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl加入到含有4ml菌液的试管中，一式两份，分别在37℃恒温摇床上摇12小时与24小时，随后并测定其杀菌效果。
[0126]
(3)大肠杆菌的12小时od值测定、24小时od值测定分别如表9、表10所示；对应的检测图如图4、图5所示；
[0127]
表9大肠杆菌od值测定(12小时)
[0128][0129]
表10大肠杆菌od值测定(24小时)
[0130][0131]
金黄色葡萄球菌的od值测定、24小时od值测定分别如表11、表12所示；对应的检测图如图6、图7所示；
[0132]
表11金黄色葡萄球菌od值测定(12小时)
[0133][0134]
表12金黄色葡萄球菌od值测定(24小时)
[0135][0136]
通过实验可以得出，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌12小时的实验中od值都为先减小后增加，最低点加入量为600μl，其杀菌效率都在90％以上。在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌24小时的实验中od值都为持续上升，最低点加入量为200μl。
[0137]
在24小时实验中，经过分析出现od值持续上升的原因是：加入杀菌剂浓度过大，聚六亚甲基双胍盐酸盐浓度较大时遇到菌液长时间放置会变白，对od值测定产生干扰。
[0138]
最优混合杀菌剂在12小时杀菌时间里，4ml两种菌液最优加入量为600μl(相应的加入体积比为15％)，在24小时杀菌时间里，4ml两种菌液最优加入量为200μl(相应的加入体积比为5％)。
[0139]
因此在使用时，对于长期浸泡的器械可选择24小时最优加入量按比例加入，对于经常使用的器械可选择12小时最优加入量按比例加入。
[0140]
7、添加天然抗菌剂
[0141]
基于上述混合化学杀菌剂相比单一杀菌剂杀菌效率明显提高，本发明进一步向75％乙醇、3％双氧水、0.03％聚六亚甲基双胍盐酸盐的混合化学杀菌剂中直接加入天然抗菌剂小檗碱固体并采用控制变量法测定od值与杀菌率，具体比例如表13所示(也即小檗碱的浓度为4～20g/l)。
[0142]
表13不同浓度小檗碱与化学杀菌剂的配比(50ml)
[0143][0144]
不同菌液与不同浓度混合杀菌剂引起od值变化如图8-1、图8-2所示。
[0145]
通过实验发现，添加天然抗菌剂小檗碱的混合杀菌剂在上述不同浓度中无明显现象。向该混合杀菌剂中加入2,4-二硝基苯肼和碳酸钠固体均无明显现象，没有产生黄色晶形沉淀和气体生成。说明混合后没有将乙醇氧化成乙醛或乙酸。
[0146]
从图8-1、图8-2可以发现该混合杀菌剂在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中，od值随小檗碱不同浓度变化是极其相似的。小檗碱浓度从低到高其od值都是先减小后增大，有od值最低点，存在最优值。所以该新型混合杀菌剂的最优参数为75％乙醇、3％双氧水、0.03％聚六亚甲基双胍盐酸盐、12g/l的小檗碱。在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效率分别为98.50％与98.72％，相比化学杀菌剂杀菌效率得到很大提高。
[0147]
新型混合杀菌剂最优加入量的测定
[0148]
将最优新型混合杀菌剂分别按200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl加入到含有4ml菌液的离心管中，平行三次，分别在37℃恒温摇床上摇12小时与24小时，随后测定其od值并
确定其杀菌效果。不同菌液与最优新型混合杀菌剂加入量引起od值变化如图9-1、图9-2，以及图10-1、图10-2所示。可清晰地观察到，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌12小时的实验中其od值都为先减小后增加，最低点都为加入量为600μl，其杀菌效率都在95％以上。在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌24小时的实验中其od值都为持续上升，最低点都为加入量为200μl。
[0149]
在该实验方案中，最优新型混合杀菌剂在12小时杀菌时间里，两种菌液最优加入量为600μl，在24小时杀菌时间里，两种菌液最优加入量为200μl。因此在使用时，对于长期浸泡的器械杀菌消毒可选择24小时最优加入量按比例加入，对于经常使用的器械可选择12小时最优加入量按比例加入。
[0150]
综上，本发明提供的高效环保的杀菌剂，包括了化学杀菌剂和天然抗菌剂，化学杀菌剂中所使用的乙醇易挥发、h2o2分解生成h2o和o2，聚六亚甲基双胍盐酸盐刺激性小、毒性低、溶液易于处理；而小檗碱为天然抗菌剂；因此本发明的杀菌剂具体毒性小、杀菌效率高、用量小、成本低的特点，而且还能够做到安全、绿色、无刺激，同时利于保护环境。对于医疗器械的杀菌消毒和清洗，使用本发明的杀菌剂将会是很好的选择。
[0151]
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。