一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法与流程

1.本发明属于生物制药材料技术领域，尤其涉及一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法。


背景技术：

2.琼脂糖磁性微球作为一种特殊的生物分子固定化载体，能够在特殊化学试剂(如edc)的作用下将多肽、蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到微球表面，还能够借助磁场的作用实现快速分离，从而大大减少操作步骤和时间，因此是医学与分子生物学研究中的一个重要载体工具，在细胞分离、蛋白纯化、核酸分离等领域具有广泛的应用。
3.现有琼脂糖磁性微球主要是通过乳化-固化法制备，其主要步骤是将琼脂糖和磁核加热溶解形成水相，之后加到含有乳化剂的有机溶剂中，通过机械搅拌或超声充分乳化后，降温固化得到琼脂糖磁性微球。中国专利cn200410000087公开了一种特制的膜乳化装置制备尺寸均一的琼脂糖微球的方法。然而，上述方法均属于间歇式制备，其制备规模往往受限，无法进行大规模放大；同时由于重复性较差，导致制备得到的磁性琼脂糖凝胶微球的批次间差异较大，无法对其质量进行有效的控制。因此，开发一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法，本发明中的方法工艺简单、易于操作、可控性好、重复性好、可连续化制备；制备得到的磁性琼脂糖凝胶微球球形度高、粒径均一、粒径分布系数小。
5.本发明提供一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法，包括以下步骤：
6.a)使用计量泵将水相储料罐中的水相和油相储料罐中的油相输送至预乳化反应釜中进行搅拌预乳化，得到预乳化液；
7.所述水相包括琼脂糖、磁核、无机盐和水；所述油相包括乳化剂和有机溶剂；
8.所述预乳化的搅拌速度为500～1800rpm；
9.b)将所述预乳化液输送至乳化反应器中，进行高剪切乳化分散，得到乳化液；
10.所述高剪切乳化分散的剪切速度为3000～15000rpm；
11.c)将所述乳化液输送至冷却罐中进行冷却固化，得到磁性琼脂糖凝胶微球。
12.优选的，所述磁核为fe3o4磁核；所述无机盐为氯化钠、氯化钙和氯化钾中的一种或几种；
13.所述琼脂糖与磁核的质量比为10：(1～7.5)；所述琼脂糖与无机盐的质量比为10：(0.1～0.4)；所述琼脂糖与水的质量比为(2～8)：100。
14.优选的，所述乳化剂为span-85和/或span-80；所述有机溶剂为正己烷、环己烷、甲苯和四氯化碳中的一种或几种；
15.所述乳化剂与有机溶剂的体积比为(2～4)：100。
16.优选的，所述水相与油相的流量之比为1：(3～6)。
17.优选的，所述预乳化的温度为50～80℃；所述预乳化的时间为5～15min。
18.优选的，所述乳化的温度为50～70℃。
19.优选的，所述水相储料罐、油相储料罐、预乳化反应釜和乳化反应釜均设置有保温装置。
20.优选的，所述水相储料罐、油相储料罐、预乳化反应釜和冷却罐顶部均设有机械搅拌装置。
21.优选的，所述水相的流速为1～3l/h，所述水相储料罐的溶解温度为90～105℃。
22.优选的，所述油相的流速为3～9l/h，所述油相储料罐的溶解温度为50～80℃。
23.本发明提供了一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法，包括以下步骤：a)使用计量泵将水相储料罐中的水相和油相储料罐中的油相输送至预乳化反应釜中进行搅拌预乳化，得到预乳化液；所述水相包括琼脂糖、磁核、无机盐和水；所述油相包括乳化剂和有机溶剂；所述预乳化的搅拌速度为500～1800rpm；b)将所述预乳化液输送至乳化反应器中，进行高剪切乳化分散，得到乳化液；所述高剪切乳化分散的剪切速度为3000～15000rpm；c)将所述乳化液输送至冷却罐中进行冷却固化，得到磁性琼脂糖凝胶微球。本发明采用高剪切乳化技术，通过装置和管线设计，通过预乳化和高剪切乳化两个乳化步骤，实现了磁性琼脂糖凝胶微球的连续化制备。基于本技术的生产装置，可以实现磁性琼脂糖凝胶微球以1～3l/h的产量进行连续生产。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
25.图1为本发明中连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的装置示意图；
26.图2为本发明实施例1中制备的磁性琼脂糖凝胶微球显微图片；
27.图3为本发明实施例1中制备的磁性琼脂糖凝胶微球的粒径分布曲线；
28.图4为本发明实施例2中制备的磁性琼脂糖凝胶微球显微图片；
29.图5为本发明实施例2中制备的磁性琼脂糖凝胶微球的粒径分布曲线；
30.图6为本发明实施例3中制备的磁性琼脂糖凝胶微球显微图片；
31.图7为本发明实施例3中制备的磁性琼脂糖凝胶微球的粒径分布曲线；
32.图1中，1为油相储料罐，1-1为加热水出口，1-2为加热水进口，2为水相储料罐，2-1为加热水出口，2-2为加热水进口，3为预乳化反应釜，3-1为加热水出口，3-2为加热水进口，4为乳化反应器，5为冷却罐，5-1为冷却水进口，5-2为冷却水出口。
具体实施方式
33.本发明提供了一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法，包括以下步骤：
34.a)使用计量泵将水相储料罐中的水相和油相储料罐中的油相输送至预乳化反应釜中进行搅拌预乳化，得到预乳化液；
35.所述水相包括琼脂糖、磁核、无机盐和水；所述油相包括乳化剂和有机溶剂；
36.所述预乳化的搅拌速度为500～1800rpm；
37.b)将所述预乳化液输送至乳化反应器中，进行高剪切乳化分散，得到乳化液；
38.所述高剪切乳化分散的剪切速度为3000～15000rpm；
39.c)将所述乳化液输送至冷却罐中进行冷却固化，得到磁性琼脂糖凝胶微球。
40.本发明的连续化生产装置包括水相储料罐、油相储料罐、预乳化反应釜、乳化反应釜和冷却罐；所述水相储料罐和油相储料罐的出口通过管线与预乳化反应釜的入口相连通，所述预乳化反应釜的出口通过管线与乳化反应釜的入口相连通，所述乳化反应釜的出口通过管线与冷却罐的入口相连通。
41.其中，所述各装置的出口管线上均设置有计量泵，用于精确、定量的输送物料。
42.在本发明中，所述水相储料罐、油相储料罐、预乳化反应釜和乳化反应釜均设置有保温装置，确保琼脂糖水溶液不会在装置系统中发生凝固从而导致系统堵塞。优选的，所述保温装置为可循环水/油的夹层；所述水相储料罐、油相储料罐、预乳化反应釜和冷却罐顶部均设有机械搅拌装置；所述乳化反应器内设置有在线式高剪切乳化分散机。
43.基于上述连续化生产装置，本发明首先将琼脂糖、磁核、无机盐和水加入水相储料罐中加热搅拌至完全溶解，将乳化剂和有机溶剂加入油相储料罐中加热搅拌至完全溶解。
44.在本发明中，所述磁核为fe3o4或含fe3o4的纳米颗粒，所述磁核的粒径为100～500nm，优选为200～400nm；所述无机盐优选为氯化钠、氯化钙和氯化钾中的一种或几种。
45.在本发明中，所述琼脂糖与磁核的质量比优选为10：(1～7.5)，更优选为10：(2～7)，如10:1、10：1.5、10：2、10：2.5、10：3、10：3.5、10：4、10：4.5、10：5、10：5.5、10：6、10：6.5、10：7、10：7.5、10，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；所述琼脂糖与无机盐的质量比优选为10：(0.1～0.4)，更优选为10：(0.2～0.3)；所述琼脂糖与水的质量比优选为(2～8)：100，更优选为(3～7)：100，如2:100、3:100、4:100、5:100、6:100、7:100、8:100，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
46.在本发明中，所述水相储料罐的加热温度优选为90～105℃，更优选为95～100℃；所述水相储料罐中的搅拌速度优选为100～500rpm，更优选为200～400rpm。
47.在本发明中，所述乳化剂优选为span-85和/或span-80；所述有机溶剂为正己烷、环己烷、甲苯和四氯化碳中的一种或几种；所述乳化剂与有机溶剂的体积比优选为(2～4)：100，最优选为3:100。
48.在本发明中，所述油相储料罐的加热温度优选为50～80℃，更优选为60～70℃；所述油相储料罐中的搅拌速度优选为100～500rpm，更优选为200～400rpm。
49.然后通过计量泵将水相和油相按照设置的比例输送至预乳化反应釜中，在机械搅拌的条件下进行预乳化。
50.本技术在高剪切乳化前，增加了一个机械搅拌预乳化步骤，目的是提高磁核在琼脂糖微球中的分布均匀性，减少琼脂糖白球(即没有包裹住任何磁核的琼脂糖微球)的产生，如不添加此步骤，视乳化条件的不同，会产生约10～20％左右的琼脂糖白球。
51.在本发明中，所述水相与油相的流量之比优选为1：(3～6)，更优选为1：(4～5)，如1:3、1:4、1:5、1:6，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
52.具体的，在本发明中，所述水相的流量优选为1～3l/h，更优选为1～2l/h，所述油
相的流量优选为3～9l/h，更优选为4～8l/h，如3l/h，4l/h，5l/h，6l/h，7l/h，8l/h，9l/h，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
53.在本发明中，所述预乳化的搅拌速度优选为500～1800rpm，更优选为800～1500rpm，如500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm、1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；所述预乳化的搅拌时间优选为5～15min，更优选为10～12min；所述预乳化的温度优选为50～80℃，更优选为60～70℃。
54.然后将预乳化液输送至乳化反应釜中，进行高剪切乳化分散，得到乳化液。
55.在本发明中，所述预乳化液的流速优选为4～15l/h，更优选为5～12l/h，如4l/h，5l/h，6l/h，7l/h，8l/h，9l/h，10l/h，11l/h，12l/h，13l/h，14l/h，15l/h，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
56.本发明优选使用在线式高剪切乳化分散机进行乳化，所述在线式高剪切乳化分散机设置有定转子，通过调整定转子的直径尺寸和其转速，能够调控所制备的微球的粒径大小。具体的，在本发明中，所述定转子的直径为18mm。
57.所述高剪切乳化分散的剪切速度(即定转子的转速)优选为3500～5000rpm，更优选为4000～4500rpm，如3500rpm、3600rpm、3700rpm、3800rpm、3900rpm、4000rpm、4100rpm、4200rpm、4300rpm、4400rpm、4500rpm、4600rpm、4700rpm、4800rpm、4900rpm、5000rpm，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；所述乳化的温度优选为50～70℃，更优选为60～65℃。
58.在本发明中，所述乳化反应釜腔体的温度也会影响磁性琼脂糖凝胶微球的粒径，其温度必须设置为高于50℃。
59.得到乳化液后，使用计量泵将乳化液输送至冷却罐中进行冷却固化，清洗后得到磁性琼脂糖凝胶微球。
60.在本发明中，所述冷却罐的冷却温度优选为5～10℃，更优选为6～8℃；所述冷却罐中设置有机械搅拌装置，所述冷却过程优选在搅拌的条件下进行。
61.本发明提供了一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法，包括以下步骤：a)使用计量泵将水相储料罐中的水相和油相储料罐中的油相输送至预乳化反应釜中进行搅拌预乳化，得到预乳化液；所述水相包括琼脂糖、磁核、无机盐和水；所述油相包括乳化剂和有机溶剂；所述预乳化的搅拌速度为500～1800rpm；b)将所述预乳化液输送至乳化反应器中，进行高剪切乳化分散，得到乳化液；所述高剪切乳化分散的剪切速度为3000～15000rpm；c)将所述乳化液输送至冷却罐中进行冷却固化，得到磁性琼脂糖凝胶微球。本发明采用高剪切乳化技术，通过装置和管线设计，通过预乳化和高剪切乳化两个乳化步骤，实现了磁性琼脂糖凝胶微球的连续化制备。基于本技术的生产装置，可以实现磁性琼脂糖凝胶微球以1～3l/h的产量进行连续生产。
62.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种连续化生产磁性琼脂糖凝胶微球的方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
63.实施例1
64.使用如图1所示的生产系统，并按照如下步骤进行
65.1)将400g琼脂糖粉末、300g fe3o4磁核、14.6g氯化钠和10l纯水依次加入到水相储
料罐中，开启储料罐顶部机械搅拌和循环油浴加热，待罐内溶液温度达到100℃后，继续机械搅拌60分钟；
66.2)将1500g span-85和40l正己烷加入到油相储料罐中，开启机械搅拌和循环水浴加热，待罐内溶液温度达到60℃后，继续机械搅拌60分钟。
67.3)开启预乳化反应釜顶部的机械搅拌，设定转速为1000rpm；开启预乳化反应釜的循环水浴加热，设定温度为60℃，待循环水浴温度达到60℃后，使用计量泵将水相溶液和油相溶液分别以1l/h和4l/h的速度输送至预乳化反应釜中，预乳化5分钟后，使用计量泵以4l/h的速度将预乳化乳液输送至乳化反应器中。
68.4)开启乳化反应器循环热水，温度设定为60℃，之后开启在线式高剪切乳化分散机，设定转速为5000rpm，乳化后乳液直接排入到冷却反应釜中。
69.5)开启冷却反应釜顶部机械搅拌，并在循环水夹层中通入4～10℃冷却水进行冷却固化，待完全冷却固化后收集处理。
70.本实施例制备的磁性琼脂糖凝胶微球显微图片如图2所示，可以看出fe3o4磁核均匀分布在琼脂糖凝胶内部，平均粒径为16.4μm，粒径跨度(span)为1.11，其粒径分布如图3所示。
71.实施例2
72.使用如图1所示的生产系统，并按照如下步骤进行
73.1)将600g琼脂糖粉末、300g fe3o4磁核、14.6g氯化钠和10l纯水依次加入到水相储料罐中，开启储料罐顶部机械搅拌和循环油浴加热，待罐内溶液温度达到100℃后，继续机械搅拌60分钟；
74.2)将1500g span-85和40l正己烷加入到油相储料罐中，开启机械搅拌和循环水浴加热，待罐内溶液温度达到60℃后，继续机械搅拌60分钟。
75.3)开启预乳化反应釜顶部的机械搅拌，设定转速为1000rpm；开启预乳化反应釜的循环水浴加热，设定温度为60℃，待循环水浴温度达到60℃后，使用计量泵将水相溶液和油相溶液分别以1l/h和4l/h的速度输送至预乳化反应釜中，预乳化5分钟后，使用计量泵以4l/h的速度将预乳化乳液输送至乳化反应器中。
76.4)开启乳化反应器循环热水，温度设定为60℃，之后开启在线式高剪切乳化分散机，设定转速为8000rpm，乳化后乳液直接排入到冷却反应釜中。
77.5)开启冷却反应釜顶部机械搅拌，并在循环水夹层中通入4～10℃冷却水进行冷却固化，待完全冷却固化后收集处理。
78.本实施例制备的磁性琼脂糖凝胶微球显微图片如图4所示，可以看出fe3o4磁核均匀分布在琼脂糖凝胶内部，平均粒径为24.7μm，粒径跨度(span)为1.07，其粒径分布如图5所示。
79.实施例3
80.使用如图1所示的生产系统，并按照如下步骤进行
81.1)将600g琼脂糖粉末、300g fe3o4磁核、18.6g氯化钾和10l纯水依次加入到水相储料罐中，开启储料罐顶部机械搅拌和循环油浴加热，待罐内溶液温度达到100℃后，继续机械搅拌60分钟；
82.2)将1500g span-85和40l正己烷加入到油相储料罐中，开启机械搅拌和循环水浴
加热，待罐内溶液温度达到60℃后，继续机械搅拌60分钟。
83.3)开启预乳化反应釜顶部的机械搅拌，设定转速为1000rpm；开启预乳化反应釜的循环水浴加热，设定温度为50℃，待循环水浴温度达到60℃后，使用计量泵将水相溶液和油相溶液分别以1l/h和4l/h的速度输送至预乳化反应釜中，预乳化5分钟后，使用计量泵以4l/h的速度将预乳化乳液输送至乳化反应器中。
84.4)开启乳化反应器循环热水，温度设定为50℃，之后开启在线式高剪切乳化分散机，设定转速为3000rpm，乳化后乳液直接排入到冷却反应釜中。
85.5)开启冷却反应釜顶部机械搅拌，并在循环水夹层中通入4～10℃冷却水进行冷却固化，待完全冷却固化后收集处理。
86.本实施例制备的磁性琼脂糖凝胶微球显微图片如图6所示，可以看出fe3o4磁核均匀分布在琼脂糖凝胶内部，平均粒径为38.5μm，粒径跨度(span)为1.11，其粒径分布如图7所示。
87.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。