马齿苋中一种含氧苯甲酸及其提取分离方法与应用与流程

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的一种含氧苯甲酸类化合物及其提取分离方法。

背景技术

马齿苋（Portulaca oleracea L.），又名长命菜、五行草，为马齿苋科一年生草本植物。马齿苋耐旱耐涝，且耐光耐阴，分布广泛、资源丰富，作为药食两用的野生植物备受关注。2020版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血以及崩漏下血等。

马齿苋现代药理学研究表明，其具有神经保护、抗乙酰胆碱酯酶、抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。研究表明马齿苋众多化学成分为其多样的药理作用提供了物质基础，马齿苋主要化学成分包括苯甲酸类、黄酮类、生物碱类、木脂素类、香豆素类、有机酸类、萜类、甾类、挥发油、氨基酸类、各种色素类和矿物质类等。其中苯甲酸类是马齿苋中一类常见的化学成分，目前已报道的苯甲酸类成分有苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸和2,5-二羟基-4-(1-4-羟基苯基)乙基)苯甲酸等。

目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取的一种含氧苯甲酸类化合物，经研究发现本发明的一种新化合物具有神经保护和抗乙酰胆碱酯酶的作用，同时提供一种针对本发明新化合物的简便、快速、环保以及纯度高的提取分离方法。

为实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供一种从马齿苋药材中分离出的含氧苯甲酸类化合物，其分子式为C14H16O7，并且根据结构命名为4-((4-ethoxy-1-methoxy-1,4-dioxobutan-2-yl)oxy)benzoic acid。其化学结构式为：

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本发明还提供一种马齿苋中含氧苯甲酸类化合物的提取分离方法，具体步骤为：

步骤1：取马齿苋干燥药材，采用乙醇提取，醇提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；

步骤2：将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯-乙醇洗脱，减压回收乙酸乙酯-乙醇至浸膏，得到乙酸乙酯-乙醇提取物；

步骤3：将步骤2中乙酸乙酯-乙醇提取物经聚酰胺柱分离，采用水和乙醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，减压浓缩至干备用；

步骤4：将步骤3中所得物经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用；

步骤5：将步骤4中所得物再经Bond Elut SI硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，减压浓缩至干备用；

步骤6：将步骤5所得浓缩物进行HPLC分离制备，以甲醇-0.1%甲酸（体积百分数）为流动相进行等度洗脱，最终得到本发明所述的一种含氧苯甲酸类化合物。

进一步地，所述步骤1中采用50%乙醇回流提取两次，每次2小时，乙醇用量为药材的8倍～16倍。

进一步地，所述步骤2中所用乙酸乙酯-乙醇洗脱程序为等度洗脱。

进一步地，所述步骤3中用水和乙醇的体积比为50∶50、70∶30和90∶10梯度洗脱。

进一步地，所述步骤4中用甲醇和水的体积比为50∶50、70∶30和90∶10梯度洗脱。

进一步地，所述步骤4中所用的ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

进一步地，所述步骤5中用乙酸乙酯洗脱程序为等度洗脱。

进一步地，所述步骤6中以甲醇-0.1%甲酸为流动相，用体积比为15∶85等度洗脱，保留时间为8.69min。

本发明还提供了如上所述的从马齿苋药材中分离出的含氧苯甲酸类化合物在制备神经保护和抗乙酰胆碱酯酶的药物或保健品中的应用。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明中所述马齿苋含氧苯甲酸类化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道。本发明提供来源于马齿苋的一种含氧苯甲酸类化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用乙醇提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱纯化、Bond Elut SI硅胶柱层析及HPLC进行分离纯化与制备，成功提取分离出新化合物。该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用乙醇提取及乙酸乙酯洗脱，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高大于95%。此外经研究表明此化合物具有神经保护和抗乙酰胆碱酯酶作用，因此本发明新化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备神经保护和抗乙酰胆碱酯酶的药物。

附图说明

图1为本发明新化合物的UHPLC-ESI-QTOF/MS质谱图。

图2为本发明新化合物的¹H-NMR光谱图。

图3为本发明新化合物的¹³C-NMR光谱图。

图4为本发明新化合物的DEPT135光谱图。

图5为本发明新化合物的核磁共振¹H-¹H COSY光谱图。

图6为本发明新化合物的核磁共振HMBC光谱图。

图7为本发明新化合物的核磁共振HSQC光谱图。

图8为本发明新化合物的核磁共振ROESY光谱图。

具体实施方式

以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

本发明提供从马齿苋药材中分离出的含氧苯甲酸类新化合物，分子式为C14H16O7，并且根据结构命名为4-((4-ethoxy-1-methoxy-1,4-dioxobutan-2-yl)oxy)benzoic acid，化学结构式为：

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表1为所述新化合物的核磁数据，其中，化合物的¹H-NMR与¹³C-NMR在MeOD-d4中。

表1：本发明新化合物的核磁数据

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本发明化合物结构鉴定参阅图1～图8。

本发明一种新化合物的结构鉴定与推导。

化合物：黄色粉末，易溶于甲醇。点样于硅胶薄层板后，喷溴甲酚蓝试液斑点呈黄色。UHPLC-ESI-QTOF/MS给出m/z：295.0806[M-H]^-（C14H15O7^-）的准分子离子峰，理论值为295.0822。结合¹H-NMR、¹³C-NMR以及DEPT135数据，推测该化合物可能的分子式为C14H16O7，不饱和度为7。¹³C-NMR谱和DEPT135谱中显示有14个碳信号，分别为1个-OCH3（δC：52.9），1个-OCH2CH3（δC：14.6，62.1），4个烯碳（δC：116.2，133.2，均为重叠信号），5个季碳（1个双键碳，δC：122.9；1个连O的碳，δC：163.5；3个羰基碳，δC：170.3，172.2，175.2）。

¹H-NMR谱中显示有1个-OCH3信号为δH3.73（3H，s），1个-OCH2CH3信号为δH1.23（3H，t，J=14.3，7.1Hz）以及δH4.12（2H，dd，J=14.2，7.1Hz），4个烯氢信号分别为δH6.81（2H，d，J=8.8Hz，H-2，H-6）和δH6.92（2H，d，J=8.8Hz，H-3，H-5）。根据¹H-NMR谱及HMBC谱显示，H-2，H-3均与C-1、C-4、C-5和C-6相关；H-5，H-6均与C-1、C-2、C-3和C-4相关，表明一个具有AA′BB′系统的1,4-二取代苯环的存在；又因为H-3，H-5均与C-1′′及C-4相关，结合C-4（122.9）的化学位移，说明-COOH应与C-4相连。根据H-2′与C-1′、C-3′和C-4′相关，H-3′与C-1′、C-2′和C-4′相关，并且，由HMBC谱上-OCH3的δH3.73（3H，s）与C-1′相关，-OCH2CH3的δH4.12（2H，dd，J=14.2，7.1Hz）与C-4′相关，表明一个丁二酸甲酯乙酯结构的存在，又因为C-1（163.5）及C-2′（68.7）的化学位移位于低场区，提示与O相连，因此可以确定苯环与链状酯通过C-O-CH结构相连。根据以上信息，最终确定了新化合物的结构。

本发明还提供上述一种从马齿苋药材中分离出的含氧苯甲酸类新化合物的提取分离方法，具体步骤为：

步骤1：称取马齿苋干燥药材150kg，采用50%乙醇回流提取，50%乙醇用量（v/v）为药材的8倍～16倍，回流提取两次，每次2小时，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用；

步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后（21kg）经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯-乙醇（5∶1、4∶1、3∶1、2∶1，v/v）等度洗脱，其中硅胶为100目～200目，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；

步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物（2.6kg）经聚酰胺柱分离，采用水和乙醇-水（50∶50、70∶30、90∶10，v/v）梯度洗脱，其中聚酰胺为80目～100目，经薄层色谱进行检测，显色，将70%乙醇洗脱得到部位合并，并于室温以上，40℃以下减压浓缩至干，备用；

步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的20μm～40μm的ODS中压柱层析分离，用甲醇-水（50∶50、70∶30、90∶10，v/v）梯度洗脱（加压，使流速为1mL/min，温度为室温），得到4个洗脱部位（即共得到3个瓶，每瓶250mL），经薄层色谱进行检测，显色，将显色的50%甲醇部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用；

步骤5：将步骤4中所得物再经40μm的Bond Elut SI硅胶柱层析，用乙酸乙酯洗脱，得到6个洗脱部位（即共得到6个瓶，每瓶200mL），经薄层色谱进行检测，显色，50℃以下减压浓缩至干，得浸膏，备用；

步骤6：将步骤5中所得物通过HPLC分离制备，以甲醇-0.1%甲酸为流动相进行等度洗脱，检测波长为210nm和280nm，最终得到本发明所述一种新含氧苯甲酸类化合物，归一法测定纯度大于95%。

所述ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无浑浊，再以初始流动相平衡。

实施例2. 本发明新化合物的神经保护作用。

1 主要材料。

1.1 药品和试剂：实验所用新含氧苯甲酸化合物由上述方法制备，纯度为95%，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；青霉素、链霉素（杭州四季青生物工程材料有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS，武汉博士德生物工程有限公司），ROS检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司）。

1.2 细胞株：人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y、IMR-32，中科院上海细胞）。

1.3 分组：分为对照组、H2O2损伤模型组和实验组，各一组。

2 实验方法。

2.1 细胞培养：DMEM高糖培养基，加入l0%的胎牛血清，l%抗菌素（100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

2.2 MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明新含氧苯甲酸化合物（5μM～40μM），孵育1h后向H2O2组和实验组分别加入终浓度为800μM/L的H2O2，另设调零组（含DMSO溶媒的培养液），每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入20μL的5mg/mL的MTT，温度37℃，5%CO2条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪450nm波长处测定各孔吸光值（A）值，计算细胞存活率，细胞存活率＝(AH2O2损伤－A空白)/(A对照－A空白)。

2.3 DCFH-DA法检测SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内ROS：各组细胞给予相应物质后孵育24h，孵育结束前30min，各孔加入DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L，于37℃继续孵育30min，收集细胞，PBS洗2次，细胞计数，将各组细胞制成相同浓度的细胞悬液。取100μL细胞悬液检测荧光强度，激发波长485nm，发射波长538nm。以对照组荧光强度为100%，其余各组与对照组荧光强度相比较，计算胞内ROS变化。

2.4 INT显色反应法测定LDH的释放量：除上述对照组、H2O2损伤模型组和实验组外，另设立空白对照组（空白对照组不接种细胞），各组细胞加入相应物质培养24h，取各孔上清120μL至新的96孔板中，加60μL配好的LDH检测工作液，避光室温孵育30min，在490nm处用多功能酶标仪测定A值，计算相对于对照管的LDH释放量百分率。LDH释放率＝(A给药－A空白)/(A对照－A空白)。

3 实验结果。

实验结果表明本发明一种新化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞的凋亡的保护作用；并可有效降低H2O2诱导的SH-SY5Y细胞内和IMR-32细胞内ROS和LDH含量，且呈浓度依赖。

细胞相对存活率实验结果如表2所示。

表2：本发明新化合物对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞相对存活率的影响

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SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内ROS量检测结果如表3所示。

表3：本发明新化合物对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞内ROS量的影响

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SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内LDH释放的影响结果如表4所示。

表4：本发明新化合物对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞内LDH释放的影响

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实施例3. 本发明新化合物的抗乙酰胆碱酯酶作用。

1 主要材料。

1.1 药品和试剂：实验所用含氧苯甲酸化合物由上述方法制备，纯度为97%，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司），毒扁豆碱（上海瀚翔生物科技有限公司），5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB，上海金水生物科技有限公司），乙酰胆碱酯酶（AChE）和碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide，ATCI，大连美伦生物技术有限公司）。

1.2 分组：分为阴性对照组、阳性对照组和实验组。

2 实验方法。

2.1 样品准备：分别精密称取样品和毒扁豆碱1mg，分别以甲醇为溶剂，配置成（5μM/mL～50μM/mL）的五个梯度浓度。分别精密称取7.096g的磷酸二氢钠和6.002g的磷酸氢二钠，用蒸馏水定容至50mL，取3.40mL的磷酸二氢钠和46.6mL的磷酸氢二钠，配制成50mL的PBS（0.1M，pH=8.0)；精密称取0.0598g的DTNB，加入10mL的PBS，配制成DTNB溶液（15mmol/L）；精密称取0.01g的AChE，加入10mL的PBS，配制成AChE溶液（0.2μ/mL）；精密称取0.041g的ATCI，用蒸馏水定容至10mL，配制成ATCI溶液（15mmol/L）。

2.2 改进的Ellman方法测定抗胆碱酯酶活性：在96孔酶标板中依次加入140μL的PBS（0.1M，pH=8.0），10μL的DTNB（15mmol/L），15μL的AChE（0.2μ/mL)，20μL的样品溶液。阴性对照组实验用甲醇代替样品，阳性对照组实验用毒扁豆碱代替样品。37℃孵育10min后，加10μL的ATCI（15mmol/L）。20℃孵育10min后，用酶标仪在410nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率抑制率(%)=[(A0-A1)/A0]×100%。

其中，A0为空白组的吸光度值；A1为实验组的吸光度值。

3 实验结果。

实验结果表明本发明新化合物具有抗乙酰胆碱酯酶作用，且随药物浓度增大，抑制率也明显升高。本发明新化合物抗乙酰胆碱酯酶IC50值见表5。

表5：本发明新化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

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综上所述，本发明提供新化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱、Bond Elut SI硅胶柱层析及HPLC进行分离纯化与制备，成功分离得到一种新含氧苯甲酸类化合物。该方法简便、快速、环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高。由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有神经保护和抗乙酰胆碱酯酶作用，因此本发明的新含氧苯甲酸类化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。