一种规模化合成河豚毒素的方法与流程

1.本发明属于医药和有机合成领域，特别涉及一种人工合成河豚毒素(ttx)的方法。


背景技术：

2.河豚毒素(tetrodotoxin,ttx)是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，具有笼型原酸酯内盐结构，如下所示：
[0003][0004]
河豚毒素为白色晶体，无臭无味，微溶于水，溶于水的醋酸溶液，不溶于有机溶剂；其分子结构非常特别，以内盐的形式存在。河豚毒素是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性地与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体结合，具有戒毒和镇痛且无成瘾性的功效，也有降压、局麻和抑制肿瘤的作用。在临床应用中河豚毒素单次使用剂量极低，在微克级范围，所以克级以上规模的制备对于河豚毒素药用价值的开发具有重要意义。
[0005]
河豚毒素的现有来源为通过野生生物体提取，其生物含量很少，一般在百万分0.1-5这个数量级上，所以提取难度大，耗用野生的河豚鱼数量庞大，不利于生态环境保护，并且提取产品质量不稳定。另外，通过人工养殖相应生物提取河豚毒素并没有取得成功，目前认为野生生物是通过富集自然界毒素来实现体内含百万分0.1-5河豚毒素的。这导致了河豚毒素的价格昂贵，限制了其在医药及其它领域的应用。
[0006]
人工全合成河豚毒素的方法从1972年kishi研究组报道的消旋化合物开始(j.am.chem.soc.1972，94,9217-9219；9219-9221)，到本发明工作开始的2018年，全球共有十多个研发团队开展了河豚毒素消旋化合物、手性纯化合物和衍生产物的人工合成工作，取得了系列研究进展和成果。但是相关工作报导的合成方法步骤冗长(一般都大于30步)，合成效率非常低，一般只能得到1-5毫克的样品，其中的收率报道考虑测量方法和测量设备系统误差不具备可信度，相关工作学术探索意义大于其实际应用价值，不具备规模化河豚毒素合成和作为医药原料制备价值。例如fukuyama研究组报导的合成路线(angew.chem.int.ed.2017,56,1549
–
1552)，长达31步，特别是最后六步用到较多剧毒化学品和价格昂贵的化学试剂，相关反应的纯化过程繁琐，无法按照c-gmp标准克级以上规模制备河豚毒素。


技术实现要素：

[0007]
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种克级制备河豚毒素的方法，其特征在于：将式vi-a化合物氢化脱除保护基cbz，经过过滤、浓缩，制备得到ttx表示的河豚毒素
[0008][0009]
其中，cbz表示苄氧羰基，反应使用的溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯或异丙醇；过滤时使用水系混合纤维微孔滤膜。
[0010]
上述制备河豚毒素的方法中，所述式vi-a化合物可由式v化合物在酸的作用下得到：
[0011][0012]
其中，使用手性制备hplc分离式vi-a和式vi-b化合物。
[0013]
所述式vi-b可在酸的作用下进一步转化为式vi-a：
[0014][0015]
其中，使用手性制备hplc分离式vi-a和式vi-b化合物。
[0016]
所述式v化合物可由式iv化合物和cbz-甲基硫脲反应得到：
[0017][0018]
其中，反应使用金属路易士酸，包括氯化铅、醋酸铅、硝酸银、氯化铜和氯化亚铜。
[0019]
所述式iv化合物可由式iii化合物经过脱除boc保护基得到：
[0020][0021]
其中，boc表示叔丁氧羰基，反应使用乙腈作为溶剂，三甲基碘硅烷作为试剂，反应温度为-10℃到50℃。
[0022]
所述式iii化合物可由式ii化合物在碱的作用下经分子内关环得到：
[0023][0024]
其中，r为c
1-6
烷基或取代烷基，使用的碱包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾和碳酸氢钠；使用的溶剂包括甲醇、乙醇和甲苯。
[0025]
本发明进一步提供一种克级制备河豚毒素(ttx)的方法，该方法包括步骤(a)-步骤(h)：
[0026]
(a)使乙酸苄酯进行生物转化以制备光学纯式i化合物
[0027][0028]
(b)使式i化合物经过19步的化学转化以制备式ii化合物
[0029][0030]
其中，r为c
1-6
烷基或取代烷基。
[0031]
(c)使式ii化合物进行分子内酯交换反应以制备式iii化合物
[0032][0033]
(d)使式iii化合物脱去boc保护基以制备式iv化合物
[0034]
[0035]
(e)使式iv化合物和甲基硫脲反应以制备式v化合物
[0036]
(f)使式v化合物分子内关环以制备式vi-a化合物和式vi-b化合物
[0037][0038]
(g)使式vi-b化合物水解以制备式vi-a化合物
[0039][0040]
(h)使式vi-a化合物氢化脱除cbz保护基以制备式ttx化合物
[0041]
具体实施方式
[0042]
以下通过特定的具体实施方式说明本发明的技术内容，本领域技术人员可由本说明书公开的内容容易地了解本发明的其他优点与功效。本发明也可以通过其他不同的具体实施方式加以施行或应用。本领域技术人员在不背离本发明的精神前提下，可以进行各种修饰与变更。
[0043]
一般术语和定义
[0044]
除非另有定义，本文所用所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。若存在矛盾，则以本技术提供的定义为准。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。本文引用的所有专利、已经公开的专利申请和出版物均通过引用并入到本文中。
[0045]
术语“约”、“大约”当与数值变量并用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如对于平均值95％的置信区间内)或在指定数值的
±
10％内，或更宽范围内。
[0046]
术语“任选”或“任选存在”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
[0047]
表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由
…
组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由
…
组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由
…
组成”和“由
…
组成”。
[0048]
术语“一种(个)或多种(个)”或者“至少一种(个)”可以表示一、二、三、四、五、六、七、八、九种(个)或更多种(个)。
[0049]
本文列举的范围(如数值范围)可以涵盖其范围中的每一个值以及由各个值形成的各个亚范围。例如，表述“反应温度为-20℃到25℃”涵盖从-20℃到25℃范围之内的每一点值和亚范围，例如-20℃到0℃、0℃到25℃、-10℃到10℃，以及-20℃、-10℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃，等。其他类似的表述如“在-20℃到40℃下”、“在0℃到100℃下”等也应当按照类似方式理解。例如，表述“摩尔当量在0.01-1.5之间”包括0.01-0.1、0.02-0.05、0.03-0.05、0.04-0.06、0.1-0.5、0.5-1.0，以及0.01、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0等。
[0050]
除非文中另有说明，单数形式指代如“一”、“一个”、“该”，包含复数指代。除非另有声明，浓度以重量计，混合溶液中的液体比例以体积计算，反应试剂与化合物的比例(包括百分比)以摩尔量计。
[0051]
本文中化合物的保护基衍生物可以通过本领域人员熟知的方法制备得到。保护基衍生物中的保护基可以通过本领域人员熟知的方法脱去。关于保护基团的选择方法，以及加入和去除的详细技术描述可以参见：t.w.greene,protecting groups in organic synthesis,3rd edition,john wiley&sons,inc.1999。
[0052]
术语“烷基”，如本文中单独或与其他基团组合使用时，指饱和的直链、支链或环状烃基。如本文中所使用，术语“c
1-6
烷基”指具有1-6个(例如1、2、3、4、5或6个)碳原子的饱和直链、支链或环状烃基。例如“c
1-6
烷基”可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、3-甲基戊烷-3-基、己基(例如正己基、环己基，等)。“c
1-6
烷基”涵盖其中亚范围，例如“c
1-3
烷基”、“c
2-3
烷基”、“c
4-6
烷基”等。
[0053]
合成路线和中间体化合物
[0054]
本发明涉及一种克级制备河豚毒素ttx的方法，该方法包括以下步骤(a)-步骤(h)：
[0055]
步骤(a)：使乙酸苄酯进行生物转化以制备光学纯式i化合物
[0056][0057]
该步生物转化主要参考了hudlicky的工作(angew.chem.int.ed.2018,57,10994-10998)，所作改进将另有专利详述。
[0058]
步骤(b)：使式i化合物经过19步的化学转化以制备式ii化合物
[0059][0060]
该部分主要参考结合了hudlicky(angew.chem.int.ed.2018,57,10994-10998)和fukuyama(angew.chem.int.ed.2017,56,1549
–
1552)的合成路线。其中，r为c
1-6
烷基或取代烷基。
[0061]
步骤(c)：使式ii化合物进行分子内酯交换以制备式iii化合物
[0062][0063]
式ii在碱的作用下经分子内关环得到式iii，使用的碱包括但不限于碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾和碳酸氢钠，其中碳酸钾为最优；使用的溶剂包括但不限于甲醇、乙醇和甲苯，其中甲醇为最优。
[0064]
步骤(d)：使式iii化合物脱去boc保护基以制备式iv化合物
[0065][0066]
式iii经过脱除boc保护基得到式iv，反应使用的乙腈作为溶剂，三甲基碘硅烷作为试剂，反应温度为-10℃到50℃，其中0℃为最优温度。
[0067]
步骤(e)：使式iv化合物和甲基硫脲反应以制备式v化合物
[0068][0069]
式iv和cbz-甲基硫脲反应得到式v，反应使用一种金属路易士酸，包括但不限于氯化铅、醋酸铅、硝酸银、氯化铜和氯化亚铜，避免了使用剧毒的氯化汞，其中氯化铜最优。
[0070]
步骤(f)：使式v化合物分子内关环以制备式vi-a化合物和式vi-b化合物
[0071][0072]
式v在酸的作用下得到式vi-a和4,9-脱水产物式vi-b的混合物，使用手性制备hplc分离得到纯的式vi-a和式vi-b。
[0073]
步骤(g)：使式vi-b化合物水解以制备式vi-a化合物
[0074][0075]
4,9-脱水产物式vi-b在酸的作用下又可以以一定的比例(1:8)转化为中间体式vi-a，使用手性制备hplc又可得到部分纯的式vi-a。经过2到3次循环转化为式vi-b，以大于80％的收率得到式vi-a。
[0076]
步骤(h)：使式vi-a化合物氢化脱除cbz保护基以制备式ttx化合物
[0077][0078]
式vi-a氢化脱除保护基cbz，经过简单过滤、浓缩即可以较高纯度得到河豚毒素式ttx。反应使用的溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯或异丙醇，其中甲醇为最优；过滤时使用一种水系混合纤维微孔滤膜，可以提高过滤速度，并有效除去钯炭。
[0079]
有益效果
[0080]
本发明要解决的技术问题是提供一种不依赖于河豚鱼等天然来源的、可人工规模化合成河豚毒素的方法，即一种化学法克级规模合成河豚毒素。相对于现有技术中报道的方法，本发明化学合成方法的优点在于合成方法和纯化方法上的改进使本发明具有按照c-gmp标准克级以上规模化生产河豚毒素及其衍生物的能力，使河豚毒素作为合乎监管规范的候选药物开展临床试验成为可能，为河豚毒素成为人类镇痛和戒毒药物领域重要的成员奠定了坚实的原料药基础，具体包括：
[0081]
(1)从ii到iii只需1步分子内酯交换反应，所有试剂只有一种廉价易得的碱，反应收率与原路线相当，替换了原路线的2步反应，以及价格昂贵的一些试剂，反应的可操作性和规模化重复性提高。
[0082]
(2)iv到v使用无毒金属路易士酸(如cucl2等)替代原路线中剧毒的hgcl2，操作更安全，符合api生产要求。
[0083]
(3)vi-a和副产物vi-b的分离采用手性制备hplc，分离效果好，可大量制备，替换了原路线中很难放大的硅胶薄板层析。
[0084]
(4)副产物vi-b在稀酸作用下可转化为vi-a，经一次循环利用，v到vi-a的总收率为68％，比原路线此步反应41％的收率有较大提高。
[0085]
(5)vi-a到ttx使用一种水系混合纤维微孔滤膜过滤，去除钯炭效果好，滤液蒸干无需进一步纯化即可以大于95％的纯度得到ttx，避免了原路线很难放大的高压液相色谱分离。
[0086]
(6)本发明在全球首次完成克级以上规模河豚毒素的合成工作，表征数据完整可靠，可用于规模化制备符合c-gmp标准河豚毒素原料药(api)，使河豚毒素作为合乎监管规范的候选药物开展临床试验成为可能。
[0087]
实施例
[0088]
提供下列实施例仅仅是为了说明的目的，不应当被解释为对本发明的限制。
[0089]
nmr波谱记录在安装有aspect 3000计算机和5mm 1
h/
13
c双探头的bruker ac 250傅里叶变换nmr波谱仪上。在dmso-d6(或cdcl3)溶液中，在313k的探针温度下研究化合物。把仪器锁定在dmso-d6(或cdcl3)的氘信号上。化学位移用距离作为内标的tms的低场的ppm表示。
[0090]
hplc条件
[0091]
使用装有agilent eclipse plus c18,4.6*50mm,3.5um柱子的agilent technologies hplc系统进行分析。在3.5分钟里，进行95％的0.1％h3po4水溶液和5％乙腈至5％的0.1％h3po4水溶液和95％乙腈的梯度洗脱，5％0.1％h3po4水溶液和95％乙腈继续洗脱1.5分钟。流速设为2.0ml/min。柱温设为35℃。检测波长为210nm。
[0092]
手性hplc条件(化合物vi-a和vi-b)
[0093]
使用装有ad-h,4.6*250mm,5um柱子的agilent technologies hplc系统进行分析。在25分钟里，用85％的1％三氟乙酸正己烷溶液和15％的1％三氟乙酸乙醇溶液洗脱。流速设为0.5ml/min。检测波长为205nm。
[0094]
本发明具体实施中使用的原料、试剂、设备均为市售产品。试剂可以获得自药明览博(武汉)化学科技有限公司、上海泰坦科技股份有限公司、萨恩化学技术(上海)有限公司、上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
[0095]
实施例1：式iii化合物的制备
[0096][0097]
室温下，将12克化合物ii和6克碳酸钾分散在300毫升甲醇中，室温搅拌18小时，hplc检测原料消失，过滤除去沉淀物，滤液常温旋蒸除去大部分甲醇。随后加入300毫升水，用300毫升乙酸乙酯萃取反应液三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤、旋干后用乙酸乙酯-石油醚(1:3)硅胶柱层析得到白色泡沫状固体化合物iii(7.3克，收率75％)。1h nmr(cdcl3,400mhz):δ5.16(s,1h),5.02(d,j＝6.9hz,1h),5.01(s,1h),4.42(s,1h),4.41(d,j＝6.9hz,1h),4.37(d,j＝10.1hz,1h),4.32(s,1h),4.25(d,j＝10.1hz,1h),3.48(br s,
1h),3.44(s,3h),1.46(s,9h),1.43(s,3h),1.38(s,3h),1.29(s,3h)。
[0098]
实施例2：式iv化合物的制备
[0099][0100]
冰浴下，向6.9克化合物iii的240毫升无水乙腈溶液中加入现制tmsi溶液(0.32m)180毫升，室温反应15分钟，加入450毫升硫代硫酸钠溶液淬灭反应，分别用氯仿-甲醇(9:1)的混合溶剂450毫升萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到粗品化合物iv(5.4克)，无须纯化直接投入下一步反应。1h nmr(cdcl3,400mhz):δ6.34(br,2h),5.32(d,j＝7.2hz,1h),5.30(s,1h),4.79(d,j＝1.2hz,1h),4.42(d,j＝7.6hz,1h),4.39(s,1h),4.38(d,j＝10.0hz,1h),4.28(d,j＝10.4hz,1h),3.57(s,3h),3.36(t,j＝2.0hz,1h),2.03(d,j＝8.0hz,1h),1.46(s,3h),1.44(s,6h),1.38(s,3h),1.36(s,3h)。
[0101]
实施例3：式v化合物的制备
[0102][0103]
室温下，向5.4克粗品化合物iv、15毫升三乙胺和10克cbz-甲基硫脲的240毫升二氯甲烷溶液中加入15克氯化铜，室温反应5小时，加入450毫升水淬灭反应，随后用二氯甲烷200毫升萃取三次，无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后用石油醚-乙酸乙酯硅胶柱层析(3:1)得到白色泡沫状固体化合物v(8.58克，两步收率86％)。1h nmr(cdcl3,400mhz):δ11.7(s,1h),8.8(s,1h),7.38-7.30(m,10h),5.24(d,j＝7.8hz,1h),5.21(s,1h),5.18(d,j＝13.0hz,1h),5.13(s,1h),5.04(d,j＝13.0hz,1h),4.58(s,1h),4.47(d,j＝7.8hz,1h),4.31(s,1h),4.28(s,2h),3.91(s,1h),3.25(s,3h),1.36(s,3h),1.31(s,3h),1.24(s,3h),1.21(s,3h)
[0104]
实施例4：式vi-a和式vi-b化合物的制备
[0105][0106]
室温下，将7.48克化合物v溶解在三氟乙酸70毫升和水70毫升的混合溶剂中，随后加热60℃反应18小时，hplc检测原料反应完全，反应液50℃浓缩干后用手性hplc制备(chiralpak ad-h，n-hexane：etoh＝75：25)得到白色固体化合物vi-a(2.28克，收率：
46％)，化合物vi-b(1.28克，收率：27％)。化合物vi-a：1h nmr(cd3od,400mhz):δ7.39-7.29(m,5h),5.56(s,1h),5.09(m,2h),4.48(d,j＝1.8hz,1h),4.17(m,2h),4.02(m,2h),3.93(m,2h),2.26(d,j＝9.2hz,1h)；化合物vi-b：1h nmr(cd3od,400mhz):δ7.38-7.26(m,5h),5.28(s,1h),5.07(s,2h),4.48(d,j＝1.8hz,1h),4.42(s,1h),4.16(br s,1h),4.02(d,j＝1.8hz,1h),3.97(d,j＝11.9hz,1h),3.90(d,j＝11.9hz,1h),2.70(d,j＝2.8hz,1h)。
[0107]
实施例5：式vi-b化合物的循环利用
[0108][0109]
室温下，将1.28克化合物v溶解在三氟乙酸7毫升和水70毫升的混合溶剂中，随后加热60℃反应24小时，hplc检测至化合物vi-a和化合物vi-b比例恒定，反应液50℃浓缩干后用手性hplc制备(chiralpak ad-h，n-hexane：etoh＝75：25)得到白色固体化合物vi-a(1.13克，收率：88％)，化合物vi-b(0.14克，收率：12％)。
[0110]
实施例6：式ttx化合物的制备
[0111][0112]
室温下，向2.39克化合物vi-a的150毫升甲醇溶液中加入500毫克10％的湿钯碳，氢化反应3小时，hplc检测原料反应完全，通过微孔滤膜过滤除去催化剂，用500毫升0.05m的乙酸水溶液淋洗滤饼，滤液45℃减压浓缩后得到化合物ttx(1.65克，98％)。[α]
d 23-10.4
°
(c 0.25,0.05m acoh)；ir(neat,cm-1):3211,1658,1608,1186,1126,1076,979；1hnmr(1％cf3cood/4％cd3cood/95％d2o,400mhz):δ5.49(d,j＝9.6hz,1h),4.27(br s,1h),4.23(br s,1h),4.06(s,1h),4.02(d,j＝7.0hz,1h),4.00(d,j＝7.0hz,1h),3.94(s,1h),2.33(d,j＝9.6hz,1h)；
13
cnmr(1％cf3cood/4％cd3cood/95％d2o,100mhz):δ156.7(c),110.9(c),79.8(ch),75.2(ch),74.0(ch),72.9(ch),71.6(c),71.0(ch),65.6(ch),59.8(c),40.8(ch)；hrms(esi

):calcd for c
11h18
n3o8([m h]

):320.1094,found:320.1094。所有分析数据与文献报道一致。
[0113]
虽然本发明已阐述并描述了典型的实施方案，但本发明并不限于所述细节。由于各种可能的修改和替换没有背离本发明的精神，本领域技术人员可使用常规试验能够想到的本发明的变型和等同，因此所有这些变型和等同都落入由以下权利要求书所定义的本发明的精神和范围内。