用于T细胞慢病毒感染的培养基及应用的制作方法

用于t细胞慢病毒感染的培养基及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及用于t细胞慢病毒感染的培养基及应用，更具体地，本发明涉及用于t细胞慢病毒感染的培养基以及慢病毒感染t细胞的方法。


背景技术：

2.目前，t细胞感染难度极大，慢病毒感染t细胞的效率受制于病毒滴度和培养基条件，实现高效慢病毒感染难度非常大。t细胞在anti-cd3/cd28抗体磁珠激活后，在普通t细胞培养基(只添加il2或者il-7、il-15、il-21)进行培养时，慢病毒感染效率极低(小于5％)。
3.因此，能够有效提高病毒感染效率的方法仍需要进一步开发。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，针对现有技术中感染效率低的问题，本技术的发明人向t细胞无血清培养基中添加了促感染成分(人血清以及血清替代物)，进行添加物浓度和感染方法摸索，有效提高了慢病毒对t细胞感染效率，形成了一种新型提高t细胞感染效率的方法。
5.在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于t细胞慢病毒感染的培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括t细胞基础培养基以及人血清。发明人发现，所述培养基中添加人血清相比于添加胎牛血清，在提高慢病毒感染t细胞的效率方面，效果更加显著。根据本发明实施例的培养基用于慢病毒感染t细胞，在不增加病毒滴度(病毒量)的前提下，大大提高了病毒感染效率。
6.根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
7.根据本发明的实施例，所述人血清是通过如下方法制备得到的：将人全血在4℃，1000g的条件下离心10分钟，以便获得上清，所述上清为人血清。
8.根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括血清替代物；优选地，所述血清替代物为cts
tm immune cell血清替代物。发明人发现，培养基中进一步含有血清替代物，病毒的感染效率进一步提高。
9.根据本发明的实施例，所述人血清在所述培养基中的体积分数为1.3％-2.6％。
10.根据本发明的实施例，所述血清替代物在所述培养基中的体积分数为1％-2％。
11.根据本发明实施例的培养基中，人血清或血清替代物的含量在上述范围内，可进一步提高慢病毒感染t细胞的效率。
12.根据本发明的实施例，所述人血清与所述血清替代物的体积比为(1～1.5)：1，优选地，体积比为1.3：1。
13.需要说明的是，本技术所述的“t细胞基础培养基”是指可用于t细胞培养的培养基，可购买获得，也可自行配置获得。根据本发明的具体实施例，所述t细胞基础培养基包括imdm(iscove's modified dulbecco's medium)培养基、人血清白蛋白(hsa)、转铁蛋白、胰
岛素、不饱和脂肪酸以及胆固醇。
14.根据本发明的具体实施例，所述人血清白蛋白在所述t细胞基础培养基中的含量为1.3～1.8g/l,所述转铁蛋白在所述t细胞基础培养基中的含量为38～42mg/l，所述胰岛素在所述t细胞基础培养基中的含量为0.1～10mg/l，所述不饱和脂肪酸在所述t细胞基础培养基中的含量为5～50μmol/l、所述胆固醇在所述t细胞基础培养基中的含量为55～70g/l。
15.根据本发明的具体实施例，所述imdm基础培养基、hsa、转铁蛋白、胰岛素、不饱和脂肪酸、胆固醇是以灏洋培养基cart-505产品的形式提供的。
16.根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括hil7、hil15和hil21，任选地，所述hil7、hil15、hil21在所述培养基中的浓度分别独立地为38～42u/ml，优选地，40u/ml。
17.在本发明的第二方面，本发明提出了一种慢病毒感染t细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将t细胞在前面所述的培养基中进行激活培养；将慢病毒在转染混合物存在的条件下对激活的t细胞进行转染处理，所述转染混合物以前面所述的培养基为基质；将转染了慢病毒的t细胞进行孵育和扩增培养。根据本发明实施例的方法，极大节约了病毒制备成本，病毒感染效率高，且操作简单，感染后细胞活率较高，大于90％。
18.根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
19.根据本发明的实施例，所述激活培养是通过如下方式进行的：将t细胞以每毫升培养基中包含106个细胞的密度接种于培养孔板中；将接种后的t细胞在dynabeads human t-activator cd3/cd28存在的条件下进行第一培养。
20.具体地，所述第一培养是在37℃，5％co2条件下进行24～28小时。
21.具体地，所述t细胞与dynabeads human t-activator cd3/cd28的用量比为106个细胞：25μl。
22.具体地，将进行了第一培养后的t细胞在二倍量培养基的条件下进行第二培养24～28小时。此处“二倍量培养基”是指在第二培养中，培养基的用量是第一培养中培养基的用量的2倍。
23.根据本发明的实施例，所述转染混合物中每300μl基质包含0.32μl polybrene。
24.根据本发明的实施例，所述慢病毒是以慢病毒液的形式提供的，基于每300μl基质，将100μl的所述慢病毒液对激活的106个t细胞进行转染处理，所述慢病毒液的moi为1-2。
25.根据本发明的实施例，转染处理后、孵育处理前，进一步包括将转染了慢病毒的t细胞进行离心处理，所述离心处理是在转速为1000g的条件下进行40min。发明人发现，将转染了慢病毒的t细胞在上述条件下进行离心处理，可进一步提高慢病毒感染t细胞的效率。
26.根据本发明的实施例，所述将转染了慢病毒的t细胞进行孵育和扩增培养是在扩增培养基中进行的，所述扩增培养基包括t细胞基础培养基以及hil7、hil15、hil21。
27.具体地，所述t细胞基础培养基包括imdm培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、不饱和脂肪酸以及胆固醇。
28.具体地，所述人血清白蛋白在所述t细胞基础培养基中的含量为1.3～1.8g/l,所述转铁蛋白在所述t细胞基础培养基中的含量为38～42mg/l，所述胰岛素在所述t细胞基础培养基中的含量为0.1～10mg/l，所述不饱和脂肪酸在所述t细胞基础培养基中的含量为5
～50μmol/l、所述胆固醇在所述t细胞基础培养基中的含量为55～70g/l。所述hil7、hil15、hil21在所述扩增培养基中的浓度分别独立地为38～42u/ml，优选地，40u/ml。
29.根据本发明的具体实施例，所述扩增培养基为t细胞培养基-2。
30.根据本发明的实施例，所述孵育处理的时间为15-24h。
31.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
32.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
33.图1是根据本发明实施例的不同慢病毒感染t细胞的条件下，流式检测car 比率结果图；以及
34.图2是根据本发明实施例的培养基中加入5％fbs或1％sr条件下，慢病毒感染t细胞后流式检测car 比率结果。
具体实施方式
35.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
36.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
37.根据本发明的实施例，本发明提出的慢病毒感染t细胞的方法包括以下步骤：
38.1、t细胞激活培养
39.(1)新鲜分离的t细胞或者复苏的t细胞进行计数(血球计数板法或者ao/pi荧光计数法)；
40.(2)使用t细胞培养基-1(t细胞基础培养基加入血清替代物和人血清，浓度分别为1％-2％，1.3％-2.6％，hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml)以106cells/ml的密度接种于培养孔板中，同时加入能够促进t细胞扩增和活化的dynabeads human t-activator cd3/cd28，25μl/106cells，37℃，5％co2培养箱培养。
41.其中，t细胞基础培养基包括imdm培养基、人血清白蛋白(hsa)、转铁蛋白、胰岛素、不饱和脂肪酸以及胆固醇，其中，人血清白蛋白在t细胞基础培养基中的含量为1.3～1.8g/l，转铁蛋白在t细胞基础培养基中的含量为38～42mg/l，胰岛素在t细胞基础培养基中的含量为0.1～10mg/l，不饱和脂肪酸在t细胞基础培养基中的含量为5～50μmol/l，胆固醇在t细胞基础培养基中的含量为55～70g/l。
42.(3)激活第二天，添加一倍的t细胞培养基-1(t细胞基础培养基加入血清替代物和人血清，浓度分别为1％-2％，1.3％-2.6％,hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml)。
43.2、t细胞感染
44.(1)细胞激活第三天，收集细胞，置于dynamag-15磁力架上2min，去除磁珠。
45.(2)收集去磁珠后的细胞悬液，300g，常温(rt)，5min，离心收集细胞。
46.(3)于24孔板中配制如下病毒感染体系：1*10^6活细胞 0.32μl polybrene(母液浓度10μg/μl) 300μl t细胞培养基-1(t细胞基础培养基加入血清替代物和人血清以及hil7、hil15和hil21，血清替代物和人血清的浓度分别为1％-2％，1.3％-2.6％,hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml) 病毒液(体积100μl，moi＝1-2)。
47.培养板利用水平转头离心机1000g，常温离心40min后，置于培养箱中培养过夜。
48.细胞与病毒共孵育15-24h后，收集细胞，300g，rt，5min，离心计数，并以106/ml密度进行接种，培养基为t细胞培养基-2(t细胞基础培养基以及hil7、hil15和hil21，hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml)。
49.感染第2天，收集细胞，300g，rt，5min，离心计数，并以106/ml密度进行接种,培养基为t细胞培养基-2(t细胞基础培养基以及hil7、hil15和hil21，hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml)。
50.3、t细胞慢病毒感染效率检测
51.(1)细胞感染病毒第三天，收集细胞，300g，rt，10min，离心计数。
52.(2)收集部分细胞，用流式检测慢病毒目的蛋白的表达。
53.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
54.实施例1
55.一、实验材料
56.细胞：人pbmc分离t细胞经dynabeads human t-activator cd3/cd28 for t cell expansion and activation刺激3天后去磁珠。
57.试剂：cart培养基(灏洋cart-505)(此实施例中作为t细胞基础培养基)、dynabeads human t-activator cd3/cd28、pbs、dapi、human il-21、human il-7、human il-15、polybrene、glutamax-1(100x)、血清替代物cts
tm immune cell sr、自制人血清(将新鲜采集的人全血，在4℃，1000g的条件下离心10分钟，以便收集上清，即获得的自制人血清)；
58.设备：细胞培养箱(thermo 150i)、超净工作台(苏州安泰)、beckman离心机(x-15r)、细胞计数仪(countstar)、倒置显微镜(leica dm il led)、4℃冰箱(海尔hyc390)、-20℃冰箱(海尔)、负压吸引器(鱼跃)、移液枪(eppendorf)、bd流式细胞仪、制冰机
59.以下实验中使用的t细胞培养基-1包括t细胞基础培养基、血清以及hil7、hil15和hil21，hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml，其中，血清为浓度为1.3％人血清；或浓度为2.6％的人血清；或浓度分别为1％、1.3％的血清替代物和人血清；或浓度分别为2％、2.6％的血清替代物和人血清。
60.t细胞培养基-2包括t细胞基础培养基以及hil7、hil15和hil21，hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml。
61.二、实验方法
62.实验组：t细胞经过添加不同浓度促感染成分的cart培养基中培养后，进行慢病毒感染。
63.对照组：t细胞经过添加促感染成分的cart培养基中培养后，进行慢病毒感染
[0064][0065]
1、t细胞激活培养
[0066]
(1)新鲜分离的t细胞或者复苏的t细胞进行计数(血球计数板法或者ao/pi荧光计数法)；
[0067]
(2)实验组使用5ml t细胞培养基-1以5*106cells t的密度于培养孔板中，同时加入125μl dynabeads human t-activator cd3/cd28，37℃，5％co2培养箱培养。对照组则用相同细胞量，使用体积t细胞培养基-2进行培养，其他条件一致；
[0068]
(3)激活第二天，实验组添加5ml t细胞培养基-1。对照组添加相同体积t细胞培养基-2。
[0069]
2、t细胞感染
[0070]
(1)细胞激活第三天，收集细胞，置于dynamag-15磁力架上2min，去除磁珠。
[0071]
(2)去磁珠后的细胞悬液，300g，rt，5min，离心收集细胞。
[0072]
(3)实验组于24孔板中配制如下病毒感染体系：1*106活细胞 0.32μl polybrene(母液浓度10μg/μl) 300μl t细胞培养基-1 病毒液(moi＝2)(multiplicity of infection感染复数＝病毒数量/待感染的细胞数量)。对照组t细胞感染时使用t细胞培养基-2，其他条件一致；
[0073]
(4)培养板1000g，rt，离心40min后，置于培养箱中培养过夜。
[0074]
(5)细胞与病毒共孵育15h后，吹打培养基后形成细胞悬液离心，收集细胞，300g，rt，5min，离心计数，并以10^6/ml密度进行接种，实验组培养基为t细胞培养基-2。
[0075]
(6)感染第2天，收集细胞，300g，rt，5min，离心计数，并以10^6/ml密度进行接种,培养基为t细胞培养基-2。
[0076]
3、t细胞慢病毒感染效率检测(car膜蛋白分子检测)
[0077]
细胞感染病毒后第三天，收集细胞，实验组和对照组分别取1*10^6细胞，用pbs 1ml/次、300g 5min离心洗涤2次。
[0078]
各组染色取0.5*10^6细胞，于100μl stain buffer中重新加入1μl protein l(1mg/ml)4℃染色1h后，收集细胞，用1ml stain buffer/次，300g 5min离心洗涤2次，用200μl stain buffer重悬流式分析。非染色组除了不加protein l，其余操作跟染色组保持一致。同时，t细胞作为染色对照进行染色。于bd流式细胞仪中进行流式检测。
[0079]
三、实验结论
[0080]
图1是不同方法对t细胞感染后，细胞car 比率情况。car 比率越高，显示感染效果越好。显示感染效率由大到小依次为：实验组-2(20.05％)》实验组-1(18.16％)》实验组-4(14.63％)》实验组-3(14.52％)，由此得到以下结论：感染效率方面，添加了人血清和血清替代物的效率高于添加了人血清的效率，添加了人血清的效率大于没有添加人血清无血清替代物的效率，且添加的人血清和血清替代物的浓度不是越大越好，添加的人血清和血清替代物的浓度分别在1.3％-2.6％和1％-2％范围内，且二者的浓度比为1.3：1，病毒感染效率较高。
[0081]
新型感染方法有效提高了t细胞的慢病毒感染效率。
[0082]
实施例2
[0083]
一、实验材料
[0084]
细胞：人pbmc分离t细胞经dynabeads human t-activator cd3/cd28 for t cell expansion and activation刺激3天后去磁珠。
[0085]
试剂：cart培养基(灏洋cart-505)(此实施例中作为t细胞基础培养基)、dynabeads human t-activator cd3/cd28、pbs、dapi、human il-21、human il-7、human il-15、polybrene、glutamax-1(100x)、胎牛血清、血清替代物cts
tm immune cell sr、自制人血清；
[0086]
设备：细胞培养箱(thermo 150i)、超净工作台(苏州安泰)、beckman离心机(x-15r)、细胞计数仪(countstar)、倒置显微镜(leica dm il led)、4℃冰箱(海尔hyc390)、-20℃冰箱(海尔)、负压吸引器(鱼跃)、移液枪(eppendorf)、bd流式细胞仪、制冰机
[0087]
以下实验中使用的t细胞培养基-1包括t细胞基础培养基、血清以及hil7、hil15和hil21，hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml，其中，血清为浓度为5％胎牛血清；或浓度为1％血清替代物；或浓度分别为1％、1.3％的血清替代物和人血清。
[0088]
t细胞培养基-2包括t细胞基础培养基以及hil7、hil15和hil21，hil7、hil15和hil21浓度均为含量为40u/ml。
[0089]
二、实验方法
[0090]
实验组：t细胞经过添加不同浓度促感染成分的cart培养基中培养后，进行慢病毒感染。
[0091]
对照组：t细胞经过添加促感染成分的cart培养基中培养后，进行慢病毒感染
[0092]
1、t细胞激活培养
[0093]
(1)新鲜分离的t细胞或者复苏的t细胞进行计数(血球计数板法或者ao/pi荧光计数法)；
[0094]
(2)实验组使用5ml t细胞培养基-1以5*10^6cells t的密度于培养孔板中，同时加入125μl dynabeads human t-activator cd3/cd28，37℃，5％co2培养箱培养。对照组则用相同细胞量使用体积t细胞培养基-2进行培养，其他条件一致；
[0095]
(3)激活第二天，实验组添加5ml t细胞培养基-1。对照组添加相同体积t细胞培养基-2。
[0096]
2、t细胞感染
[0097]
(1)细胞激活第三天，收集细胞，置于dynamag-15磁力架上2min，去除磁珠。
[0098]
(2)去磁珠后的细胞悬液，300g，rt，5min，离心收集细胞。
[0099]
(3)实验组于24孔板中配制如下病毒感染体系：1*10^6活细胞 0.32μl polybrene(母液浓度10μg/μl) 100μl t细胞培养基-1 病毒液(moi＝2)。对照组t细胞感染时使用t细胞培养基-2，其他条件一致；
[0100]
(4)培养板1000g，rt，离心40min后，置于培养箱中培养过夜。
[0101]
(5)细胞与病毒共孵育15h后，收集细胞，300g，rt，5min，离心计数，并以10^6/ml密度进行接种，实验组培养基为t细胞培养基-2。
[0102]
(6)感染第2天，收集细胞，300g，rt，5min，离心计数，并以10^6/ml密度进行接种，培养基为t细胞培养基-2。
[0103]
3、t细胞慢病毒感染效率检测(car膜蛋白分子检测)
[0104]
细胞感染病毒后第三天，收集细胞，实验组和对照组分别取1*10^6细胞，用pbs 1ml/次、300g 5min离心洗涤2次。
[0105]
各组染色取0.5*106细胞，于100μl stain buffer中重新加入1μl protein l(1mg/ml)4℃染色1h后，收集细胞，用1ml stain buffer/次，300g 5min离心洗涤2次，用200μl stain buffer重悬流式分析。非染色组除了不加protein l，其余操作跟染色组保持一致。同时，t细胞作为染色对照进行染色。于bd流式细胞仪中进行流式检测。
[0106]
三、实验结论
[0107]
图2是不同方法对t细胞感染后，细胞car 比率情况。car 比率越高，显示感染效果越好。显示培养基中加入5％胎牛血清，细胞感染效率提高不明显；1％sr能提高t细胞的慢
病毒感染效率，但不能达到较高水平。
[0108]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0109]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。