一种chi3l1单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及化学发光免疫诊断技术领域，特别是涉及一种chi3l1单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
2.壳多糖酶3样蛋白1(ehifinase 3-like 1，chi3l1)常被称为ykl-40，是一种含383个氨基酸，分子量42.6kd的单体糖基化蛋白，为糖基水解酶家族成员之一。它可以结合壳多糖，但没有壳多糖酶的活性。
3.chi3l1在肝脏中高度特异表达，且能够在肝脏库普弗细胞中被诱导表达从而激活肝脏星状细胞，可能直接参与肝纤维化的形成和维持。chi3l1肝纤维化检测可以用来协助诊断病毒性肝炎、酒精性肝硬化和脂肪肝等导致的肝纤维化和肝硬化，同时能够比较精准区分不同时期的肝纤维化，对患者进行抗病毒治疗或抗纤维化治疗的指导有一定的意义。血清chi3l1的表达水平可作为一种高灵敏度高特异性的肝纤维化诊断和分期的诊断标志物。
4.目前临床常用的chi3l1检测方法主要是酶联免疫分析法，近两年国内厂家开始开发基于化学发光免疫分析、荧光层析等的临床诊断产品。这些技术都建立在抗原与抗体特异性相互性作用基础上，特异性的抗体对是这些检测方法的核心原材料。
5.chi3l1是近年来发现的新的诊断标志物，可用的抗体很少，多肽作为免疫原制备单克隆抗体特异性较好，但由于抗原位点单一，可选择性不多，很难满足不同方法学检测的需要。蛋白折叠主要基于一级氨基酸序列内部作用力及蛋白修饰的作用，重组蛋白结构更接近天然蛋白，而多肽序列与天然蛋白结构的相似度会更差一点，因此会影响所获得单克隆抗体与天然蛋白的结合力，对于灵敏度要求较高的检测试剂产生影响。此外，多抗生产的批间差控制难度较大也会影响其在诊断试剂开发中的应用。
技术实现要素：
6.为了克服上述现有技术的不足，一方面，本发明提供了一种chi3l1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：使用抗原对动物进行免疫，获得免疫细胞；将免疫细胞和融合伴侣细胞融合，并且挑选出阳性融合细胞；对阳性融合细胞进行亚克隆得到克隆化的融合细胞，克隆化的融合细胞可以分泌单克隆抗体；其中，抗原为重组抗原p1或重组抗原p2，重组抗原p1对应chi3l1序列中31-149aa基因序列，重组抗原p2对应chi3l1序列中248-383aa基因序列；单克隆抗体为p1来源的单抗或p2来源的单抗。
7.在本实例中，基于对chi3l1蛋白序列特异性（blast）、抗原性（antigenic index）、
表面可能性（surface probability）的生物信息学分析，分别选取31-149aa、248-383aa两段大肠杆菌重组表达作为免疫原。重组蛋白作为免疫原产量高，制备方便，可以获得多位点的单克隆抗体，多种的配对方式可用满足不同方法学检测的需要。本发明采用单抗对单抗方式，特异性高，并且单克隆抗体的生产易于控制批间差异，因而容易满足诊断试剂的批量生产和临床诊断的需求。单克隆抗体的宿主动物一般选用balb/c小鼠，并且取小鼠的脾脏轻轻研磨分离得到上述的免疫细胞。融合伴侣细胞一般选用骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞和免疫细胞的比例一般在1：1至1：10之间；优选比例为1：1至1：5；更优选的，骨髓瘤细胞和免疫细胞的比例为1：1。进一步对阳性融合细胞扩大培养，亚克隆的次数由抗体分泌能力强弱和抗原的免疫原性强弱决定，本方案中亚克隆的次数在2-5次为宜；优选的，亚克隆次数为3-4次。
8.在一个具体实例中，抗原的制备包括以下步骤：31-149aa基因序列采用bamh1、hindiii双酶切，然后与采用相同内切酶酶切的pet30a质粒连接并转化大肠杆菌感受态细胞，表达纯化得到重组抗原p1。
9.在本实例中，需要先对31-149aa对应的基因序列的n端添加6
×
his标签，两端分别添加酶切位点bamh1、hindiii，然后使用bamh1、hindiii双酶切。表达纯化的具体步骤如下：使用lb培养基进行培养，加入iptg诱导培养得到固体菌，离心洗涤，破碎后再离心，用不同浓度的咪唑梯度洗脱，得到纯化的重组抗原。其中，破碎的次数在3-5次，第一次破碎的压强应小一些，500bar为宜，之后的破碎压强维持在1000bar左右，具体的，可以是900-1200bar。使用咪唑进行清洗时，咪唑浓度依次上升，举例来说其浓度可以是：100mm、150 mm、250 mm、500 mm。
10.在一个具体实例中，抗原的制备包括以下步骤：248-383aa基因序列采用ecor1、xho1双酶切，然后与采用相同内切酶酶切的pet30a质粒连接并转化大肠杆菌感受态细胞，表达纯化得到重组抗原p2。
11.在本实例中，需要先对248-383aa对应的基因序列的c端添加6
×
his标签，两端分别添加酶切位点ecor1、xho1，然后用ecor1、xho1双酶切。
12.在一个具体实例中，通过间接elisa法，采用真核表达全长chi3l1和几丁质酶1挑选出阳性融合细胞。
13.在本实例中，采用真核表达全长chi3l1及几丁质酶1(chit1)用于克隆筛选，可以确保所获得单克隆抗体与天然蛋白的高亲和力及特异性。
14.在一个具体实例中，阳性融合细胞为全长chi3l1阳性且几丁质酶1阴性的细胞。
15.在一个具体实例中，制备方法还包括以下步骤：抗体配对：在捕获抗体中加入真核表达全长chi3l1，进行免疫反应，清洗后加入标记抗体，清洗后加入显色剂，显色则配对成功；当捕获抗体为p1来源的单抗时，标记抗体为p2来源的单抗；当捕获抗体为p2来源的单抗时，标记抗体为p1来源的单抗。
16.在本实例中，将获得的p1来源的单抗和p2来源的单抗分别作为捕获抗体和标记抗体，将捕获抗体进行包被孵育；首先加入真核表达全长chi3l1作为抗原，孵育清洗；然后加入标记抗体，孵育清洗；最后加入显色剂显色，读取od值，当od值大于阴性对照组的2.1倍时，说明标记抗体和抗原特异性结合，可以配对。孵育的温度为37℃，时间为1-2小时，优选1
小时。显色剂优选sa-hrp。上述的清洗操作至少重复三次，具体的，使用pbst清洗3-4次。进行抗体配对前前先使用生物素对抗体进行标记，每2mg抗体加入30mg/ml的生物素5-10μl，优选5μl。
17.另一方面，本发明还提供一种chi3l1单克隆抗体，由上述任一实例提供的方法制备得到。
18.在一个具体实例中，上述chi3l1单克隆抗体可以应用于磁微粒化学发光免疫诊断。
19.再一方面，本发明还提供一种chi3l1检测试剂盒，包括：发光试剂和固相试剂；其中，发光试剂和固相试剂均由上述chi3l1单克隆抗体制备得到。
20.在本实例中，当发光试剂为p1来源的单抗时，固相试剂为p2来源的单抗；当发光试剂为p2来源的单抗时，固相试剂为p1来源的单抗。
21.再一方面，本发明还提供一种chi3l1单克隆抗体的应用，将上述chi3l1单克隆抗体应用于磁微粒化学发光免疫诊断。
22.采用本发明的技术方案所能达到的效果：1. 将获得的单克隆抗体对用于磁微粒化学发光免疫诊断试剂，灵敏度达到1ng/ml，远低于酶联免疫试剂盒，相关性系数r2＞0.95，满足临床诊断的需求。
23.2.采用真核表达全长chi3l1及几丁质酶1(chit1)用于克隆筛选确保所获得单克隆抗体与天然蛋白的高亲和力及特异性。此外，单克隆抗体生产易于控制批间差，利于满足诊断试剂的批量生产及临床诊断需求。
附图说明
24.图1为纯化的重组抗原p1的电泳图。
25.图2为纯化的重组抗原p2的电泳图。
26.图3为固相试剂为p1来源的单抗时的相关性和特异性检测数据统计图。
27.图4为固相试剂为p2来源的单抗时的相关性和特异性检测数据统计图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1一、抗原的制备1.基因合成及载体构建合成chi3l1全长序列中31-149aa对应的基因序列p1，n端添加6
×
his标签，两端分别添加酶切位点bamh1、hindiii；用bamh1、hindiii双酶切，与采用相同内切酶酶切的pet30a质粒连接并转化大肠杆菌感受态细胞。合成chi3l1全长序列中248-383aa对应的基因序列p2，c端添加6
×
his标签，两端分别添加酶切位点ecor1、xho1；用ecor1、xho1双酶切，与采用相同内切酶酶切的pet30a质粒连接并转化大肠杆菌感受态细胞。各挑5个单克隆送
测序。
30.2.诱导表达及纯化测序正确的克隆以0.5%接种于500ml lb培养基中（kan ），培养5h后，加入终浓度0.5mm iptg，25℃过夜诱导培养。
31.收集诱导后的固体菌，7500rpm，15min，pbs洗涤两次，用70ml平衡缓冲液（20mm tris，150mm nacl，40mm咪唑）复溶；放入均质机中破碎，破碎前加入50mg/l核酸酶、1.5mmpmsf蛋白抑制剂、无水乙醇溶液乳化，分多次加。
32.破碎4次，压强分别为500bar、1000bar、1000bar、1000bar，破碎后离心，12000rpm，30min取上清。
33.平衡缓冲液（20mm tris，150mm nacl，40mm咪唑）平衡ni柱，上样，平衡，分别用100mm、150 mm、250 mm、500 mm咪唑梯度洗脱，收集目标峰，sds胶检测蛋白纯度。
34.纯化蛋白20mm pbs透析3次，测浓度，分装冻存备用。
35.参见图1和图2，分别为重组抗原p1电泳图和重组抗原p2的电泳图，可见本实施例制备的抗原纯度较高，满足实验需求。
36.二、chi3l1单克隆抗体的制备1.动物免疫挑选6-8周龄身体强壮的雌性balb/c小鼠用进行免疫。首次免疫，采用弗氏完全佐剂，100μg/小鼠，腋下多点注射；加强免疫，采用弗氏不完全佐剂，50μg/小鼠，加强免疫3次；首次免疫与第二次免疫间隔3周，加强免疫间隔2周。最后一次免疫后1周眼球采血，真核表达全长chi3l1包被酶标板，间接elisa方法测定抗血清效价。融合前3天，100μg抗原/小鼠腹腔注射冲击。
37.2.细胞融合及单克隆抗体制备已提前冲击的小鼠断颈处死，75%乙醇中浸泡灭菌。超净工作台中，无菌条件下取出小鼠脾脏，用已灭菌处理的毛玻璃片挤压并轻轻研磨脾脏分离脾脏细胞，脾脏细胞计数。以骨髓瘤细胞和脾细胞1:1的比例混合，室温下300g离心5分钟，弃上清。加入1mlpeg，让peg和细胞充分均匀混合，此过程3分钟内完成。加50ml新鲜培养基，室温300g离心5分钟， hat培养基重悬，轻轻混匀。100ul/孔加入到96孔板中，放入培养箱中培养。
38.96孔板中细胞长至1/3底面积时更换ht培养基，真核表达全长chi3l1及几丁质酶1包被，间接法elisa检测，挑选全长chi3l1阳性且几丁质酶1阴性的克隆。经过3-4次亚克隆，确保形成单克隆时扩大培养，并进行腹水细胞注射，抗体纯化。
39.三、chi3l1单克隆抗体配对1.抗体标记将抗体用1ｘpbs稀释至浓度1mg/ml，每2mg抗体加入生物素（30mg/ml ，ez-link nhs-peg4-biotin，thermo）5ul并迅速混匀。混匀后，盛有混合液的离心管放在垂直搅拌器上反应30min，或4℃过夜。生物素化后的抗体用1
×
pbs透析3次，每4小换液一次。
40.2.抗体配对将p1免疫来源的克隆抗体每孔2μg/mlｘ100μl，37℃孵育1h包被；200μl 2%bsa封闭，37℃孵育1h，pbst清洗3次；每孔加入20ng/ml的真核表达全长chi3l1，设置不加抗原的阴性对照，37℃孵育1h，pbst清洗3次；加入p2免疫来源生物素标记抗体（1:200），37℃孵育
1h，pbst清洗3次；加入sa-hrp 1:2000，100μg，37℃孵育30min，pbst清洗4次；显色，450nm波长读取od值。od大于阴性对照孔的2.1倍，判定为可配对。
41.将p2免疫来源的克隆抗体每孔2μg/mlｘ100μl，37℃孵育1h包被；200μl 2%bsa封闭，37℃孵育1h，pbst清洗3次；每孔加入20ng/ml的真核表达全长chi3l1，每个配对设置不加抗原的阴性对照，37℃孵育1h，pbst清洗3次；加入p1免疫来源生物素标记抗体（1:200），37℃孵育1h，pbst清洗3次；加入sa-hrp 1:2000，100μg ，37℃孵育30min，pbst清洗4次；显色，450nm波长读取od值。od大于阴性对照孔的2.1倍，判定为可配对。
42.四、chi3l1检测试剂盒上述chi3l1单克隆抗体可以应用于磁微粒化学发光免疫诊断试剂盒，包括发光试剂和固相试剂，其制备方法如下。
43.1.发光试剂制备取约0.1mg捕获抗体，以摩尔比1:5-1：15加入吖啶酯标记，室温下避光混匀反应2h，pb避光透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至1-10μg/ml备用。
44.2.固相试剂制备取约0.1mg标记抗体，摩尔比1:5-1：15加入生物素标记，室温下混匀反应2h，pb透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至0.1-1mg/ml备用。
45.取约0.5ml磁珠，pb清洗三次后，稀释至1-10mg/ml，等体积加入生物素标记抗体，室温下混匀反应2h，用pbs-bsa清洗后三次，稀释至0.1-1mg/ml备用。
46.当捕获抗体为p1来源的单抗时，标记抗体为p2来源的单抗；当捕获抗体为p2来源的单抗时，标记抗体为p1来源的单抗。
47.实施例2一、试剂盒1的制备1.发光试剂制备：取约0.1mg p2来源的单抗，以摩尔比1:5-1：15加入吖啶酯标记，室温下避光混匀反应2h，pb避光透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至1-10μg/ml备用。
48.2.固相试剂制备：取约0.1mg p1来源的单抗，摩尔比1:5-1：15加入生物素标记，室温下混匀反应2h，pb透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至0.1-1mg/ml备用。
49.取约0.5ml磁珠，pb清洗三次后，稀释至1-10mg/ml，等体积加入生物素标记抗体，室温下混匀反应2h，用pbs-bsa清洗后三次，稀释至0.1-1mg/ml备用。
50.二、试剂盒2的制备1.发光试剂制备：取约0.1mg p1来源的单抗，以摩尔比1:5-1：15加入吖啶酯标记，室温下避光混匀反应2h，pb避光透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至1-10μg/ml备用。
51.2.固相试剂制备：取约0.1mg p2来源的单抗，摩尔比1:5-1：15加入生物素标记，室温下混匀反应2h，pb透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至0.1-1mg/ml备用。
52.取约0.5ml磁珠，pb清洗三次后，稀释至1-10mg/ml，等体积加入生物素标记抗体，室温下混匀反应2h，用pbs-bsa清洗后三次，稀释至0.1-1mg/ml备用。
53.三、样本及校准品检测梯度稀释真核表达全长chi3l1，用某国产注册试剂盒a检测重新赋值，选择5-1000ng/ml范围内5点作为定标点，并用自配发光试剂及固相试剂检测定标cl120化学发光免疫分析仪，测试条件：一步法，60μl 发光试剂、40μl 固相试剂、20μl样本，37℃孵育15min。
54.1.最低检测线：以5%牛血清做空白样本，连续测定25次，测试条件：一步法，60μl 发光试剂、40μl 固相试剂、20μl样本，37℃孵育15min。记录测试结果，分别计算平均值av、标准差sd，计算最低检测线lob = av 2sd。
55.参见表1，其为试剂盒1的检测结果，最低检测线lob为0.8552ng/ml。
56.表1参见表2，其为试剂盒2的检测结果，最低检测线lob为1.2863ng/ml。
57.表22.相关性及特异性：搜集39份阳性样本，理论值覆盖线性范围11-1000ng/ml，用某国产注册试剂盒a，参照说明书条件测试。相同的阳性样本，以及稀释浓度至200ng/ml的chi3l1全长抗原、chit1、civ、piiipnp、ha，用自配发光试剂及固相试剂进行检测，测试条件：一步法，60μl 发光试剂、40μl 固相试剂、20μl样本，37℃孵育15min。记录测试结果，计算自配试剂与进口试剂盒a测试相关性系数r2。
58.参见表3和图3，其为试剂盒1的检测结果；其中图3的横坐标为理论浓度，纵坐标为实测浓度，拟合得到相关性系数r2为0.9679。
59.表3参见表4和图4，其为试剂盒2的检测结果；其中，图4的横坐标为理论浓度，纵坐标为实测浓度，拟合得到相关性系数r2为0.9776。
60.表4最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术领域
1.本发明涉及化学发光免疫诊断技术领域，特别是涉及一种chi3l1单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
2.壳多糖酶3样蛋白1(ehifinase 3-like 1，chi3l1)常被称为ykl-40，是一种含383个氨基酸，分子量42.6kd的单体糖基化蛋白，为糖基水解酶家族成员之一。它可以结合壳多糖，但没有壳多糖酶的活性。
3.chi3l1在肝脏中高度特异表达，且能够在肝脏库普弗细胞中被诱导表达从而激活肝脏星状细胞，可能直接参与肝纤维化的形成和维持。chi3l1肝纤维化检测可以用来协助诊断病毒性肝炎、酒精性肝硬化和脂肪肝等导致的肝纤维化和肝硬化，同时能够比较精准区分不同时期的肝纤维化，对患者进行抗病毒治疗或抗纤维化治疗的指导有一定的意义。血清chi3l1的表达水平可作为一种高灵敏度高特异性的肝纤维化诊断和分期的诊断标志物。
4.目前临床常用的chi3l1检测方法主要是酶联免疫分析法，近两年国内厂家开始开发基于化学发光免疫分析、荧光层析等的临床诊断产品。这些技术都建立在抗原与抗体特异性相互性作用基础上，特异性的抗体对是这些检测方法的核心原材料。
5.chi3l1是近年来发现的新的诊断标志物，可用的抗体很少，多肽作为免疫原制备单克隆抗体特异性较好，但由于抗原位点单一，可选择性不多，很难满足不同方法学检测的需要。蛋白折叠主要基于一级氨基酸序列内部作用力及蛋白修饰的作用，重组蛋白结构更接近天然蛋白，而多肽序列与天然蛋白结构的相似度会更差一点，因此会影响所获得单克隆抗体与天然蛋白的结合力，对于灵敏度要求较高的检测试剂产生影响。此外，多抗生产的批间差控制难度较大也会影响其在诊断试剂开发中的应用。
技术实现要素：
6.为了克服上述现有技术的不足，一方面，本发明提供了一种chi3l1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：使用抗原对动物进行免疫，获得免疫细胞；将免疫细胞和融合伴侣细胞融合，并且挑选出阳性融合细胞；对阳性融合细胞进行亚克隆得到克隆化的融合细胞，克隆化的融合细胞可以分泌单克隆抗体；其中，抗原为重组抗原p1或重组抗原p2，重组抗原p1对应chi3l1序列中31-149aa基因序列，重组抗原p2对应chi3l1序列中248-383aa基因序列；单克隆抗体为p1来源的单抗或p2来源的单抗。
7.在本实例中，基于对chi3l1蛋白序列特异性（blast）、抗原性（antigenic index）、
表面可能性（surface probability）的生物信息学分析，分别选取31-149aa、248-383aa两段大肠杆菌重组表达作为免疫原。重组蛋白作为免疫原产量高，制备方便，可以获得多位点的单克隆抗体，多种的配对方式可用满足不同方法学检测的需要。本发明采用单抗对单抗方式，特异性高，并且单克隆抗体的生产易于控制批间差异，因而容易满足诊断试剂的批量生产和临床诊断的需求。单克隆抗体的宿主动物一般选用balb/c小鼠，并且取小鼠的脾脏轻轻研磨分离得到上述的免疫细胞。融合伴侣细胞一般选用骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞和免疫细胞的比例一般在1：1至1：10之间；优选比例为1：1至1：5；更优选的，骨髓瘤细胞和免疫细胞的比例为1：1。进一步对阳性融合细胞扩大培养，亚克隆的次数由抗体分泌能力强弱和抗原的免疫原性强弱决定，本方案中亚克隆的次数在2-5次为宜；优选的，亚克隆次数为3-4次。
8.在一个具体实例中，抗原的制备包括以下步骤：31-149aa基因序列采用bamh1、hindiii双酶切，然后与采用相同内切酶酶切的pet30a质粒连接并转化大肠杆菌感受态细胞，表达纯化得到重组抗原p1。
9.在本实例中，需要先对31-149aa对应的基因序列的n端添加6
×
his标签，两端分别添加酶切位点bamh1、hindiii，然后使用bamh1、hindiii双酶切。表达纯化的具体步骤如下：使用lb培养基进行培养，加入iptg诱导培养得到固体菌，离心洗涤，破碎后再离心，用不同浓度的咪唑梯度洗脱，得到纯化的重组抗原。其中，破碎的次数在3-5次，第一次破碎的压强应小一些，500bar为宜，之后的破碎压强维持在1000bar左右，具体的，可以是900-1200bar。使用咪唑进行清洗时，咪唑浓度依次上升，举例来说其浓度可以是：100mm、150 mm、250 mm、500 mm。
10.在一个具体实例中，抗原的制备包括以下步骤：248-383aa基因序列采用ecor1、xho1双酶切，然后与采用相同内切酶酶切的pet30a质粒连接并转化大肠杆菌感受态细胞，表达纯化得到重组抗原p2。
11.在本实例中，需要先对248-383aa对应的基因序列的c端添加6
×
his标签，两端分别添加酶切位点ecor1、xho1，然后用ecor1、xho1双酶切。
12.在一个具体实例中，通过间接elisa法，采用真核表达全长chi3l1和几丁质酶1挑选出阳性融合细胞。
13.在本实例中，采用真核表达全长chi3l1及几丁质酶1(chit1)用于克隆筛选，可以确保所获得单克隆抗体与天然蛋白的高亲和力及特异性。
14.在一个具体实例中，阳性融合细胞为全长chi3l1阳性且几丁质酶1阴性的细胞。
15.在一个具体实例中，制备方法还包括以下步骤：抗体配对：在捕获抗体中加入真核表达全长chi3l1，进行免疫反应，清洗后加入标记抗体，清洗后加入显色剂，显色则配对成功；当捕获抗体为p1来源的单抗时，标记抗体为p2来源的单抗；当捕获抗体为p2来源的单抗时，标记抗体为p1来源的单抗。
16.在本实例中，将获得的p1来源的单抗和p2来源的单抗分别作为捕获抗体和标记抗体，将捕获抗体进行包被孵育；首先加入真核表达全长chi3l1作为抗原，孵育清洗；然后加入标记抗体，孵育清洗；最后加入显色剂显色，读取od值，当od值大于阴性对照组的2.1倍时，说明标记抗体和抗原特异性结合，可以配对。孵育的温度为37℃，时间为1-2小时，优选1
小时。显色剂优选sa-hrp。上述的清洗操作至少重复三次，具体的，使用pbst清洗3-4次。进行抗体配对前前先使用生物素对抗体进行标记，每2mg抗体加入30mg/ml的生物素5-10μl，优选5μl。
17.另一方面，本发明还提供一种chi3l1单克隆抗体，由上述任一实例提供的方法制备得到。
18.在一个具体实例中，上述chi3l1单克隆抗体可以应用于磁微粒化学发光免疫诊断。
19.再一方面，本发明还提供一种chi3l1检测试剂盒，包括：发光试剂和固相试剂；其中，发光试剂和固相试剂均由上述chi3l1单克隆抗体制备得到。
20.在本实例中，当发光试剂为p1来源的单抗时，固相试剂为p2来源的单抗；当发光试剂为p2来源的单抗时，固相试剂为p1来源的单抗。
21.再一方面，本发明还提供一种chi3l1单克隆抗体的应用，将上述chi3l1单克隆抗体应用于磁微粒化学发光免疫诊断。
22.采用本发明的技术方案所能达到的效果：1. 将获得的单克隆抗体对用于磁微粒化学发光免疫诊断试剂，灵敏度达到1ng/ml，远低于酶联免疫试剂盒，相关性系数r2＞0.95，满足临床诊断的需求。
23.2.采用真核表达全长chi3l1及几丁质酶1(chit1)用于克隆筛选确保所获得单克隆抗体与天然蛋白的高亲和力及特异性。此外，单克隆抗体生产易于控制批间差，利于满足诊断试剂的批量生产及临床诊断需求。
附图说明
24.图1为纯化的重组抗原p1的电泳图。
25.图2为纯化的重组抗原p2的电泳图。
26.图3为固相试剂为p1来源的单抗时的相关性和特异性检测数据统计图。
27.图4为固相试剂为p2来源的单抗时的相关性和特异性检测数据统计图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1一、抗原的制备1.基因合成及载体构建合成chi3l1全长序列中31-149aa对应的基因序列p1，n端添加6
×
his标签，两端分别添加酶切位点bamh1、hindiii；用bamh1、hindiii双酶切，与采用相同内切酶酶切的pet30a质粒连接并转化大肠杆菌感受态细胞。合成chi3l1全长序列中248-383aa对应的基因序列p2，c端添加6
×
his标签，两端分别添加酶切位点ecor1、xho1；用ecor1、xho1双酶切，与采用相同内切酶酶切的pet30a质粒连接并转化大肠杆菌感受态细胞。各挑5个单克隆送
测序。
30.2.诱导表达及纯化测序正确的克隆以0.5%接种于500ml lb培养基中（kan ），培养5h后，加入终浓度0.5mm iptg，25℃过夜诱导培养。
31.收集诱导后的固体菌，7500rpm，15min，pbs洗涤两次，用70ml平衡缓冲液（20mm tris，150mm nacl，40mm咪唑）复溶；放入均质机中破碎，破碎前加入50mg/l核酸酶、1.5mmpmsf蛋白抑制剂、无水乙醇溶液乳化，分多次加。
32.破碎4次，压强分别为500bar、1000bar、1000bar、1000bar，破碎后离心，12000rpm，30min取上清。
33.平衡缓冲液（20mm tris，150mm nacl，40mm咪唑）平衡ni柱，上样，平衡，分别用100mm、150 mm、250 mm、500 mm咪唑梯度洗脱，收集目标峰，sds胶检测蛋白纯度。
34.纯化蛋白20mm pbs透析3次，测浓度，分装冻存备用。
35.参见图1和图2，分别为重组抗原p1电泳图和重组抗原p2的电泳图，可见本实施例制备的抗原纯度较高，满足实验需求。
36.二、chi3l1单克隆抗体的制备1.动物免疫挑选6-8周龄身体强壮的雌性balb/c小鼠用进行免疫。首次免疫，采用弗氏完全佐剂，100μg/小鼠，腋下多点注射；加强免疫，采用弗氏不完全佐剂，50μg/小鼠，加强免疫3次；首次免疫与第二次免疫间隔3周，加强免疫间隔2周。最后一次免疫后1周眼球采血，真核表达全长chi3l1包被酶标板，间接elisa方法测定抗血清效价。融合前3天，100μg抗原/小鼠腹腔注射冲击。
37.2.细胞融合及单克隆抗体制备已提前冲击的小鼠断颈处死，75%乙醇中浸泡灭菌。超净工作台中，无菌条件下取出小鼠脾脏，用已灭菌处理的毛玻璃片挤压并轻轻研磨脾脏分离脾脏细胞，脾脏细胞计数。以骨髓瘤细胞和脾细胞1:1的比例混合，室温下300g离心5分钟，弃上清。加入1mlpeg，让peg和细胞充分均匀混合，此过程3分钟内完成。加50ml新鲜培养基，室温300g离心5分钟， hat培养基重悬，轻轻混匀。100ul/孔加入到96孔板中，放入培养箱中培养。
38.96孔板中细胞长至1/3底面积时更换ht培养基，真核表达全长chi3l1及几丁质酶1包被，间接法elisa检测，挑选全长chi3l1阳性且几丁质酶1阴性的克隆。经过3-4次亚克隆，确保形成单克隆时扩大培养，并进行腹水细胞注射，抗体纯化。
39.三、chi3l1单克隆抗体配对1.抗体标记将抗体用1ｘpbs稀释至浓度1mg/ml，每2mg抗体加入生物素（30mg/ml ，ez-link nhs-peg4-biotin，thermo）5ul并迅速混匀。混匀后，盛有混合液的离心管放在垂直搅拌器上反应30min，或4℃过夜。生物素化后的抗体用1
×
pbs透析3次，每4小换液一次。
40.2.抗体配对将p1免疫来源的克隆抗体每孔2μg/mlｘ100μl，37℃孵育1h包被；200μl 2%bsa封闭，37℃孵育1h，pbst清洗3次；每孔加入20ng/ml的真核表达全长chi3l1，设置不加抗原的阴性对照，37℃孵育1h，pbst清洗3次；加入p2免疫来源生物素标记抗体（1:200），37℃孵育
1h，pbst清洗3次；加入sa-hrp 1:2000，100μg，37℃孵育30min，pbst清洗4次；显色，450nm波长读取od值。od大于阴性对照孔的2.1倍，判定为可配对。
41.将p2免疫来源的克隆抗体每孔2μg/mlｘ100μl，37℃孵育1h包被；200μl 2%bsa封闭，37℃孵育1h，pbst清洗3次；每孔加入20ng/ml的真核表达全长chi3l1，每个配对设置不加抗原的阴性对照，37℃孵育1h，pbst清洗3次；加入p1免疫来源生物素标记抗体（1:200），37℃孵育1h，pbst清洗3次；加入sa-hrp 1:2000，100μg ，37℃孵育30min，pbst清洗4次；显色，450nm波长读取od值。od大于阴性对照孔的2.1倍，判定为可配对。
42.四、chi3l1检测试剂盒上述chi3l1单克隆抗体可以应用于磁微粒化学发光免疫诊断试剂盒，包括发光试剂和固相试剂，其制备方法如下。
43.1.发光试剂制备取约0.1mg捕获抗体，以摩尔比1:5-1：15加入吖啶酯标记，室温下避光混匀反应2h，pb避光透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至1-10μg/ml备用。
44.2.固相试剂制备取约0.1mg标记抗体，摩尔比1:5-1：15加入生物素标记，室温下混匀反应2h，pb透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至0.1-1mg/ml备用。
45.取约0.5ml磁珠，pb清洗三次后，稀释至1-10mg/ml，等体积加入生物素标记抗体，室温下混匀反应2h，用pbs-bsa清洗后三次，稀释至0.1-1mg/ml备用。
46.当捕获抗体为p1来源的单抗时，标记抗体为p2来源的单抗；当捕获抗体为p2来源的单抗时，标记抗体为p1来源的单抗。
47.实施例2一、试剂盒1的制备1.发光试剂制备：取约0.1mg p2来源的单抗，以摩尔比1:5-1：15加入吖啶酯标记，室温下避光混匀反应2h，pb避光透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至1-10μg/ml备用。
48.2.固相试剂制备：取约0.1mg p1来源的单抗，摩尔比1:5-1：15加入生物素标记，室温下混匀反应2h，pb透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至0.1-1mg/ml备用。
49.取约0.5ml磁珠，pb清洗三次后，稀释至1-10mg/ml，等体积加入生物素标记抗体，室温下混匀反应2h，用pbs-bsa清洗后三次，稀释至0.1-1mg/ml备用。
50.二、试剂盒2的制备1.发光试剂制备：取约0.1mg p1来源的单抗，以摩尔比1:5-1：15加入吖啶酯标记，室温下避光混匀反应2h，pb避光透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至1-10μg/ml备用。
51.2.固相试剂制备：取约0.1mg p2来源的单抗，摩尔比1:5-1：15加入生物素标记，室温下混匀反应2h，pb透析脱盐，透析液体积大于标记体积20倍，每4小时换液一次，至少换液3次，测浓度后用pbs-bsa稀释至0.1-1mg/ml备用。
52.取约0.5ml磁珠，pb清洗三次后，稀释至1-10mg/ml，等体积加入生物素标记抗体，室温下混匀反应2h，用pbs-bsa清洗后三次，稀释至0.1-1mg/ml备用。
53.三、样本及校准品检测梯度稀释真核表达全长chi3l1，用某国产注册试剂盒a检测重新赋值，选择5-1000ng/ml范围内5点作为定标点，并用自配发光试剂及固相试剂检测定标cl120化学发光免疫分析仪，测试条件：一步法，60μl 发光试剂、40μl 固相试剂、20μl样本，37℃孵育15min。
54.1.最低检测线：以5%牛血清做空白样本，连续测定25次，测试条件：一步法，60μl 发光试剂、40μl 固相试剂、20μl样本，37℃孵育15min。记录测试结果，分别计算平均值av、标准差sd，计算最低检测线lob = av 2sd。
55.参见表1，其为试剂盒1的检测结果，最低检测线lob为0.8552ng/ml。
56.表1参见表2，其为试剂盒2的检测结果，最低检测线lob为1.2863ng/ml。
57.表22.相关性及特异性：搜集39份阳性样本，理论值覆盖线性范围11-1000ng/ml，用某国产注册试剂盒a，参照说明书条件测试。相同的阳性样本，以及稀释浓度至200ng/ml的chi3l1全长抗原、chit1、civ、piiipnp、ha，用自配发光试剂及固相试剂进行检测，测试条件：一步法，60μl 发光试剂、40μl 固相试剂、20μl样本，37℃孵育15min。记录测试结果，计算自配试剂与进口试剂盒a测试相关性系数r2。
58.参见表3和图3，其为试剂盒1的检测结果；其中图3的横坐标为理论浓度，纵坐标为实测浓度，拟合得到相关性系数r2为0.9679。
59.表3参见表4和图4，其为试剂盒2的检测结果；其中，图4的横坐标为理论浓度，纵坐标为实测浓度，拟合得到相关性系数r2为0.9776。
60.表4最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
再多了解一些
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