用于克仑特罗富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及克仑特罗样本的富集净化处理工艺，具体涉及一种用于克仑特罗富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用。


背景技术：

2.克仑特罗(clebuterol，cl)，又名双氯胺、氨哮素、克喘素，是一种β
2-肾上腺素受体激动剂，也是儿茶酚胺的一种衍生物，化学名为α-(叔丁氨基)甲基-4-氨基3,5-二氯苯甲醇，分子式为c
12h18
cl2n2o，分子量为277.22，克仑特罗常用其盐酸盐，为白色或类白色的结晶性粉末，无臭味微苦，在水中易溶，能溶于乙醇，在丙酮或氯仿中极微溶解，在乙醚或苯中几乎不溶。
3.由于cl在动物生产中有明显的促生长和提高瘦肉率的作用，受此利益驱使国内外在养殖业中滥用问题非常严重，又因其在生产中持续过量使用且其在体内消除半衰期较长，因此极易在动物组织中造成药物蓄积。自上世纪80年代中期欧美国家发现瘦肉精的毒副作用以来，至今世界范围内已有数以千计甚至万计的人因食用残留有瘦肉精的动物源食品而中毒。人食用残留有克仑特罗的畜产品后表现为肌肉兴奋性增强，有的人中毒后表现为肌肉震颤，重症者腓肠肌痉挛；同时引起心肌收缩加强，心率加快；高血压患者食用中毒后，导致血压升高，微循环血管膨胀，压迫刺激周围的神经，引起头痛头晕；孕妇中毒后可导致癌变、胎儿致畸等严重疾病。
4.1996年第47届jecfa会议通过了关于克仑特罗最大残留限量标准的规定，即克仑特罗在马、牛肌肉和脂肪的最高残留限量(maximum residue limit，mrl)为0.2μg/kg，在肾脏、肝脏中的mrls为0.6μg/kg，在牛乳中为0.05μg/l，推荐的检测方法为气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，gc-ms)。2003年，第26届国际食品法典委员会(codex alimentarius commission，cac)决议通过了此标准，至今仍被采用。日本于2006年起实施“肯定列表制度”(positive list system)，执行新的残留限量标准。其中，对克仑特罗残留标准实施“暂定标准”，即参考cac标准，但又明确规定在猪的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪中，克仑特罗不得检出。欧盟发布的克仑特罗最大残留限量标准(ec 2377/90)，均低于cac标准，马、牛肌肉中的最高残留限量为0.1μg/kg，内脏中为0.5μg/kg。欧盟于2007年12月出台ec 16129/07条例，旨在制定更低水平的mrl，废除现行的标准，可见欧盟对克仑特罗残留要求更为严格(表1)，且越来越高。中国农业部于1999年在关于发布《动物性食品中兽药最高残留限量》的通知(农牧发[1999]17号)中规定克仑特罗在马、牛肌肉、内脏、肾脏及奶中的mrls为0.1、0.5、0.5、0.05μg/kg。但自2002年12月起，农业部第235号公告修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，同时废除农牧发[1999]17号，新的公告规定，克仑特罗在所有动物性食品中不得检出。
[0005]
目前食品中克仑特罗的主要提取方法包括有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法等。有机溶剂萃取法是目前最普遍的提取方法，但有机溶剂的萃取存在过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点，而且由于最终提取物中可能存在其他荧光物质、色素、结构类似物，从而对
检测结果产生干扰；免疫亲和层析提高了试样的净化效果，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，但样品前处理较复杂，所用设备价格昂贵，对操作人员的技术要求也比较高，不适合于大批量样本检测及大范围推广的应用。
[0006]
免疫磁珠分离技术(immunomagnetic bead-based separation，ims)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(immunomagnetic bead，imb)既可结合活性蛋白质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠(imb)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及目标物等方面取得了显著成绩。近年来imb以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中目标物的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。
[0007]
imb可有效地收集、浓缩大量样品中的少量目标物，可避免有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法提取时存在的缺点，具有高分离率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏目标物结构等优点，与常规方法相比，不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对目标物产生富集分离纯化的效果，并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别目标物上的特征基团，从而减少漏检，减少安全隐患。
[0008]
本发明利用磁珠与抗体的偶联原理对可富集克仑特罗的免疫磁珠的制备工艺及应用条件进行了优化，大大提高了对克仑特罗的富集能力和检测灵敏度，同时凭借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点，将其应用于动物尿液、动物组织及动物血清中克仑特罗的分离与富集，可以进一步提高快速检测克仑特罗的效率。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种用于克仑特罗富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，以解决克仑特罗样品净化分离操作复杂、分离效率低、存在较大安全隐患的技术问题。
[0010]
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：提供一种用于克仑特罗富集净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶联有克仑特罗单克隆抗体；所述克仑特罗单克隆抗体是用克仑特罗人工抗原免疫白鼠所得到的；所述克仑特罗人工抗原是克仑特罗半抗原与载体蛋白的偶联物。
[0011]
所述克仑特罗半抗原是按照如下方法制备得到的：
[0012]
取2-氨基-1-(4-氨基-3，5-二氯苯基)乙醇2.21g，加n,n-二甲基甲酰胺20ml溶解，加羰基二咪唑1.86g，加0.5ml三乙胺，室温搅拌2h，加琥珀酸单酰肼盐酸盐1.72g，室温搅拌4h，停止反应，加水80ml，加1mol/l盐酸调节ph值到6，加乙酸乙酯100ml*3,萃取三次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，1,2-二氯乙烷/甲醇(v/v,10/1)洗脱分离，得到羧基-类克伦特罗半抗原产物2.76g，收率72.8％。
[0013]
本发明还提供了一种上述免疫磁珠的制备方法，是以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂edc-nhs组合处理后，活化磁珠可与克仑特罗单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化克仑特罗的免疫磁珠；
[0014]
上述免疫磁珠的制备方法具体描述如下：
[0015]
(1)清洗：取100μl羧基磁珠于离心管中，用100μl含0.05％吐温-20的ph5.0、25mmol/l的mes溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
[0016]
(2)活化：用4℃贮存的ph5.0、25mmol/l mes溶液分别配制50mmol/l的edc、nhs溶液；分别加入50μl新配制的edc和nhs溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)mes溶液洗涤2-3次；
[0017]
(3)偶联：将克仑特罗单克隆抗体溶解到60μl ph5.0、25mmol/l mes溶液中，用所述mes溶液调节总体积至100μl，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
[0018]
(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μl ph7.4的tris溶液反应15min封闭磁珠；
[0019]
(5)保存：磁分离后移除上清，用100μl含0.1％-0.3％牛血清白蛋白(bsa)、0.1％吐温-20的tris溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％bsa、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％nan3的tris溶液中，2-8℃保存备用。
[0020]
本发明同时提供了上述免疫磁珠在富集净化克仑特罗中的应用。
[0021]
实验证明，本发明用于克仑特罗富集净化的免疫磁珠对克仑特罗有很高的富集率和回收率，对克仑特罗的富集率为50ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获50ng克仑特罗)，对克仑特罗的回收率达到85％以上。本发明用于克仑特罗富集净化的免疫磁珠可以高效、准确、可靠、快速、简便地把待检样品中的克仑特罗富集起来，以便进一步应用于化学分析仪器检测(lc-ms/ms，液相色谱串联质谱法)、酶联免疫吸附法检测和胶体金测试条的快速测试，具有浓缩待测样品中克仑特罗浓度、提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品处理时间达到快速检测的优点。
附图说明
[0022]
图1克仑特罗半抗原合成路线图
具体实施方式
[0023]
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，即为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0024]
实施例1用于克仑特罗富集净化的免疫磁珠的制备
[0025]
本实施例给出了由克仑特罗单克隆抗体和含羧基的免疫磁珠偶联得到的偶联物作为富集净化克仑特罗的免疫磁珠的制备方法。该方法包括：
[0026]
一、克仑特罗单克隆抗体的制备
[0027]
1、克仑特罗半抗原的合成
[0028]
取2-氨基-1-(4-氨基-3，5-二氯苯基)乙醇2.21g，加n,n-二甲基甲酰胺20ml溶解，加羰基二咪唑1.86g，加0.5ml三乙胺，室温搅拌2h，加琥珀酸单酰肼盐酸盐1.72g，室温搅拌4h，停止反应，加水80ml，加1mol/l盐酸调节ph值到6，加乙酸乙酯100ml*3,萃取三次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，1,2-二氯乙烷/甲醇(v/v,10/1)洗脱分离，得到羧基-类克伦特罗半抗原产物2.76g，收率72.8％。
[0029]
以克伦特罗中间体2-氨基-1-(4-氨基-3，5-二氯苯基)乙醇为起始原料，与羰基二咪唑反应后，再与琥珀酸单酰肼反应，得到羧基半抗原产物。
[0030]
2、克仑特罗人工抗原的合成
[0031]
(1)免疫原的合成
[0032]
取羧基-类克伦特罗半抗原产物14.14mg，加1ml dmso溶解澄清，加三乙胺0.1ml，加氯甲酸异丁酯11微升，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取牛血清白蛋白(bsa)50mg，加0.1m cb9.1 4ml溶解，得到b液，将a液逐滴滴加到b液中，室温反应6h，停止反应，0.02m pbs透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到克伦特罗-bsa偶联物，即为免疫原。
[0033]
(2)包被原的合成
[0034]
取羧基-类克伦特罗半抗原产物15.4mg，加1ml dmf溶解澄清，加nhs 8.2mg，edc15.5mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取卵清白蛋白(ova)100mg，加0.1m cb9.1 9ml溶解，得到b液，将a液逐滴滴加到b液中，室温反应6h，停止反应，0.02m pbs透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到克伦特罗-ova偶联物，即为包被原。
[0035]
3、克仑特罗单克隆抗体的制备
[0036]
(1)杂交瘤细胞的获得
[0037]
1)首次免疫：将克仑特罗半抗原-bsa偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的balb/c小鼠，每只0.2ml；
[0038]
2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；
[0039]
3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1ml，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；
[0040]
4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。
[0041]
(2)单克隆抗体的制备
[0042]
1)细胞复苏：取出克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
[0043]
2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5
×
105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到克仑特罗单克隆抗体溶液(-20℃保存)。
[0044]
(3)单克隆抗体效价的测定
[0045]
用竞争elisa法测定抗体的效价为1:(100000～150000)。
[0046]
竞争elisa方法：用克仑特罗人工抗原包被酶标板，加入克仑特罗标准品溶液、辣根过氧化物酶标记的克仑特罗单克隆抗体，25℃反应10min，倒出孔内液体，用pbst洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应5min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。
[0047]
(4)单克隆抗体特异性的测定
[0048]
抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。
[0049]
本实验将克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗、马布特罗、特步它林、克仑丙罗、喷布特罗、氯丙那林、西马特罗、羟甲基克仑特罗、齐帕特罗、克仑巴胺等做系列稀释，分别与单克隆抗体进行竞争elisa，制作标准曲线，分析得到ic
50
，然后按下式计算交叉反应率：
[0050][0051][0052]
结果显示各类似物的交叉反应率为：克仑特罗100％、莱克多巴胺＜1％、沙丁胺醇＜1％、塞布特罗＜1％、妥布特罗＜1％、克仑潘特＜1％、溴布特罗＜1％、溴氯布特罗＜1％、马喷特罗＜1％、马布特罗＜1％、特步它林＜1％、克仑丙罗＜1％、喷布特罗＜1％、氯丙那林＜1％、西马特罗＜1％、羟甲基克仑特罗＜1％、齐帕特罗＜1％、克仑巴胺＜1％。本发明抗体对莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗、马布特罗、特步它林、克仑丙罗、喷布特罗、氯丙那林、西马特罗、羟甲基克仑特罗、齐帕特罗、克仑巴胺等其他目标物无交叉反应，只针对克仑特罗有特异性结合。
[0053]
二、免疫磁珠的制备
[0054]
该过程以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂edc-nhs组合处理后，活化磁珠可与克仑特罗单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化克仑特罗的免疫磁珠。具体步骤如下：
[0055]
(1)清洗：取100μl羧基磁珠(购于dynal，粒径为2.8μm，含量是0.15eq/g)于离心管中，用100μl含0.05％吐温-20的ph5.0、25mmol/l的mes溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
[0056]
(2)活化：用4℃贮存的ph5.0、25mmol/l mes溶液分别配制50mmol/l的edc、nhs溶液；分别加入50μl新配制的edc和nhs溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)mes溶液洗涤2-3次；
[0057]
(3)偶联：将克仑特罗单克隆抗体溶解到60μl ph5.0、25mmol/l mes溶液中，用所述mes溶液调节总体积至100μl，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
[0058]
(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μl ph7.4的tris溶液反应15min封闭磁珠；
[0059]
(5)保存：磁分离后移除上清，用100μl含0.1％-0.3％bsa、0.1％吐温-20的tris溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％bsa、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％nan3的tris溶液中(浓度为10mg/ml)，2-8℃保存备用。
[0060]
实施例2免疫磁珠的特性检测
[0061]
取按照实施例1制备的富集克仑特罗的免疫磁珠0.1ml(浓度为10mg/ml)于10ml离心管中，用5ml去离子水润洗磁珠2次，磁分离后移除上清；然后加入1ml待测样品(将克仑特罗标准品用pbs缓冲液分别配制成浓度为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml的克仑特罗溶液作为待测样品，并以pbs缓冲液作为空白待测样品)，混匀，25℃捕获20min，期间5min混匀一下磁珠；磁分离后移除上清，用5ml去离子水润洗磁珠2次，除去干扰杂质。最后加入1ml甲醇洗脱，收集洗脱液，用lc-ms/ms法按照“gb/t 22286-2008动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱
法”检测待测样品中克仑特罗的含量。结果见表1。
[0062]
表1免疫磁珠的特性检测结果
[0063][0064]
结果表明：
①
空白待测样品用洗脱液洗脱，未检出克仑特罗；
②
当标准品量在10ng～50ng之间时，用洗脱液洗脱出的克仑特罗分别为9.16ng、17.31ng、26.73ng、37.36ng、46.10ng，回收率均达到了85％以上；
③
当标准品量大于50ng时，免疫磁珠偶联上的克仑特罗趋向饱和，回收率反而下降。说明用于克仑特罗富集净化的免疫磁珠对克仑特罗的富集率为50ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获50ng克仑特罗)，对克仑特罗的回收率达到85％以上。
[0065]
实施例3免疫磁珠的使用方法
[0066]
1、样品前处理
[0067]
(1)动物尿液样本
[0068]
取50μl清亮尿样直接测定(如尿样浑浊必须通过过滤或3000g室温(20-25℃/68-77℉)离心10min直至清亮)，暂不使用的样本应冷冻保存。
[0069]
(2)动物组织(肌肉、肝脏)样本
[0070]
称取2.0g
±
0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中；
[0071]
分别加入5ml去离子水和1ml 0.1m盐酸溶液，用涡旋仪涡动5min，3000g室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；移取1ml上层清液(若上层有悬浮物应避开)，加入0.5m氢氧化钠溶液至样本液ph值在7-8.5之间，(一般肝脏加入20μl，猪肉加入50μl，牛肉、羊肉加入30μl即可，否则用氢氧化钠或盐酸调节)，再加入500μl洗涤工作液，用涡旋仪涡动30s，混匀；取50μl用于分析。
[0072]
(3)动物牛血清样本
[0073]
将离心后的牛血清用洗涤工作液按1：1的体积比稀释，用振荡器振荡混匀；在80℃(176℉)水浴5min；取50μl用于分析。
[0074]
2、免疫磁珠捕获
[0075]
取克仑特罗免疫磁珠0.2ml于10ml离心管中，用5ml去离子水润洗磁珠2次，每次用磁分离架分离洗液(每次在磁分离架上静置3min，确保磁珠全部吸附)；向润洗好的克仑特罗免疫磁珠中加入处理好的样本5ml，混匀，25℃，20min，期间5min混匀一下磁珠；用磁分离架分离免疫磁珠，用去离子水液冲润洗免疫磁珠2次，每次5ml(方法同免疫磁珠润洗)。
[0076]
3、免疫磁珠洗脱
[0077]
用1ml甲醇洗免疫磁珠，混匀，静置1min，用磁分离架分离免疫磁珠，回收甲醇液，即为富集净化后的克仑特罗样品，可应用于化学分析仪器检测(lc-ms/ms，液相色谱串联质谱法)、酶联免疫吸附法检测或胶体金测试条的快速测试。