一种测量生物样品中NAD+浓度的生物传感器及方法与流程

一种测量生物样品中nad 浓度的生物传感器及方法
技术领域
1.本发明涉及生物传感器、临床检测技术领域，具体涉及一种测量生物样品中nad 浓度的生物传感器及方法。


背景技术：

2.现有技术中，如专利号us10221439 b2中描述的，探针用于nad 检测时使用的特定受体蛋白和配体，受体蛋白为人源sepiapterin reductase(spr)的变体，其中特定的氨基酸残基为ser157,tyr170,lys174,and asp257，并且41残基位为asp，42残基位val，ile或者trp，背景技术中配体为benzenesulfonamide，如图4所示。由于使用的配体和受体蛋白结合能力不够强，导致原有探针的检测限较高，不能实现低浓度的nad 检测，传统的配体的分子结构式如下：


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是一种测量生物样品中nad 浓度的生物传感器及方法，针对原有探针灵敏度不高的问题，对受体蛋白的特定位点进行了突变，使得受体蛋白对nad 的结合能力得到了提升，新的受体蛋白17位残基为lys，41残基为asp,phe,asn,ile或gln,42残基为leu，使用了全新的配体，使配体和受体蛋白结合能力得到了提升。
4.本发明是通过以下技术方案来实现的：一种测量生物样品中nad 浓度的生物传感器，包括用于测量nad 浓度的生物传感器，该生物传感器具有一探针，探针由受体蛋白、生物发光蛋白、p30 linker、自标记蛋白组成，其中，自标记蛋白上标记了一个化合物分子，该分子包含一个荧光团和一个配体。
5.作为优选的技术方案，新的受体蛋白17位残基为lys，41残基为asp,phe,asn,ile或gln,42残基为leu。
6.作为优选的技术方案，新配体的分子式为：
7.具体判断方法如下：
8.当测量环境中nad 浓度变化时，探针内两光学基团的能量共振转移效率随之变化，最终表现为探针分子中生物发光蛋白和荧光蛋白发射光强的相对变化，利用两波长光强比来指示nad 浓度。
9.作为优选的技术方案，受体蛋白和配体的亲和力受nad 浓度调控：
10.当不存在nad 时，受体蛋白和配体的亲和力弱，因此两者不结合，导致荧光团和生
物发光蛋白的距离远，两者不发生能量共振转移，此时探针整体呈现生物发光蛋白的蓝光；
11.当nad 浓度高时，受体蛋白和配体的亲和力强，因此两者结合，导致荧光团和生物发光蛋白的距离近，两者能发生能量共振转移，此时，探针整体呈现荧光团的红光。
12.本发明的有益效果是：本发明采用更为优化的受体蛋白和一个新的配体结构，优化后的受体蛋白和配体的结合能力更强，能实现更低浓度的nad 检测，进一步实现更便捷的血液前处理和自动化血液检测流程。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为本发明的nad 生物发光探针的结构；
15.图2为本发明的测量原理图；
16.图3为本发明新配体化学结构图；
17.图4为本发明现有技术中配体化学结构；
18.图5为本发明的生物发光蛋白探针的检测原理图；
19.图6为本发明发射光谱和使用两种配体时获得的工作曲线。
具体实施方式
20.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
21.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
22.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“一端”、“另一端”、“外侧”、“上”、“内侧”、“水平”、“同轴”、“中央”、“端部”、“长度”、“外端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
23.此外，在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
24.本发明使用的例如“上”、“上方”、“下”、“下方”等表示空间相对位置的术语是出于便于说明的目的来描述如附图中所示的一个单元或特征相对于另一个单元或特征的关系。空间相对位置的术语可以旨在包括设备在使用或工作中除了图中所示方位以外的不同方位。例如，如果将图中的设备翻转，则被描述为位于其他单元或特征“下方”或“之下”的单元将位于其他单元或特征“上方”。因此，示例性术语“下方”可以囊括上方和下方这两种方位。设备可以以其他方式被定向(旋转90度或其他朝向)，并相应地解释本文使用的与空间相关的描述语
25.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“套接”、“连接”、“贯穿”、“插接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
26.如图1-图3所示，本发明的一种测量生物样品中nad 浓度的生物传感器及方法，由受体蛋白、生物发光蛋白、p30 linker、自标记蛋白组成，其中自标记蛋白上标记了一个化合物分子，该分子包含一个荧光团和一个配体。受体蛋白和配体的亲和力受nad 浓度调控，不存在nad 时，受体蛋白和配体的亲和力弱，因此两者不结合，导致荧光团和生物发光蛋白的距离远，两者不能发生能量共振转移，探针整体呈现生物发光蛋白的蓝光。nad 浓度高时，受体蛋白和配体的亲和力强，因此两者结合，导致荧光团和生物发光蛋白的距离近，两者能发生能量共振转移(从生物发光蛋白转移至荧光团)，探针整体呈现荧光团的红光。因此当测量环境中nad 浓度变化时，探针内两光学基团的能量共振转移效率随之变化，最终表现为探针分子中生物发光蛋白(460nm)和荧光蛋白(575nm左右)发射光强的相对变化，利用两波长光强比指示nad 浓度。
27.当使用新配体(哌嗪衍生物)时(原配体为苯磺酰胺衍生物)，探针灵敏度显著提升，如表1所示。
[0028] c50(nm)哌嗪衍生物(新配体)130苯磺酰胺衍生物270
[0029]
表1。
[0030]
具体实施方式如下：
[0031]
实施例1：
[0032]
利用nad 生物发光探针检测生物样品中nad 浓度。
[0033]
利用重组蛋白表达技术，使用大肠杆菌表达该探针的蛋白部分。利用有机合成技术，合成探针使用的bg-荧光团-配体部分。将两部分加入hepes缓冲液中室温孵育1小时，组成功能性探针。
[0034]
将4倍体积的0.5n高氯酸加入1体积的样品中，并将混合物充分涡旋2分钟，以裂解样品并提取nad 。如测量细胞样品，每100万个细胞使用100μl酸。在12kg，4摄氏度下离心2分钟。取上清液，并在10x hepes缓冲液中稀释10倍，以中和酸化样品的ph；
[0035]
裂解和中和之后，取10μl样品加入80μl传感蛋白溶液中，用移液器轻柔上下吸放10次混匀，加入10μl 100倍稀释的生物发光蛋白底物，上下吸放10次混匀，生物发光蛋白底物添加后传感蛋白开始发光，传感蛋白信号1分钟内达到稳定，稳定后即可开始读数；每个样品将一式三份(3孔)进行测量，每个孔有5个技术读数，每分钟1个读数，持续5分钟。
[0036]
测量来自两个波长(460nm和580nm)的生物发光信号，并计算460nm和580nm发光强度的比值，将光强比值与标准nad 样品最终浓度作图，形成工作曲线，利用标准品测得的工作曲线定量未知样品中的nad 含量，如图5-图6所示。
[0037]
实施例2
[0038]
利用nad 生物发光探针配合自动化仪器完成生物样品nad 浓度的自动化检测。
[0039]
将nad 生物发光探针和底物分别装入全自动生物发光检测仪，利用标准样品形成
工作曲线，准备未分离的血液样品，将4倍体积的0.5n高氯酸加入1体积的样品中，并将混合物充分涡旋2分钟，以裂解样品并提取nad ，随后加入45倍体积的10x hepes缓冲液，将样品放入进样试管架，经行测量。
[0040]
仪器将自动吸取和混合探针、样品和底物，测量生物发光强度，利用两个波长(460nm和580nm)的生物发光信号定量样品中nad 浓度。
[0041]
本发明采用更为优化的受体蛋白和一个新的配体结构，优化后的受体蛋白和配体的结合能力更强，能实现更低浓度的nad 检测，进一步实现更便捷的血液前处理和自动化血液检测流程。
[0042]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。