一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及无血清动物细胞培养生物技术领域，尤其涉及一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法。


背景技术：

2.bhk-21(baby hamster kidney cell)即幼地鼠肾脏细胞，该细胞系源自5只未辨性别的1天龄仓鼠肾。原始的细胞株为贴壁的成纤维细胞，经无数次传代驯化后可悬浮生长并用于病毒性疫苗的生产。常见的口蹄疫疫苗和狂犬疫苗，同时日本乙型脑炎病毒、寨卡病毒以及特定的流感病毒株也可在该细胞中增殖。因此该细胞在兽用疫苗中占据主要位置，市场份额巨大，前景广阔。
3.mdck(madin-darby canine kidney cell)即犬肾脏上皮细胞，该细胞系是由s
·h·
madin和n
·b·
darby在1958年9月从一只外观正常的成年雌性英国小猎犬的肾分离得到的。该细胞系被视为最适用于甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一，可被用于代替鸡胚培养流感病毒。
4.pk-15(porcine kidney-15)细胞为猪肾上皮细胞，父母代源于1955年美国stice提供的成年猪肾细胞pk-2a。目前，pk-15细胞最大的应用即用于猪圆环病毒2型培养，灭活后制备疫苗pk15细胞对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒等多种病毒比较敏感，已广泛应用于兽用疫苗的研究和生产。
5.传统细胞培养基中往往需要添加血清，血清作为细胞生长和维持的重要物质，在细胞培养过程中发挥重要作用的同时，也带来许多问题和弊端，例如血清的成分复杂，不能完全去除；血清批次间差异大，保质期短，不利于大规模连续生产；血清还可能携带动物源性的其他微生物，如病毒、支原体、衣原体等，影响生产的安全性；血清中还含有大量动物蛋白，影响下游的分离和纯化，增加人力和成本。
6.近些年来，人们越来越关注大规模无血清贴壁或无血清全悬浮培养细胞的技术。有关同时支持多种疫苗细胞在无血清培养基中同时支持贴壁或全悬浮培养的报道较少。目前，国内几乎没有商品化的可以同时适用于不同物种来源的疫苗细胞大规模无血清贴壁或者全悬浮培养的无血清培养基。大多数疫苗培养基趋于定制和个性化的开发，缺乏通用性和稳定性。并且，在定制的个性化开发中，往往会在无血清培养基中加入转铁蛋白等比较昂贵的动物源性蛋白等成分，不利于兽用生物制品的开发和大规模生产。因此，有必要开发通用性强、组分明确、成本更低、适用于大规模生产兽用生物制品的通用型无血清培养基。同时，无血清贴壁培养基可以大大节约细胞由含血清培养基向无血清培养基驯化的时间和过程，大大简化无血清悬浮驯化，为建立更加先进的疫苗细胞无血清高密度悬浮培养工艺做了良好的铺垫。
7.综合以上，针对疫苗细胞开发出一款通用且有效的无血清培养基是未来培养基开发的一种新思路和新趋势。


技术实现要素：

8.本发明的提供一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法。
9.本发明的方案是：
10.本发明的目的同时针对多种疫苗细胞共同的生长特性和营养需求，开发出一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法。在该培养基中，bhk21悬浮细胞和贴壁的mdck细胞、pk-15细胞均可以正常生长和传代。
11.为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
12.一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基，其特征在于，包括下列原料组成，氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、水解物与添加物组，其中，所述的疫苗细胞全悬浮培养的通用型培养基中，各原料物质的终浓度区间为：
13.氨基酸组
[0014][0015][0016]
维生素组
[0017][0018]
无机盐与微量元素组
[0019][0020]
脂类、水解物与添加物组
[0021][0022]
本发明的另一个目的在于提供一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基的制备方法，该方法简单快捷效率高，有利于大规模生产。
[0023]
本发明还公开了一种制备支持多种疫苗细胞悬浮培养的通用型无血清培养基的方法，包括下列步骤：
[0024]
1)按配比称量培养基中各组成分；称取的氨基酸组加入水中进行溶解，其中l-胱氨酸二钠盐一水单独制成水溶液后加入混合溶液中；
[0025]
2)溶解后加入无机盐与微量元素组各成分的溶液，所述无机盐与微量元素组中的碳酸氢钠溶液该步骤中不进行添加；
[0026]
3)溶解混合溶液降至室温后，加入所述维生素组的水溶性维生素溶液；
[0027]
4)溶解后加入所述维生素组的碱溶性维生素溶液；
[0028]
5)溶解后加入所述脂类、水解物与添加物组溶液与无机盐与微量元素组中的碳酸氢钠溶液，溶解完成后分别进行测定ph、ntu、osm，进行数值调节；
[0029]
6)将调节好的溶剂定容并用0.22μm的滤膜正压过滤除菌；
[0030]
7)根据不同类型的细胞额外添加不同终浓度的谷氨酰胺成分。
[0031]
作为优选的技术方案，溶解物质顺序：l-半胱氨酸盐酸盐一水合物、l-苯丙氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-胱氨酸二钠盐一水、l-甲硫氨酸、l-精氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-酪氨酸二钠盐二水、l-亮氨酸、l-羟脯氨酸、l-色氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-天冬氨酸、l-天冬酰胺一水物、l-缬氨酸、l-异亮氨酸、l-组氨酸盐酸盐一水物、l-甘氨酸、l-胱氨酸二钠盐一水(单独水溶后加入)、还原型谷胱甘肽、硫胺盐酸盐、烟酰胺、维生素b12、d-泛酸半钙盐、4-氨基苯甲酸、吡哆素盐酸盐、吡哆醛盐酸盐、l-抗坏血酸、α硫辛酸、d-生物素、核黄素、叶酸、氯化胆碱、肌醇、硫酸锌七水、硫酸铜五水、偏钒酸钠、氯化铝六水合物、氯化钴(ii)六水合物、硝酸铁(iii)九水合物、硫酸亚铁、氯化钙，硫酸镁、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、碳酸
氢钠、亚油酸、乙醇胺盐酸盐、组胺二盐酸盐、丙酮酸钠、hepes、p188、葡萄糖；
[0032]
硫酸亚铁和碳酸氢钠及起泡类物质如p188、大豆水解物等统一最后加入。
[0033]
其中，其他添加物中选用柠檬酸铁铵，用以替代转铁蛋白发挥其原有作用，不影响细胞生长与铁代谢，且能减少无血清培养基中的动物蛋白成分，降低培养基成本和对生产的不确定性和不安全性；柠檬酸铁铵依靠二价金属离子通道dmt1吸收铁，转铁蛋白通过转铁蛋白受体吸收铁，前者比后者提高了细胞对铁的吸收速率；柠檬酸铁铵成分浓度过高会抑制mdck细胞生长；浓度太低，细胞对铁的吸收不足；
[0034]
其中，其它添加物中大豆水解物的浓度在500～1200mg/ml，能保证维生素、金属离子、氨基酸等其他辅因子的供给，提高细胞对氨基酸的摄取；
[0035]
作为优选的技术方案，所述碱溶性维生素溶液为维生素组中的碱溶性维生素使用0.4mol/l的氢氧化钠溶液溶解制备而成的；所述无机盐与微量元素组的成分中偏钒酸钠使用6mol/l hcl溶解；脂类、糖类与缓冲剂组的成分中亚油酸通过无水乙醇溶解。
[0036]
作为优选的技术方案，所述无机盐与微量元素组各成分溶液中的氯化钙、硫酸镁与磷酸氢二钠分别单独充分溶解后加入。
[0037]
作为优选的技术方案，上述步骤中所用的水为经过ro膜过滤的去离子超纯水；所述步骤1)中氨基酸组溶解温度50-70℃。
[0038]
作为优选的技术方案，所述步骤6)中数值调节的范围为ph调节至7.0-7.4、ntu《0.1、osm在280-350。
[0039]
需要说明的是，作为优选的技术方案，该通用型培养基溶液中不含谷氨酰胺成分，需根据不同细胞的使用不同的浓度范围的谷氨酰胺，一般除bhk21细胞使用终浓度为4mmol/l的谷氨酰胺，其他细胞使用终浓度为6mmol/l的谷氨酰胺。
[0040]
本发明的有益效果在于：
[0041]
1、本发明所述用于全悬浮培养多种疫苗细胞的通用型无血清培养基不含动物血清、成本低；支持bhk21无血清悬浮培养、支持mdck和pk-15贴壁无血清培养，其成分明确、容易配制并且使用方便；
[0042]
2、本发明所述的培养基适合bhk21悬浮细胞的生长和传代，并且培养效果不亚于市场上针对不同细胞单独的个性化开发的培养基，通用性极强。
[0043]
3、本发明所述的培养基可直接用于mdck细胞和pk-15细胞的贴壁生长和传代，极大缩短了细胞无血清驯化的时间，简化了驯化的步骤，为细胞无血清悬浮培养奠定了可靠的基础。
[0044]
4、本发明的制备方法，简单快捷效率高，有利于大规模生产。
附图说明
[0045]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0046]
图1：bhk-21悬浮细胞在该通用型无血清培养基中的状态图；
[0047]
图2：bhk-21悬浮细胞在该通用型无血清培养基中的传代情况图；
[0048]
图3：mdck单克隆细胞在该通用型无血清培养基培养7天的显微镜拍照图(左)，mdck在该通用型无血清培养基中生长显微镜图(右)；
[0049]
图4：在10％dmem中培养后冻存的pk-15复苏后在通用型无血清培养基中培养6小时后全部贴壁(左)，培养48小时后汇合度大于100％(右)；
[0050]
图5：悬浮的bhk21细胞(左)、贴壁的mdck细胞(中)和贴壁的pk-15细胞(右)在本发明:培养基中的生长状态图。
具体实施方式
[0051]
为了弥补以上不足，本发明提供了一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基及其制备方法以解决上述背景技术中的问题。
[0052]
一种支持多种疫苗细胞悬浮培养的通用型无血清培养基，其特征在于，包括下列原料组成，氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、水解物与添加物组，其中，所述的疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型培养基中，各原料物质的终浓度区间如上述发明内容所述。
[0053]
本发明还公开了一种制备支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基的方法，包括下列步骤：
[0054]
1)按配比称量培养基中各组成分；称取的氨基酸组加入水中进行溶解，其中l-胱氨酸二钠盐一水单独制成水溶液后加入混合溶液中；
[0055]
2)溶解后加入无机盐与微量元素组各成分的溶液，所述无机盐与微量元素组中的碳酸氢钠溶液该步骤中不进行添加；
[0056]
3)溶解混合溶液降至室温后，加入所述维生素组的水溶性维生素溶液；
[0057]
4)溶解后加入所述维生素组的碱溶性维生素溶液；
[0058]
5)溶解后加入所述脂类、水解物与添加物组溶液与无机盐与微量元素组中的碳酸氢钠溶液，溶解完成后分别进行测定ph、ntu、osm，进行数值调节；
[0059]
6)将调节好的溶剂定容并用0.22μm的滤膜正压过滤除菌；
[0060]
7)根据不同类型的细胞额外添加不同终浓度的谷氨酰胺成分。
[0061]
所述碱溶性维生素溶液为维生素组中的碱溶性维生素使用0.4mol/l的氢氧化钠溶液溶解制备而成的；所述无机盐与微量元素组的成分中偏钒酸钠使用6mol/l hcl溶解；脂类、糖类与缓冲剂组的成分中亚油酸通过无水乙醇溶解；其他各组的成分使用超纯水溶解。
[0062]
所述无机盐与微量元素组各成分溶液中的氯化钙、硫酸镁与磷酸氢二钠分别单独充分溶解后加入。
[0063]
上述步骤中所用的水为经过ro膜过滤的去离子超纯水；所述步骤1)中氨基酸组溶解温度50-70℃。
[0064]
所述步骤6)中数值调节的范围为ph调节至7.0-7.4、ntu《0.1、osm在280-350。
[0065]
本发明还公开了一种支持多种疫苗细胞贴壁或悬浮培养的通用型无血清培养基在疫苗细胞悬浮培养中的应用。
[0066]
所述疫苗细胞包括bhk21悬浮细胞、mdck贴壁细胞、pk-15贴壁细胞。
[0067]
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结
合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0068]
实施例1：
[0069]
本实施例是一种通用型适合多种不同来源的疫苗细胞无血清培养基；所用材料无特殊说明均购买于sigma公司；所用的bhk21细胞系为天信和的悬浮bhk21细胞，所用mdck贴壁细胞和pk-15贴壁细胞获赠于广州齐志生物有限公司。按权利要求2所述各成份区间配制本研究实施例1的通用型无血清培养基，其具体成份如下：
[0070]
氨基酸组
[0071][0072]
维生素组
[0073]
成份含量mg/l成份含量mg/lα-硫辛酸1.2烟酰胺3.5氰钴胺素1.23硫胺盐酸盐3.3生物素3.06核黄素0.33叶酸4.34对氨基苯甲酸1.5维生素c21吡哆醇4.4泛酸钙3.4氯化胆碱86肌醇98
ꢀꢀ
[0074]
无机盐与微量元素组
[0075][0076]
脂类、水解物与添加物组
[0077]
成份含量mg/l成份含量mg/l亚油酸0.09p1881800丙酮酸钠165hepes1500葡萄糖6000大豆水解物1000柠檬酸铁铵45
ꢀꢀ
[0078]
按照上述配置方法配制的液体培养基用于细胞培养的方法如下：
[0079]
将悬浮的bhk21细胞以5e5的接种密度接种到通用型无血清培养基中，注意培养bhk21细胞时需额外添加谷氨酰胺母液至4mmoml/l。培养条件为37℃，110rmp/min，8％co2，每24小时取样计数并检查细胞活力。细胞培养结果如图2所示。如图3(右)bhk21细胞在该通用型无血清培养基中的24小时的倍增超过3倍，连续5e5的密度传代也展现出良好的一致性和稳定性。
[0080]
本研究中使用的mdck细胞和pk-15细胞原始培养基均为含10％胎牛血清的高糖的dmem。其中，在测试mdck细胞在该通用型培养基中的生长实验时，需额外添加谷氨酰胺母液至6mmoml/l，采用96孔板倍比稀释单细胞测试法，在未经过任何降血清的驯化条件下，稀释的单细胞仅用7天的时间就长成如图3(左)致密的一群细胞集落，经消化传代后正常生长如图3(右)。
[0081]
其中，在测试pk-15细胞在该通用型培养基中的生长实验时，直接采用在10％dmem中冻存的pk-15细胞，取1ml冻存细胞液经通用型无血清培养基10ml清洗一遍去除原始冻存液中的培养基和血清后，重悬于该通用型无血清培养基中，该培养基中额外添加谷氨酰胺母液至6mmoml/l，仅培养6小时后新复苏的pk-15细胞全部贴壁(图4左)，继续培养48小时后汇合度大于100％(如图4右)。
[0082]
应理解，本发明中的上述通用型培养基均为多次(》3)配制，各组分范围均在说明范围内，多次配制的通用型培养基均应用于悬浮的bhk21和贴壁的mdck和pk-15细胞的生长和传代。
[0083]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变
化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。