一种白介素15及其受体的多肽复合物的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种包含白细胞介素15及其受体的二硫键改造多肽复合物。


背景技术：

2.细胞因子在人体免疫调节中起重要作用，同时也参与肿瘤的免疫调控，与肿瘤的发生、发展密切相关。在免疫疗法中，细胞因子可直接作用于肿瘤微环境中的免疫效应细胞，增强肿瘤抑制效果。通过临床研究以及动物实验，许多细胞因子已被证明具有显著的抗肿瘤活性，已有多个细胞因子获得fda批准上市。
3.白细胞介素15(il-15)是grabstein等人于1994年发现的一种约为12-14kd的细胞因子，可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞的增殖。
4.il-15属于四个小α螺旋束细胞因子家族(small fourα-helix bundle familyof cytokines)中的成员。il-15需通过与其受体结合发挥生物学活性。il-15受体由三个受体亚基组成：il-15受体α(il-15rα)、il-2受体β(il-2rβ，也称il-15rβ或cd122)和γc(也称cd132)。il-15rα内含一个sushi结构域，能与il-15结合，并且是使结合后的il-15发挥生物学功能所必需的。
5.近年来，il15及il15受体更多地用于构建融合蛋白，为了提高融合蛋白的稳定性，本技术在白介素15及其受体之间引入二硫键。


技术实现要素：

6.本发明提供一种il15/il15rα多肽复合物，所述il15和il15rα之间具有一个非天然的链间键，所述非天然链间键形成于il15的第一突变残基和il15rα的第二突变残基之间，所述il15第一突变残基为第90位的e突变为c，il15rα第二突变残基为第67位的p突变位 c。
7.在一些实施方式中，所述il15rα胞外区全长或il15rαsushi结构域。
8.在一些实施方式中，所述il15rα具有73～175个氨基酸。
9.在一些实施方式中，所述il15具有seq id no.9所示的氨基酸序列。
10.在一些实施方式中，所述il15rα具有seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12、 seq id no.13或seq id no.14所示的氨基酸序列。
11.本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。
12.本发明还涉及含有如上所述核酸或者如上所述载体的宿主细胞。
13.本发明还涉及制备所述的il15/il15rα多肽复合物的方法，包括：
14.用如上所述的载体转化宿主细胞；
15.培养所转化的宿主细胞；和
16.收集宿主细胞中表达的il15/il15rα多肽复合物。
17.本发明还涉及药物组合物，其包含如上所述il15/il15rα多肽复合物和药学上可接受的载体，赋形剂，或稳定剂。
18.本发明还涉及如上所述il15/il15rα多肽复合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用。
附图说明
19.图1为il15/il15rα与il2/15rβ/γc复合物相互作用立体结构示意图；
20.图2为本发明实施例中il15(配体)与il15rα(受体)分子间二硫键突变配对立体结构示意图；
21.图3为示例性的il15/il15rα复合物结构示意图；
22.图4为示例性的il15/il15rα复合物具体应用场景结构示意图；
23.图5为二硫键改造il15/il15rα复合物凝胶电泳检测结果；
24.图6为二硫键改造与未改造il15/il15rα复合物对靶向区结合力(@tigit)的检测结果；
25.图7为二硫键改造与未改造il15/il15rα复合物对靶向区结合力(@pd-l1)的检测结果。
具体实施方式
26.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。在本发明中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请，都通过引用的方式全文并入本文。
27.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
28.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
29.实施例1、il15/il15rα复合物二硫键改造
30.在il15、il15rα之间设计二硫键改造，帮助非共价连接的il15和il15rα之间形成共价二硫键链接。突变位点如下表：
31.组合il15il15rα1e87cd96 c972e90cp67c3e93cr35c
32.示例性的选取一种il15/il15rα复合物的使用场景：靶向抗原的重链可变区(vh)可变区通过linker连接在il15rα上，再通过hinge与抗体的fc连接；靶向相同抗原的轻链可变区(vl)通过linker连接在il15上，制备一种具有靶向性的il15/il15rα复合物。
[0033][0034][0035]
上述复合物可应用于靶向同一抗原或靶点的分子，例如图4b或图4c(所述scfv靶向相同抗原或靶点)的结构，也可用于靶向2个或多个抗原或靶点分子，例如图4a或图4c(所
述scfv靶向不同抗原或靶点)，本复合物的应用场景不限于以上举例。
[0036]
实施例2、复合物样品的制备
[0037]
蛋白瞬转表达：
[0038]
将含有目的基因的质粒通过与转染试剂pei形成阳离子复合物后，导入到宿主细胞 expi293，质粒在细胞内期间，质粒上的外源基因在细胞内发生转录翻译，从而得到目的蛋白。
[0039]
expi293在37℃、8％二氧化碳、130rpm条件培养，并在转染前通过细胞计数，将2e6的细胞接种至1l摇瓶中，培养体系约为300ml。配制转染复合物准备转染：首先将750μg目标质粒加入到含有15mlopti-mem试剂的50ml离心管中，轻轻混匀，标记为a管；将1.5mg 转染试剂pei加入到含有15mlopti-mem试剂的50ml离心管中，轻轻混匀后，室温孵育5min，标记为b管；将b管pei稀释液逐滴加入到a管dna稀释液中，轻轻混匀后，室温孵育 15min，孵育结束后，将pei-目标质粒复合物加入到expi293细胞，置于37℃摇床中继续培养。直到d7-d10后收样。
[0040]
复合物样品的纯化：
[0041]
瞬转细胞表达液经过9000rpm/20min离心，收集上清，再经过0.22μm滤膜除菌过滤。纯化采用proa亲和层析。过程如下，使用akta avant 150层析设备，用至少5cv平衡缓冲液 (10mm pbs)平衡层析柱(如mabselectsure lx，ge)，加载样品至层析柱，使目标蛋白吸附在层析柱上而其他杂质穿透分离。完成上样后使用至少5cv平衡缓冲液(10mm pbs)再次冲洗层析柱，随后使用洗脱缓冲液(20mm naac，ph＝3.4)洗脱目标蛋白，收集管中预先加入中和缓冲液(1m tris，ph8.0)，中和缓冲液的加入体积根据洗脱样品的预估含量而定，一般加入10％洗脱体积量。
[0042]
实施例3、二硫键改造il15/il15rα复合物凝胶电泳检测
[0043]
对二硫键改造il15/il15rα复合物进行sds-page电泳检测，检测结果如图5所示，在分子量25kd～35kd之间有条带，说明存在游离轻链；复合物1和复合物2(二硫键改造位置 il15(e90c)/il15rα(p67c))在分子量25kd～35kd之间无条带，说明二硫键改造成功，复合物3(二硫键改造位置il15(e87c)/il15rα(d96 c97))、复合物4(二硫键改造位置 il15(e93c)/il15rα(r35c))在分子量25kd～35kd之间有条带，说明存在游离轻链,二硫键改造失败。
[0044]
实施例4、靶向部分亲和力检测
[0045]
tigit端结合活性分析
[0046]
通过fcm实验方法检测双抗分子(tigit端)与cho-tigit细胞结合活性。配置3％bsa 缓冲液：称取4.5gbsa到150ml 1xpbs中，混匀后放置冰上备用；抗体稀释：将受试抗体、阳性对照用3％bsa稀释成初始浓度为800nm，亚型对照稀释成初始浓度为20μg/ml，体积 300μl,3倍梯度稀释(100 200)共10个点；结合活性检测：细胞计数并铺板：将r0254-3细胞计数后，按100μl,2e 05/孔分到96孔v型板中；先将不同浓度抗体50μl加入到细胞中， 2-8度孵育0.5h,再加入50μl配体，2-8度孵育0.5h；350xg离心5min后，去掉上清，按200μl/ 孔3％bsa；350xg离心5min后，去掉上清，3％bsa配制荧光抗体pe goat anti-human igg fc 和pe goat anti-mouse igg fc(1:500x稀释)，按100μl/孔加入对应的96孔板中，2-8度孵育 30min；350g离心5min，去上清，3％bsa洗一遍细胞；350xg离心5min后，去掉上清，按 100
μl/孔加入1xpbs重悬细胞；按照cytoflex流式细胞仪标准操作规程上机检测，检测结果见图6与未进行二硫键改造的分子(序列除二硫键改造外与复合物1相同)相比亲和力相当，说明二硫键改造不会影响靶向区的亲和力。
[0047]
pd-l1端结合活性分析
[0048]
通过fcm实验方法检测双抗分子(pd-l1端)与cho-pd-l1细胞结合活性。配置3％bsa 缓冲液：称取4.5gbsa到150ml 1xpbs中，混匀后放置冰上备用；抗体稀释：将受试抗体、阳性对照用3％bsa稀释成初始浓度为800nm，亚型对照稀释成初始浓度为20μg/ml，体积 300μl,3倍梯度稀释(100 200)共10个点；结合活性检测：细胞计数并铺板：将r0254-3细胞计数后，按100μl,2e 05/孔分到96孔v型板中；先将不同浓度抗体50μl加入到细胞中， 2-8度孵育0.5h,再加入50μl配体，2-8度孵育0.5h；350xg离心5min后，去掉上清，按200μl/ 孔3％bsa；350xg离心5min后，去掉上清，3％bsa配制荧光抗体pe goat anti-human igg fc 和pe goat anti-mouse igg fc(1:500x稀释)，按100μl/孔加入对应的96孔板中，2-8度孵育 30min；350g离心5min，去上清，3％bsa洗一遍细胞；350xg离心5min后，去掉上清，按 100μl/孔加入1xpbs重悬细胞；按照cytoflex流式细胞仪标准操作规程上机检测。检测结果见图7与未进行二硫键改造(序列除二硫键改造外与复合物2相同)的分子相比亲和力相当，说明二硫键改造不会影响靶向区的亲和力。
[0049]
实施例5、其他il15rα分子二硫键改造
[0050]
经过验证，二硫键改造位置il15(e90c)/il15rα(p67c),可成功应用于以下不同长度的 il15rα结构，具体序列见下表：
[0051][0052][0053]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0054]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。