肝癌早期筛查的引物探针组合物、试剂盒及方法与流程

1.本发明属于肝癌检测试剂盒领域，涉及一种肝癌早期筛查的引物探针组合物、试剂盒及方法，特别是一种基于甲基化荧光定量pcr的肝癌早筛试剂盒。


背景技术：

2.肝癌是一种高度血管化的肿瘤，在肿瘤死亡中排名第2位。肝癌的死亡数逐年上升，在中国，肝癌每年死亡人数38,3000，占世界肝癌死亡人数的51％。肝癌确诊病人有50％在1年内死亡，低于6％的病人平均存活时间为5年。肝癌最常见的风险因素包括吸烟、饮酒、黄曲霉毒素、代谢综合征、乙型肝炎病毒(hbv)或者丙型肝炎病毒(hcv)的长期慢性感染等。近年来，肥胖和2型糖尿病的发病率逐年升高。2型糖尿病在中国的发病率为10％，超重和肥胖的发病率30％，而肥胖和2型糖尿病促进肝癌的发生和进展。此外，对乙肝疫苗的接种缺乏认识和乙型肝炎病毒(hbv)的常规检测，都增加了肝癌的发病率。
3.目前，血清甲胎蛋白(afp)是应用最广泛的肝癌血清生物标志物之一，在肝癌发病中起重要作用，如肝癌的筛查、临床表现诊断和评估。afp的灵敏度为62.4％，临界值为20ng/ml，对早期检测不够敏感和准确，可能出现假阴性结果。并且，afp在慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血浆中都有升高，经常导致误诊。
4.影像学技术(ct、mri或ceus)仅对直径大于1cm的结节的检测灵敏度从66％提高到82％，特异性提高到90％以上。
5.所以，迫切需要开发一种有效的检测方法可以检测早期、低级别、残留和复发肿瘤，来提高疾病的控制效率。幸运的是，肝癌的dna甲基化的生物标志物有助于提高肝癌诊断和预后的准确性。
6.在高风险的肝癌人群中，dna甲基化谱可用于肝癌的早期检测。dna甲基化是基因表达的关键表观遗传调控因子，异常dna甲基化是肿瘤发生(包括肝癌)过程中所有类型癌症最常见的表观遗传改变之一，介导肿瘤的起始、进展、侵袭、转移和耐药性。dna的甲基化状态的改变是肿瘤发生过程中最早可以被检测出的癌样改变。dna甲基化在化学上是稳定的，并且可以被实验量化，使其成为肝癌检测、诊断、预后和肿瘤复发的一种有前景的肿瘤标志物。
7.实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr)是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。荧光定量pcr技术现已被广泛用于各种临床疾病、动物疾病、食品安全及科学研究中。如对肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤疾病诊断，遗传基因检测实现对遗传病诊断。
8.甲基化特异性荧光定量pcr，用亚硫酸氢盐处理基因组dna，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化序列的引物进行pcr。通过荧光信号检测msp扩增产物，如果用针对处理后甲基化dna链的引物能得到扩增片
段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
9.利用甲基化特异性荧光定量pcr技术检测肿瘤的表观遗传学变化在肿瘤的早筛、诊断和预后监测中被广泛应用，如结直肠癌、胰腺癌等。目前虽已有将实时荧光定量pcr应用于肝癌筛查中，但其检测的准确度和灵敏度有待于进一步提高，不适于进行肝癌的预防早筛。


技术实现要素：

10.针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种肝癌早期筛查的引物探针组合物、试剂盒及方法，其特异性强、灵敏度高且较为可靠。
11.根据本发明第一个方面，一种肝癌早期筛查的引物探针组合物，包括：
12.正向引物f1，其核苷酸序列如seq id no.1所示；
13.反向引物r1，其核苷酸序列如seq id no.2所示；
14.探针p1，其核苷酸序列如seq id no.3所示；
15.正向引物f2，其核苷酸序列如seq id no.4所示；
16.反向引物r2，其核苷酸序列如seq id no.5所示；
17.探针p2，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
18.在一优选的实施例中，所述引物探针组合物还包括内参基因的正向引物f3、反向引物r3和探针p3，核苷酸序列依次如seq id no.7～9所示。
19.在一更优选的实施例中，各探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
20.进一步地，探针p1的5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有bhq-1荧光淬灭基团；探针p2的5’端标记有vic荧光报告基团，3’端标记有bhq-1荧光淬灭基团；探针p3的5’端标记有rox荧光报告基团，3’端标记有bhq-2荧光淬灭基团。
21.根据本发明的第二个方面，一种用于肝癌早期筛查的试剂盒，包括第一核酸反应液，所述第一核酸反应液包括如上所述的引物探针组合物。
22.在一优选的实施例中，所述试剂盒还包括第二核酸反应液，所述第二核酸反应液还包括taq酶、buffer和dntps。
23.在一更优选的实施例中，所述第二核酸反应液包括2
×
fastfire qpcr premix。
24.在一更优选的实施例中，所述试剂盒还包括亚硫酸盐。
25.在一优选的实施例中，所述试剂盒的判读标准为：
26.若荧光通道内的荧光曲线呈“s”形且ct≤37，则判断该通道对应的基因甲基化阳性；若该荧光通道内无典型“s”形扩增，或该荧光通道内ct》37且内参基因对应的荧光通道ct≤40，则判断该通道对应的基因甲基化阴性。
27.根据本发明的第三个方面，一种非诊断治疗目的的肝癌早期筛查的方法，包括使用如上所述的试剂盒使经甲基化出后的样本进行pcr扩增反应。
28.在一实施例中，所述样本为血液样本。
29.在一实施例中，所述样本经亚硫酸盐甲基化处理。
30.在一实施例中，pcr扩增反应的程序为：95℃反应3min后，按照95℃反应10s后60℃收集荧光32s进行45个循环。
31.本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
32.本发明的肝癌早期筛查的引物探针组合物及试剂盒，通过对靶基因cdkn2a和gstp1进行pcr扩增，实现对肝癌相关基因cdkn2a和gstp1的甲基化验证，具有较高的敏感性和特异性，灵敏度较好，进而提高了检测的准确度，以实现对肝癌的早筛、早诊及预后的复发监控。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1示出了本发明实施例试剂盒的对cdkn2a基因甲基化的灵敏度实验结果。
35.图2示出了本发明实施例试剂盒对gstp1基因甲基化的灵敏度实验结果。
36.图3示出了实施例和对比例的引物探针对cdkn2a基因甲基化的检测结果。
37.图4示出了实施例和对比例的引物探针对gstp1基因甲基化的检测结果。
具体实施方式
38.下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
39.如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。
40.cdkn2a基因编码cdkn2a蛋白，通过与细胞依赖激酶cdks结合，抑制细胞周期的g1期到s期转换。cdkn2a启动子甲基化降低cdkn2a的mrna表达和蛋白质合成，进而影响细胞周期调控，对癌细胞的抑制作用减弱。cdkn2a启动子的甲基化在肝癌的发生发展中起关键作用。gstp1即谷胱甘肽硫转移酶p1，是一类负责多种致癌物质代谢的酶类家族gsts中的一员。gstp1的高度甲基化引起gstp1基因的失活，在肝癌发生中起重要作用，增加肝癌风险。本发明通过检测患者血液中的cdkn2a和gstp1基因的甲基化状态，人actb基因为对照内参，可以实现对肝癌的早筛、早诊及预后的复发监控，真正做到无创检测，高灵敏度和特异性。
41.本文在cdkn2a和gstp1基因启动子与肝癌发生高度相关的cpg区域，针对经过重亚硫酸盐转化后的序列分别设计了特异性引物和荧光探针，可以在pcr反应中特异性的检测出甲基化序列。本试剂盒可以同时检测患者体内3种基因的甲基化，总时长约3.5小时，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间。人actb基因为对照内参，确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。既可以对无症状的肝癌患者进行早筛，也可以用作肝癌患者治疗后的预后监测手段。
42.本文基于荧光定量pcr原理，以甲基化多重pcr荧光探针法对血液样本中cdkn2a和gstp1基因甲基化的检测。从人血液样本中提取细胞基因组dna，然后用重亚硫酸盐进行转化，通过荧光pcr扩增检测转化后的3种基因dna片段：cdkn2a基因(fam荧光通道)、gstp1基因(vic荧光通道)以及内控基因actb(rox荧光通道)。其中actb(β-actin)基因用于评估检
测中样本dna含量和质量，在每一次检测中都同时检测阳性对照(人甲基化全基因dna)和阴性对照(人非甲基化全基因dna)。
43.实施例1：试剂盒
44.该试剂盒为肝癌早期筛查和预后监测试剂盒，同时检测血液细胞中2种基因甲基化的试剂盒，将2种基因与内参actb基因组成一个三重核酸反应液。该试剂盒包括核酸反应液a和核酸反应液b，核酸反应液a包括引物探针组合物，核酸反应液b为外购qpcr premix(probe)。核酸反应液a的引物和探针的具体信息参见表1。
45.表1引物探针组合物的序列
[0046][0047]
其中，探针p1的5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有bhq-1荧光淬灭基团；探针p2的5’端标记有vic荧光报告基团，3’端标记有bhq-1荧光淬灭基团；探针p3的5’端标记有rox荧光报告基团，3’端标记有bhq-2荧光淬灭基团。
[0048]
核酸反应液b包括qpcr扩增反应所选的酶和试剂，具体包括以下组分：taq酶、buffer、dntps。
[0049]
qpcr扩增反应液购买于北京天根生物科技有限公司，引物、探针和合成基因均有通用生物(系统)有限公司合成。血液样本基因组dna提取，使用核酸提取试剂盒(苏州美汇医药技术有限公司生产)。甲基化dna的亚硫酸盐转化，使用核酸纯化试剂盒(苏州美汇医药技术有限公司生产)。
[0050]
该试剂盒的使用方法如下：
[0051]
(1)(1)采集样本并提取核酸：临床收集到的样本(血液样本，如血浆，血清或者全血)，通过苏州美汇医药技术有限公司生产的核酸提取试剂盒，提取样本的细胞基因组dna。并利用亚硫酸盐进行基因组的甲基化处理，然后进行纯化。
[0052]
(2)按照表2配置反应液。
[0053]
表2反应液试剂成分
[0054]
反应试剂体积2
×
fastfire qpcr premix15cdkn2a探针p1(100μm)0.05μlcdkn2a上游引物f1(100μm)0.1μlcdkn2a下游引物r1(100μm)0.1μl
gstp1探针p2(100μm)0.05μlgstp1上游引物f2(100μm)0.1μlgstp1下游引物r2(100μm)0.1μlactb探针p3(100μm)0.05μlactb上游引物f3(100μm)0.1μlactb下游引物r3(100μm)0.1μl无核酸酶水0.25μl模板(纯化后的dna样本)14μl
[0055]
(3)按照表3的反应程序进行扩增反应。
[0056]
表3反应程序
[0057][0058]
(1)扩增反应后：根据扩增曲线判断cdkn2a和gstp1是否发生甲基化。
[0059]
结果判断：
[0060]
在fam通道内荧光曲线呈“s”型，且ct≤37，判断为cdkn2a基因甲基化阳性，无典型“s”扩增或ct》37，rox荧光通道ct≤40，判断为cdkn2a基因甲基化阴性；
[0061]
在vic通道内荧光曲线呈“s”型，且ct≤37，判断为gstp1基因甲基化阳性，无典型“s”扩增或ct》37，rox荧光通道ct≤40，判断为gstp1基因甲基化阴性。
[0062]
实施例2：灵敏度实验
[0063]
对实施例1的试剂盒的灵敏度进行了检测。其中，对cdkn2a基因和gstp1基因甲基率设置了50％、5％及1％三个梯度。检测结果参见图1和图3所示，结果表明：试剂盒具有良好的灵敏度，可以达到检测到样本中1％的肝癌基因甲基化率。
[0064]
实施例3：特异性实验
[0065]
采用实施例1的试剂盒检测23例临床样本，其中包括5例脂肪肝样本，7例肝炎样本和11例肝癌样本。利用试剂盒对每例样本分别进行检测，每个样本dna的上样体积为14μl。反应程序如上表3。
[0066]
27例临床样本信息见表4。
[0067]
表4临床样本信息
[0068][0069][0070]
根据表4计算试剂盒的敏感性和特异性如下：
[0071]
敏感性：检出肝癌数/总肝癌数
×
100％＝(9/11)
×
100％＝81.82％。
[0072]
特异性：检出非膀胱癌数/总非膀胱癌数
×
100％＝(12/12)
×
100％＝100％。
[0073]
该试剂盒和检测方法具有较好的敏感性和特异性。
[0074]
对比例
[0075]
本对比例的试剂盒基本同实施例1，区别仅在于靶基因的引物对和探针的序列不同，具体参见下表5。
[0076]
表5
[0077][0078]
设置高低两个浓度的检测样本，分别用实施例1的试剂盒对比例的试剂盒对两个
浓度的样本进行检测，检测结果对比参见图3和图4。图3和图4中，
①
表示实施例1所用的引物探针对应的荧光曲线，
②
表示对比例的引物探针对应的荧光曲线。从上述两种不同浓度样本检测的评估来看，都是第
①
组的引物探针的荧光值好于第
②
组，因此选用第
①
组的引物探针，即引物f1和r1、探针p1及引物f2和r2、探针p2。
[0079]
总结而言，本实施例的试剂盒利用三个靶基因的一管同时扩增，实现对肝癌相关基因cdkn2a和gstp1的甲基化验证，既可以提高检测的准确度，又可以同时起到预防早筛和预后监测的效果。本试剂盒提供的肝癌基因甲基化检测试剂盒从样本提取到扩增结果出来约3.5小时，可以快速、方便的为临床医生提供诊断依据。
[0080]
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。