一种抗烟草赤星病的NtAP1L蛋白及其编码基因与应用的制作方法

一种抗烟草赤星病的ntap1l蛋白及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明涉及植物抗性技术领域，具体涉及一种抗烟草赤星病的ntap1l蛋白及其编码基因与应用。


背景技术：

2.烟草是重要的经济作物，为茄科一年生草本植物，烟草赤星病(tobacco brown spot)是烟草常见的真菌性病害，尤其在烟叶生长中后期发生严重，已成为制约烟叶生长的障碍因素。病原为链格孢菌(alternaria alternnata(fries)keissler)，病菌可侵染茄科的马铃薯、番茄、茄子、辣椒、龙葵、曼陀罗等。赤星病菌在病株残体或杂草上越冬，病斑上产生的分生孢子，由风雨传播形成再侵染，叶片生长中、后期易感病。由于烟草赤星病具有潜育期短、流行速度快的特点，在环境条件适宜的条件下，短时间内即可造成大流行，给烟叶生产带来巨大损失。目前普遍使用的防治药物为多菌灵、多氧霉素、甲基托布津等化学药物，由于多年使用，病菌已产生抗性，收效甚微。
3.培育烟草抗赤星病品种可减少甚至避免赤星病化学农药的使用量，目前虽有抗赤星病品种，但并没有完全免疫品种，且烟草抗赤星病品种间的抗病性差异明显，可供生产上应用的抗赤星病的品种也较少，为此应加强抗赤星病的育种工作。


技术实现要素：

4.基于以上问题，本发明提供一种抗烟草赤星病的ntap1l蛋白及其编码基因与应用，本发明研发了新的具有烟草赤星病抗性的基因及相关蛋白，为烟草抗赤星病品种的选育和应用提供了新的途径和更多的选择。
5.为解决以上技术问题，本发明提供了一种抗烟草赤星病的ntap1l蛋白，所述ntap1l蛋白的氨基酸序列见seq id no.2。
6.为解决以上技术问题，本发明还提供了编码ntap1l蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列见seq id no.1。
7.为解决以上技术问题，本发明还提供了ntap1l蛋白在制备鉴定或选育烟草赤星病抗性的种质资源的产品中的应用。
8.为解决以上技术问题，本发明还提供了基因在制备鉴定或选育烟草赤星病抗性的种质资源的产品中的应用。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明研发了新的具有烟草赤星病抗性的基因及相关蛋白，为烟草抗赤星病品种的选育和应用提供了新的途径和更多的选择。
附图说明
10.图1为本发明的实施例的群体gats08中差异位点indel 25不同碱基类型纯合株系抗病能力分析结果(n≥20)；
11.图2为本发明的实施例的位点indel 25的位置和基因nitab4.5_0005495g0010的
结构图；
12.图3为本发明的实施例的各个品种中ntap1l的表达量结果图；
13.图4为本发明的实施例的烟草ntap1l蛋白亚细胞定位图。
具体实施方式
14.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
15.实施例：
16.本实施例以赤星病感病品种g140为母本，以赤星病抗病品种oxford 26为父本构建杂交组合得到f2代分离群体(gats07)；以赤星病感病品种g140为母本，以赤星病抗病品种净叶黄为父本构建杂交组合得到f2代分离群体(gats08)。本实施例的试验以田间自然发病并鉴定抗性的形式进行，试验采用大区种植，不设重复，试验期间不施用任何防治烟草赤星病的化学药剂。
17.通过分别对两个f2代分离群体后代株系进行赤星病抗病能力鉴定，分别取抗病株系20株与感病单株20株，植株dna提取采用ctab法进行，分别将抗性株系与感病株系dna等量混合，通过测序平台illuminahiseq 2000进行基因组混池测序。对得到的原始测序数据进行质控后与参考基因组进行比对，根据比对结果进行snp等检测和注释，定位差异性状的候选基因功能注释。
18.首先以目的位点上下游500bp左右序列为模板设计特异性引物，利用天根公司的植物基因组dna提取试剂盒提取烟草基因组dna，并以其为模板扩增目的片段。pcr产物送生物公司进行测序，利用dnaman将目的片段与参考基因组进行序列比对。根据ntbs5和ntap1l基因序列及pbwa(v)hs载体序列所含的酶切位点分别设计5'端带有酶切位点的pcr引物，将该质粒转化到大肠杆菌感受态中，用pcr技术筛选阳性克隆。
19.见表1，本实施例通过对两个f2代群体抗病株系与感病株系简化基因组混池测序，共计筛选到29个差异位点，此外，共计7个差异位点处于外显子区，剩余差异位点均在基因上游1500bp的启动子区。
20.表1外显子以及基因上游1500bp内差异位点信息
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为了研究gats08群体获得的差异位点与赤星病抗性的关系，以差异位点上下游500bp序列为模板设计特异性引物，扩增了该群体f2代抗病池单株与感病池单株各差异位点的分布情况。见表2，结果表明，在抗病池单株与感病池单株中均检测到了与抗病亲本净叶黄和感病亲本g140一致的纯合基因型株系，共检测获到11个indel 25基因型纯合株系，其中抗病亲本净叶黄基因型5个，均表现为抗病；感病亲本g140基因型均为6个，均表现为感病。此外，在抗病池单株与感病池单株中也检测获得了其余差异位点的基因型纯合株系，但其抗病表型与本基因型并无完全一致。由上述结果可知，差异位点indel 25也可能与烟草赤星病抗性密切相关，需要进一步深入研究。
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表2群体gats08中抗病与感病株系中各snp位点的赤星病抗性连锁分离分析
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通过验证部分已知赤星病抗病性种质资源中差异位点indel 25的序列，初步研究
了获得的差异位点与赤星病抗性相关性。见表3，结果表明，所有受测的对赤星病表现为感病的种质资源其碱基均未发生缺失，相反，所有indel 25发生碱基缺失的种质资源，其赤星病抗性均表现为抗病。因此，可以进一步推测indel 25与赤星病抗性有着密切的联系。
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表3部分种质资源中indel 25位点的序列分析
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由上述结果可知，与赤星病抗性密切相关的差异位点indel 25在已知抗赤星病种质资源净叶黄中均发生了突变，因此检测后代群体中indel 25碱基纯合变异株系与纯合未变异株系的赤星病抗病能力，有助于进一步确定上述差异位点与烟草赤星病抗病能力之间的关系。见附图1，结果显示，在两次不同时间调查点，位点indel 25碱基未发生缺失的(ga)株系其赤星病病情等级也显著高于碱基缺失(
‑‑
)的株系，进一步说明indel 25位点与赤星病抗性具有密切联系。
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见附图2，位点indel 25位于基因nitab4.5_0005495g0010上游区域697bp处，参考基因组碱基序列为ga。基因nitab4.5_0005495g0010序列长度为3714bp，三个编码区共计775bp，go注释为acid phosphatase 1-like，将其命名为ntap1l。测序结果表明，ntap1l基因组全长为3714bp，3个外显子区共计774bp,2个内含子区。ntap1l编码区共计编码257个氨基酸，等电点为4.61，分子量为29.32kd，ntap1l基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如下：
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通过研究侵染赤星病菌链格孢菌前后碱基未缺失的感赤星病品种和碱基缺失的抗赤星病品种中ntap1l的表达情况表明，在侵染链格孢菌前，各个品种中ntap1l的表达即存在较大差异。见附图3，g140、nc82、云烟87和k326等碱基未缺失的感赤星病品种中其表达量极低，但是在oxford 26、净叶黄、ya-2、紫江1号、中烟100、大白筋599等碱基缺失的抗赤星病品种中其表达量提高了40-80倍之多。在侵染链格孢菌之后，感赤星病品种g140、云烟87、nc82和k326中ntap1l的表达量大幅度上调，而抗赤星病品种oxford 26、净叶黄、ya-2、紫江1号、中烟100、大白筋599等中ntap1l的表达量则更进一步大量上调到达200-400倍，说明上游区域碱基缺失对ntap1l基因的表达有重要影响，且ntap1l基因参与了烟草植株抵御赤星病菌侵染的防御反应。
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见附图4，本实施例通过将绿色荧光蛋白与ntap1l连接，研究了ntap1l蛋白的亚细胞定位情况，结果表明，ntap1l定位于细胞核，推测其为最终被运输到细胞核的分泌蛋白。
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如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。