一种利用UPLC-PDA同时检测多种中药提取物中多成分的方法与流程

一种利用uplc-pda同时检测多种中药提取物中多成分的方法
技术领域
1.本发明属于中药检测技术领域，尤其涉及一种利用uplc-pda同时检测多种中药提取物中多成分的方法。


背景技术：

2.在畜牧养殖业，随着中兽药研发和生产的日益壮大，中兽药的生产过程中，中药提取物作为一种中间产物，迫切的需要进行质量控制，来最终控制最终产品的质量。2020版药典和2020版兽药典均未有收载紫锥菊提取物、金银花提取物和蒲公英提取物的标准方法。本发明意在为以后制定三种提取物的国家质量标准提供研究基础。


技术实现要素：

3.为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用uplc-pda同时检测多种中药提取物中多成分的方法，采用超高效液相色谱-二极管阵列检测法(uplc-pda)，使用光谱图、色谱图进行鉴别，使用色谱图峰面积进行含量定量检测。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.一种利用uplc-pda同时检测多种中药提取物中多成分的方法，包括以下步骤：
6.(1)制备供试品溶液：取供试品，加溶剂，超声提取、离心，过滤得到上清液即为供试品溶液，备用；
7.(2)制备对照品储备溶液：分别取各个要检测的成分作为对照品，加溶剂制成各对照品储备溶液，备用；
8.(3)uplc-pda检测：分别取上述步骤1得到的供试品溶液和步骤2得到的各对照品储备溶液，注入超高效液相色谱仪(uplc)，pda检测器进行梯度洗脱，分别得到供试品和对照品的色谱图和光谱图；
9.(4)结果判定：通过对供试品和对照品的光谱图、色谱图进行比对分析，对各成分进行定性鉴别和定量测定。
10.优选的，所述步骤1中，溶剂为甲醇水溶液或乙醇水溶液，超声提取25-35min，10000rpm/min离心5min。
11.优选的，所述步骤3中，uplc-pda检测的进样量：0.2～2μl；梯度洗脱的流速：0.40～0.44ml/min；柱温：30-40℃。
12.优选的，所述步骤3中，uplc-pda检测的流动相系统：流动相a：乙腈(含0.1％磷酸)是指乙腈中含有0.1％磷酸，是体积含量；流动相b：水(含0.1％磷酸，是体积含量)。
13.优选的，所述步骤3中，uplc-pda检测的波长扫描范围：190-400nm，检测波长324nm、327nm、330nm。
14.优选的，所述步骤3中，uplc-pda检测的梯度洗脱包括以下阶段：每个阶段之间通过曲线6梯度变化。
15.阶段一：0～8min，4％流动相a，96％流动相b；
16.阶段二：16min，10％流动相a，90％流动相b；
17.阶段三：18～20min，12％流动相a，88％流动相b；
18.阶段四：24～27min，16％流动相a，84％流动相b；
19.阶段五：30～32min，18％流动相a，82％流动相b；
20.阶段六：35～38min，55％流动相a，45％流动相b；
21.阶段七：39～40min，4％流动相a，96％流动相b。
22.优选的，所述的方法可同时检测3种中药提取物中的7种主成份。所述3种中药提取物为紫锥菊提取物、蒲公英提取物、金银花提取物。所述7种主成份为绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、4,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸和单咖啡酰酒石酸、咖啡酸。
23.优选的，所述步骤4中，使用光谱图、色谱图进行定性鉴别，使用色谱图峰面积进行含量定量检测，具体为：根据对照品和待测样品的光谱图、色谱图的比对进行定性鉴别；根据对照品和待测样品色谱图峰面积的比值来计算待测样品中各化合物的含量。
24.有益效果
25.本发明公开了一种利用uplc-pda同时检测多种中药提取物中多成分的方法，该方法快速、灵敏、准确、专属性强，通过一次样品处理，采用一套液相色谱系统可同时鉴别多种中药提取物中的多种化合物，不仅节省了试剂、时间，提高了工作效率，而且解决了药典没有方法的问题，从而更好地对提取物进行质量控制。
附图说明
26.图1：7种混合对照品溶液色谱图(进样体积1.0μl)；
27.图2：7种混合对照品溶液色谱图(进样体积0.5μl)；
28.图3：紫锥菊提取物的色谱图(进样体积1.0μl)；
29.图4：北京生泰尔公司提供的蒲公英提取物的色谱图；
30.图5：大兴安岭提取物公司提供的蒲公英提取物的色谱图；
31.图6：潍坊诺达兽药有限公司提供的金银花提取物(50％甲醇)的色谱图；
32.图7：潍坊诺达兽药有限公司提供的金银花提取物(75％乙醇)的色谱图。
33.图8：7种化合物光谱图。
具体实施方式
34.以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。
35.以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。
36.实施例
37.一种采用uplc-pda检测器同时测定3种中药提取物中的7种成分的检测方法，所述3种中药提取物为紫锥菊提取物、蒲公英提取物、金银花提取物，所述7种主成份为绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、4,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸和单咖啡酰酒石酸、咖啡酸。
38.具体包括下述步骤：
39.第一步：供试品溶液的制备：取供试品，加不同浓度的甲醇水溶液或乙醇水溶液，超声提取25-35min，10000rpm/min离心5min，上清液过滤后上机测定；
40.第二步，对照品溶液的制备：分别取绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、4,5-二-o-咖啡酰奎宁酸，菊苣酸和单咖啡酰酒石酸、咖啡酸对照品，加无水乙醇或一定浓度乙醇水溶液、甲醇制成各对照品储备溶液；再取7种储备液适量体积混合，作为混合对照品储备溶液；各对照品储备溶液和混合对照品储备溶液如下表1所示。
41.表1.各对照品储备溶液和混合对照品储备溶液
[0042][0043]
第三步：液相色谱法：进样量：0.2～2μl，流动相系统：a项：乙腈(0.1％磷酸)：b项水(0.1％磷酸)，梯度洗脱，流速：0.40～0.44ml/min。pda检测器，波长扫描范围：190-400nm，检测波长324nm、327nm、330nm，；30～40度柱温；
[0044]
第四步：结果判定：根据色谱图，供试品色谱中，在与7种对照品色谱相应的位置上，出现相同的色谱峰，而且光谱图一致，表明可检出相应的化合物成分；根据对照品和待测样品峰面积的比值来计算待测样品中各化合物的含量。梯度洗脱程序具体如下表2所示。
[0045]
表2.梯度洗脱条件
[0046]
时间(min)流动相a流动相b曲线0～84966161090618～201288624～271684630～321882635～385545639～404966
[0047]
7种对照品混合溶液的检测结果具体如下表3所示。
[0048]
表3. 7种对照品混合溶液的检测结果
[0049][0050][0051]
其中紫锥菊提取物检测结果具体如下表4所示。
[0052]
表4.紫锥菊提取物检测结果
[0053][0054][0055]
表5.蒲公英提取物的检测结果
[0056][0057]
表6.金银花提取物(50％甲醇)的检测结果
[0058][0059][0060]
表7.金银花提取物(75％乙醇)的检测结果
[0061][0062][0063]
从结果来看，紫锥菊提取物以菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的含量较高，4.5二-o-咖啡酰奎宁酸次之，咖啡酸和绿原酸极少，隐绿原酸、新绿原酸未检出；
[0064]
蒲公英提取物与紫锥菊提取物类似，但含量比紫锥菊低很多，大兴安岭提供的蒲公英提取物隐绿原酸、新绿原酸未检出；另一种生态尔提供的蒲公英提取物检出隐绿原酸，但两者中菊苣酸和单咖啡酰酒石酸，4.5二-o-咖啡酰奎宁酸均少于紫锥菊提取物；
[0065]
金银花提取物以绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、4.5二-o-咖啡酰奎宁酸的含量较高，菊苣酸和单咖啡酰酒石酸、咖啡酸的含量较低。
[0066]
本发明的有益效果是：采用一种uplc-pda检测方法同时对企业委托的3种提取物进行了多种成分的含量测定，快速而有效控制企业提取物的质量。
[0067]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。