一种迅速检测干细胞因子检测试纸的制作方法

1.本发明属于干细胞技术领域，特别涉及一种迅速检测干细胞因子检测试纸。


背景技术：

2.胎盘组织、脐带血与羊膜组织均是重要的免疫器官,能够产生100 多种细胞因子(cytokines)，也是造血系统或炎症反应活化细胞产生的重要器官。它能调节细胞分化增殖和诱导细胞发挥，具有多种生物学功能的多肽、蛋白质或糖蛋白，具有细胞活性。但是含量极低，不能做常规的检测。也没有相关的检测试纸，目前仅有免疫酶连反应(药剂盒法)cd200，vegf，plgf，egf，hgf，ngf，缺点是高价、不便、而且需要专门仪器设备、测定时间长，且需要配合仪器和试药技术使用。


技术实现要素：

3.为了解决以上技术问题，本发明提供了一种迅速检测干细胞因子检测试纸，该迅速检测干细胞因子检测试纸包括pvc底板、依次粘贴在 pvc底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸收垫，金标结合垫包被有血管内皮生长因子单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测线包被有重组血管内皮生长因子多肽抗原，硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体和重组血管内皮生长因子多肽抗原。
4.本发明提供的试纸的测定对象包括但不限于脐带血血浆、脐带血干细胞裂解液、脐带血干细胞上清液、胎盘间充质细胞裂解液、胎盘间充质细胞上清液、脐带华氏胶干细胞裂解液、脐带华氏胶干细胞上清液、脂肪干细胞裂解液、脂肪干细胞上清液、羊膜干细胞培养裂解液、羊膜干细胞培养上清液、ips细胞培养液上清液，检测的目标包括但不限于血管内皮生长因子vegf、胎盘生长因子plgf、上皮生长因子, 表皮细胞生长因子egf、人肝细胞生长因子(hgf)、神经生长因子。
5.进一步地，血管内皮生长因子单克隆抗体的浓度为1.2mg/ml，喷涂量为50μl/cm2。
6.进一步地，重组血管内皮生长因子多肽抗原的浓度为1mg/ml，喷涂量为50μl/cm2。
7.进一步地，每12mg羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体对应250 μl重组血管内皮生长因子多肽抗原，重组血管内皮生长因子多肽抗原的浓度为1mg/ml，二者总的喷涂量为50μl/cm2。
8.进一步地，迅速检测干细胞因子检测试纸的制备方法包括以下步骤：
9.s1胶体金颗粒的制备：通过柠檬酸钠还原法制备粒径为30nm的胶体金颗粒；
10.s2：喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫的制备：将1ml 步骤s1制备的胶体金颗粒加入10μl浓度为0.2m的碳酸钾缓冲液中，再加入血管内皮生长因子单克隆抗体，混匀后反应30min，再加入40 μl质量分数为10％的bsa溶液进行封闭，再次反应15min后以 16000r/min的转速离心去除上清液获得沉淀，向沉淀中加入200μl 悬浮液，即可，悬浮液按如下方法配制：向水中加入0.6gtris、0.5g 酪蛋白纳、0.6g分子量为360000的pvp、10g
蔗糖和0.2g分子量为 20000的peg后定容至200ml，即得血管内皮生长因子单克隆抗体包被液，将血管内皮生长因子单克隆抗体包被液喷涂于结合垫上，放置于 37℃干燥2h，即得喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫；
11.s3：硝酸纤维素膜的检测线包被重组血管内皮生长因子多肽抗原，硝酸纤维素膜的质控线包被羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体和重组血管内皮生长因子多肽抗原；
12.s4：试纸条的组装：pvc底板的一端粘附有样品垫，另一端粘附有吸水垫，其中部依次粘附有喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫和硝酸纤维素膜，喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫的一端与样品垫相粘附，另一端与硝酸纤维素膜相粘附，硝酸纤维素膜与吸水垫相粘附，即得检测试纸条。
13.进一步地，检测试纸的宽度为0.4cm。
14.本发明提供的一种迅速检测干细胞因子检测试纸能够用于胎盘细胞因子和干细胞因子的检测，灵敏性和特异性强，准确度高。
附图说明
15.图1.为本发明迅速检测干细胞因子检测试纸灵敏度检测结果；
16.图2.为本发明迅速检测干细胞因子检测试纸阴性判定结果；
17.图3为本发明迅速检测干细胞因子检测试纸干扰抗体测试结果。
具体实施方式
18.实施例1
19.本实施例1提供了一种迅速检测干细胞因子检测试纸，该检测试纸包括pvc底板、依次粘贴在pvc底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸收垫，金标结合垫包被有血管内皮生长因子单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测线包被有重组血管内皮生长；
20.该迅速检测干细胞因子检测试纸的制备方法包括以下步骤：
21.s1胶体金颗粒的制备：通过柠檬酸钠还原法制备粒径为30nm的胶体金颗粒，具体如下：取0.01％haucl水溶液100ml加热煮沸，加入1％柠檬酸钠水溶液1ml，继续煮沸5min，即得；
22.s2：喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫的制备：将1ml 步骤s1制备的胶体金颗粒加入10μl浓度为0.2m的碳酸钾缓冲液中，再加入血管内皮生长因子单克隆抗体，混匀后反应30min，再加入40 μl质量分数为10％的bsa溶液进行封闭，再次反应15min后以 16000r/min的转速离心去除上清液获得沉淀，向沉淀中加入200μl 悬浮液，即可，悬浮液按如下方法配制：向水中加入0.6gtris、0.5g 酪蛋白纳、0.6g分子量为360000的pvp、10g蔗糖和0.2g分子量为 20000的peg后定容至200ml，即得血管内皮生长因子单克隆抗体包被液，将血管内皮生长因子单克隆抗体包被液喷涂于结合垫上，放置于 37℃干燥2h，即得喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫；
23.s3：硝酸纤维素膜的检测线包被重组血管内皮生长因子多肽抗原，硝酸纤维素膜的质控线包被羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体和重组血管内皮生长因子多肽抗原，重组血管内皮生长因子多肽抗原的浓度为1mg/ml(用pbs配制)，喷涂量为50μl/cm2，每12mg羊
抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体对应250μl重组血管内皮生长因子多肽抗原，重组血管内皮生长因子多肽抗原的浓度为1mg/ml，二者总的喷涂量为50μl/cm2；
24.s4：试纸条的组装：pvc底板的一端粘附有样品垫，另一端粘附有吸水垫，其中部依次粘附有喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫和硝酸纤维素膜，喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫的一端与样品垫相粘附，另一端与硝酸纤维素膜相粘附，硝酸纤维素膜与吸水垫相粘附，即得检测试纸条；
25.人血管内皮生长因子单克隆抗体vegf抗体购自anti-vegfaantibody[epr21219](ab213244)；抗原与公司血管内皮生长因子多肽抗原购自安研生物科技有限公司。
[0026]
实施例2
[0027]
本实施例1提供了一种迅速检测干细胞因子检测试纸，该检测试纸包括pvc底板、依次粘贴在pvc底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸收垫，金标结合垫包被有血管内皮生长因子单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测线包被有重组血管内皮生长；
[0028]
该迅速检测干细胞因子检测试纸的制备方法包括以下步骤：
[0029]
s1胶体金颗粒的制备：通过柠檬酸钠还原法制备粒径为30nm的胶体金颗粒，具体如下：取0.01％haucl水溶液100ml加热煮沸，加入1％柠檬酸钠水溶液1ml，继续煮沸5min，即得；
[0030]
s2：喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫的制备：将1ml 步骤s1制备的胶体金颗粒加入10μl浓度为0.2m的碳酸钾缓冲液中，再加入血管内皮生长因子单克隆抗体，混匀后反应30min，再加入40 μl质量分数为10％的bsa溶液进行封闭，再次反应15min后以16000r/min的转速离心去除上清液获得沉淀，向沉淀中加入200μl 悬浮液，即可，悬浮液按如下方法配制：向水中加入0.6gtris、0.5g 酪蛋白纳、0.6g分子量为360000的pvp、10g蔗糖和0.2g分子量为 20000的peg后定容至200ml，即得血管内皮生长因子单克隆抗体包被液，将血管内皮生长因子单克隆抗体包被液喷涂于结合垫上，放置于 37℃干燥2h，即得喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫；
[0031]
s3：硝酸纤维素膜的检测线包被重组血管内皮生长因子多肽抗原，硝酸纤维素膜的质控线包被羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体和重组血管内皮生长因子多肽抗原，重组血管内皮生长因子多肽抗原的浓度为1mg/ml(用pbs配制)，喷涂量为50μl/cm2，每12mg羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体对应250μl重组血管内皮生长因子多肽抗原，重组血管内皮生长因子多肽抗原的浓度为1mg/ml，二者总的喷涂量为50μl/cm2；
[0032]
s4：试纸条的组装：pvc底板的一端粘附有样品垫，另一端粘附有吸水垫，其中部依次粘附有喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫和硝酸纤维素膜，喷涂有血管内皮生长因子单克隆抗体的结合垫的一端与样品垫相粘附，另一端与硝酸纤维素膜相粘附，硝酸纤维素膜与吸水垫相粘附，即得检测试纸条。
[0033]
试验例1测试实施例1的迅速检测干细胞因子检测试纸的灵敏性
[0034]
用胶体金免疫层析试纸条检测不同浓度的羊膜培养上清液，羊膜培养上清液干燥物的制备方法如下：(1)将羊膜组织剥离，(2)切割为边长为为0.1cm的小块，用含10％fbs的mem培养基进行细胞培养和继代，(3)收集p3-p5代细胞，(4)进行细胞计数(调节浓度为 1x107/ml)，(5)50-80度下冷冻干燥，分别制作蛋白浓度为180ng/ml、300ng/ml、450ng/ml、
600ng/ml、900ng/ml、1200ng/ml的待测液；各待测液均取20μl，每组做两个平行样，分别滴加于12个实施例1的试纸条的样品垫上，5min后肉眼判读结果，结果见图1；
[0035]
由图1可知，本发明的迅速检测干细胞因子检测试纸灵敏度可达到180ng/ml。
[0036]
试验例2实施例1的迅速检测干细胞因子检测试纸的阴性判断
[0037]
取水(图中标记为水，做5个平行样)和生理盐水(图中标记为阴性，做3个平行样)，分别将生理盐水用水稀释2倍(标记为a1，做2个平行样)、4倍(标记为a2，做2个平行样)、8倍(标记为 a3，做2个平行样)、16倍(标记为a4，做2个平行样)和32倍(标记为a5，做2个平行样)作为待测液，每个待测液均取20μl，分别滴加于18个实施例1的试纸条的样品垫上，5min后肉眼判读结果，实验结果见图2.
[0038]
图2表明，本发明提供的迅速检测干细胞因子检测试纸未出现假阳性实验结果，准确率高。
[0039]
试验例3干扰抗体与实施例1的试纸对羊膜培养上清液中胎盘生长因子的检测结果
[0040]
以羊膜培养上清液干燥物为待测物质，羊膜培养上清液干燥物的制备方法与试验例1相同，制备蛋白浓度为180ng/ml的待测液，分别使用实施例1和干扰抗体组的试纸检测羊膜培养上清液，干扰抗体组与实施例1的区别是使用羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体代替羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体和重组血管内皮生长因子多肽抗原包被于硝酸纤维素膜上的质控线上，每个待测液均取20μl，分别滴加于实施例1组和干扰抗体组的试纸条的样品垫上，5min后肉眼判读结果，结果见图3，左侧两个试纸是干扰抗体组，右侧三个是实施例1 的试纸.
[0041]
由图3可知，当使用使用羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体代替羊抗兔血管内皮生长因子单克隆抗体和重组血管内皮生长因子多肽抗原包被于硝酸纤维素膜上的质控线上时无法检测出羊膜培养上清液中的胎盘生长因子，只有使用本发明提供的试纸才能够准确检测出胎盘生长因子。
[0042]
综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。