一种测定人血清中23种精神类药物及代谢物的检测方法与流程

1.本发明属于精神类药物及代谢物检测技术领域，具体涉及一种基于lc-ms/ms技术对人血清中23种精神类药物及代谢物浓度同时定量分析的方法。


背景技术：

2.在精神科，过去60年间相继开发出来的可以使用的药物大约有200种,这些药物已经成为治疗精神障碍和精神症状有效且必不可少的药物。治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，tdm)是针对不同患者个体，量体裁衣式地制定给药方案的一种很有效的方法。使用tdm指导精神药物治疗的主要原因是患者在药代动力学方面所存在的显著个体差异。在药物剂量几乎相同的情况下，不同个体的体内稳态药物浓度可以相差20倍以上，其原因可能是患者在共患疾病、年龄、合并用药和遗传特性方面的不同导致的药物在吸收、分布、代谢、排泄方面的差异。同一药物的不同剂型，也会因吸收程度和吸收方式不同，造成体内药物浓度不同。tdm采用定量测定血浆或血清中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低中毒的风险。通过tdm还可以及时发现病人在治疗过程中是否停药、减量或超量服药，帮助病人正确认识服用药物,目前临床上已经有相当数量的精神药物可以根据其血浆浓度来调整用药剂量。
3.基于免疫的检测法是最常用的tdm方法，具有准确、快速、方便的特点。其采用待测物抗原与抗体的特异反应，通过酶与底物或荧光标记等方法产生可供检测的化学反应来进行定量测定。然而，当临床待测药物与其他具有类似结构的干扰物一起进行检测时，免疫法则具有一定的局限性。因为药物之间化学结构相似，且有着类似的抗原表区，均可发生抗原抗体反应，采用免疫法较难将其完全区分开，从而导致检测出的药物浓度与实际情况存在偏差，无法较好地预测疗效和评估不良反应。
4.近年来，液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)在tdm中被广泛使用，其特异性高、运行时间短并可以同时测定分析多种化学结构。现有方法中，比如中国专利cn111077239a公开的“一种测定人血清中阿立哌唑、氯氮平、氯丙嗪、利培酮和9-oh利培酮药物浓度的方法”和中国专利cn106918675a公开的“一种血浆中利培酮及9-羟基利培酮的检测方法”，大多数通量小，仅能针对一种或几种药物同时测定，极少涉及到几十种，影响了检测的效率。现有部分方法，比如中国专利cn109655568a公开的“高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒”和中国专利cn109668979a公开的“一种同时检测血液样品中17种抗精神病药物的方法”，采用外标法测定多种药物浓度，不仅存在基质效应，不能准确定量，还会由于检测药物种类过多，造成成本过高，形成资源浪费，不易于大批量临床检测，同时检测多种药物的过程中，灵敏度低下，存在多种目标物灵敏度相对较低的问题，影响检测的准确度，因此要结合临床需求，开发合理的方法。此外，部分方法无法同时检测药物和活性代谢物，有些药物不仅自身具有药理活性，其代谢物也具有与原药相同的药理作用，例如，氯氮平和去甲基氯氮平，阿立哌唑和脱氢阿立哌唑，文拉法辛和o-去甲基文拉法辛，氟西汀和去甲氟西汀，喹硫平和n-脱烷基喹硫平等，因此将药物的活性代谢物也纳入到监测的范围，可以更好
的解释患者血药浓度与治疗效果的相关性。
5.总的来说，现有技术中关于精神药物检测的临床检验过程中主要缺陷在于：
6.存在基质效应：部分方法仍采用外标法进行药物浓度检测，存在基质效应，不能精准定量，目前大多数lc-ms/ms的方法都采用同位素代替等内标用来校正基质效应等影响，外标法已经被逐渐淘汰。
7.检测药物种类不适用临床：检测药物种类单一或过多，检测药物种类单一，通量低，影响了检测的效率，不利于开展更多检测项目；检测药物种类过多，造成成本过高，形成资源浪费，都不易于大批量临床检测。
8.线性范围不适宜：现有技术的测量方法中多种药物的线性范围不合理，未经过临床样本的验证，不适合临床检验。
9.灵敏度低下：在同时检测多种药物的过程中，存在多种目标物灵敏度相对较低的问题，影响检测的准确度。
10.部分方法无法同时检测药物和活性代谢物：有些药物不仅自身具有药理活性，其代谢物也具有与原药相同的药理作用，因此将药物的活性代谢物也纳入到监测的范围，可以更好的解释患者血药浓度与治疗效果的相关性。


技术实现要素：

11.基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种测定人血清样本中23种精神药物及主要代谢物的检测方法，具有样本前处理简单方便、所需样本体积少、灵敏度高、准确度高及通量高的特点。
12.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
13.一种测定人血清中23种精神类药物及代谢物的检测方法，先对待测人血清样本进行样本前处理，经前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，同时准确定量分析人血清中23种精神类药物及代谢物；所述精神类药物及代谢物包括利培酮、9-羟利培酮、奥氮平、喹硫平、n-脱烷基喹硫平、阿立哌唑、脱氢阿立哌唑、氨磺必利、氯氮平、n-去甲基氯氮平、齐拉西酮、文拉法辛、o-去甲文拉法辛、左乙拉西坦、拉莫三嗪、奥卡西平、10-羟基卡马西平、氟西汀、去甲氟西汀、米氮平、艾司西酞普兰、舍曲林、度洛西汀的一种或多种；所述的液相色谱串联质谱检测中，质谱采用多反应监测，化合物mrm参数如下：：
14.[0015][0016]
采用esi离子源、正离子模式分段扫描分析。
[0017]
根据以上方案，所述的一种测定人血清中23种精神类药物及代谢物的检测方法采用内标法，使用到的稳定性同位素内标物有9种，分别是喹硫平-d8、利培酮-d4、奥氮平-d8、阿立哌唑-d8、氨磺必利-d5、齐拉西酮-d8、氟西汀-d6、西酞普兰-d4和左乙拉西坦-d6。
[0018]
根据以上方案，所述的一种测定人血清中23种精神类药物及代谢物的检测方法包括以下详细步骤：
[0019]
步骤s1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和内标工作液；
[0020]
步骤s2，向待测样本加入内标工作液，涡旋混合；
[0021]
步骤s3，取步骤s2中混合好的各样本进行离心，离心后取上清液加入稀释液进行稀释，再进行lc-ms/ms分析。
[0022]
根据以上方案，所述的步骤s2中，内标工作液为含有内标的甲醇或乙腈溶液，按2-5倍于待测样本体积的添加量进行添加；所述的步骤s3中的稀释液是0.1％甲酸水溶液，按10-30倍体积量添加。
[0023]
根据以上方案，所述的液相色谱的条件如下：
[0024]
分析柱：agilent eclipse plus c18 rrhd 1.8μm 2.1
×
50mm；
[0025]
流动相：a相：含0.1％甲酸的水溶液；b相：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
[0026]
洗脱梯度：流动相a 流动相b＝100％；0～0.8min，流动相a体积保持95％；0.8～2.0min，流动相a体积由95％递减至80％；2.0～7.0min，流动相a体积由80％递减至62％；7.0～8.0min，流动相a体积由62％递减至5％；8.0～9.0min，流动相a体积保持5％；9.0～9.01min，流动相a体积由5％升高至95％；9.01～10.0min，流动相a体积保持95％；
[0027]
流速：0.35ml/min；柱温：40℃。
[0028]
根据以上方案，所述的质谱条件如下：
[0029]
离子源温度(temperature(tem))：450℃；离子源雾化气(ion source gas1(gs1))：35psi；离子源加热辅助气(ion source gas2(gs2))：35psi；气帘气(curtain gas(cur))：20psi；喷雾毛细管电压(ionspray voltage(is))：5500v；碰撞气(collision gas(cad))：9。
[0030]
本发明的有益效果是：通过结合临床检测需求，提供一种同时测定23种常用精神类药物及其代谢物的液相色谱-串联质谱检测方法，使用稳定同位素内标(9种)，实现对多达23种精神类药物及其代谢物同时进行准确定量。针对每一个待检测物质，分别选择一对
定量离子对，以其对应保留时间作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量；并且应用低、中、高三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性；同时采用稳定性同位素内标用于校正，可有效避免基质效应。
附图说明
[0031]
图1为本发明方法测定喹硫平的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：喹硫平-d8)；
[0032]
图2为本发明方法测定n-脱烷基喹硫平的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：齐拉西酮-d8)；
[0033]
图3为本发明方法测定利培酮的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：利培酮-d4)；
[0034]
图4为本发明方法测定9-羟利培酮的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：利培酮-d4)；
[0035]
图5为本发明方法测定奥氮平的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：奥氮平-d8)；
[0036]
图6为本发明方法测定阿立哌唑的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：阿立哌唑-d8)；
[0037]
图7为本发明方法测定脱氢阿立哌唑的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：阿立哌唑-d8)；
[0038]
图8为本发明方法测定氨磺必利的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：氨磺必利-d5)；
[0039]
图9为本发明方法测定齐拉西酮的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：齐拉西酮-d8)；
[0040]
图10为本发明方法测定氟西汀的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：氟西汀-d6)；
[0041]
图11为本发明方法测定去甲氟西汀的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：氟西汀-d6)；
[0042]
图12为本发明方法测定舍曲林的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：氟西汀-d6)；
[0043]
图13为本发明方法测定度洛西汀的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：氟西汀-d6)；
[0044]
图14为本发明方法测定米氮平的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：氟西汀-d6)；
[0045]
图15为本发明方法测定文拉法辛的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：左乙拉西坦-d6)；
[0046]
图16为本发明方法测定o-去甲文拉法辛的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：左乙拉西坦-d6)；
[0047]
图17为本发明方法测定奥卡西平的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：左乙拉西坦-d6)；
[0048]
图18为本发明方法测定10-羟基卡马西平的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：左乙拉西坦-d6)；
[0049]
图19为本发明方法测定左乙拉西坦的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：左乙拉西坦-d6)；
[0050]
图20为本发明方法测定拉莫三嗪的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：左乙拉西坦-d6)；
[0051]
图21为本发明方法测定氯氮平的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：左乙拉西坦-d6)；
[0052]
图22为本发明方法测定n-去甲基氯氮平的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：左乙拉西坦-d6)；
[0053]
图23为本发明方法测定艾司西酞普兰的标准曲线图及代表性色谱图(所采用稳定同位素内标为：西酞普兰-d4)；
[0054]
图24为本发明方法测定的23种精神药物混合标准品总色谱图。
[0055]
附图均为lc-ms/ms检测分析结果图，为实施例中的结果展示，图中文字均为结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
[0056]
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行说明。
[0057]
一种测定人血清中23种精神类药物及代谢物的检测方法，先对待测人血清样本进行样本前处理，使用到的稳定性同位素内标物有9种，分别是喹硫平-d8、利培酮-d4、奥氮平-d8、阿立哌唑-d8、氨磺必利-d5、齐拉西酮-d8、氟西汀-d6、西酞普兰-d4和左乙拉西坦-d6，经前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，同时准确定量分析人血清中23种精神类药物及代谢物，所述精神类药物及代谢物包括利培酮、9-羟利培酮、奥氮平、喹硫平、n-脱烷基喹硫平、阿立哌唑、脱氢阿立哌唑、氨磺必利、氯氮平、n-去甲基氯氮平、齐拉西酮、文拉法辛、o-去甲文拉法辛、左乙拉西坦、拉莫三嗪、奥卡西平、10-羟基卡马西平、氟西汀、去甲氟西汀、米氮平、艾司西酞普兰、舍曲林、度洛西汀，包括以下详细步骤：
[0058]
步骤s1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和内标工作液；
[0059]
步骤s11稳定同位素内标储备液的配制：分别准确称量适量的喹硫平-d8(quetiapine-d8fumarate)、利培酮-d4(risperidone-d4)、奥氮平-d8(olanzapine-d8)、阿立哌唑-d8(aripiprazole-d8)、氨磺必利-d5(amisulpride-d5)、齐拉西酮-d8(ziprasidone-d8)、氟西汀-d6(fluoxetine-d6 oxalate)、西酞普兰-d4(citalopram-d4)、左乙拉西坦-d6(levetiracetam-d6)的标准品，使用有机溶剂如甲醇、二甲基亚砜(dmso)等分别配制浓度为1mg/ml的稳定同位素内标储备液。
[0060]
步骤s12稳定同位素内标中间工作液的配制：准确移取步骤s11配制的稳定同位素内标储备液，使用甲醇作为稀释液分别稀释成质量浓度为200μg/ml的内标中间工作液。
[0061]
步骤s13稳定同位素内标工作液的配制：准确移取步骤s12配制的稳定同位素内标中间工作液并混合均匀，使用乙腈作为稀释液，配制得到稳定同位素内标工作液；所述稳定同位素内标工作液中同时包括：喹硫平-d8的浓度为150ng/ml、利培酮-d4的浓度为10ng/
ml、奥氮平-d8的浓度为10ng/ml、阿立哌唑-d8的浓度为75ng/ml、氨磺必利-d5的浓度为50ng/ml、齐拉西酮-d8的浓度为50ng/ml、氟西汀-d6的浓度为150ng/ml、西酞普兰-d4的浓度为18ng/ml、左乙拉西坦-d6的浓度为100ng/ml。
[0062]
步骤s14标准品储备液溶液的配制：分别准确称量适量的拉莫三嗪、奥卡西平、10-羟基卡马西平、左乙拉西坦、喹硫平、n-脱烷基喹硫平、利培酮、9-羟利培酮、奥氮平、阿立哌唑、脱氢阿立哌唑、氯氮平、n-去甲基氯氮平、氨磺必利、齐拉西酮、氟西汀、去甲氟西汀、舍曲林、艾司西酞普兰、度洛西汀、米氮平、文拉法辛和o-去甲基文拉法辛标准品，用甲醇溶解并分别配制成标准品储备液溶液，浓度见下表：
[0063][0064]
步骤s15混合标准品中间工作液的配制：依次准确移取步骤s14配制的各个标准品储备液溶液，使用甲醇作为稀释液，配制成混合标准品中间工作液，浓度见下表；
[0065]
化合物名称浓度(μg/ml)化合物名称浓度(μg/ml)拉莫三嗪0氯氮平108.0奥卡西平0n-去甲基氯氮平108.010-羟基卡马西平0氨磺必利64.8左乙拉西坦0齐拉西酮43.2喹硫平81氟西汀108.0n-脱烷基喹硫平54去甲氟西汀80.0利培酮16.2舍曲林32.4
9-羟利培酮16.2艾司西酞普兰21.6奥氮平16.2度洛西汀27.0阿立哌唑108.0米氮平10.8脱氢阿立哌唑108.0文拉法辛81.0
ꢀꢀ
o-去甲基文拉法辛81.0
[0066]
步骤s16混合标准品工作液的配制：依次准确移取步骤s14配制的拉莫三嗪标准品储备液溶液、奥卡西平标准品储备液溶液、10-羟基卡马西平标准品储备液溶液、左乙拉西坦标准品储备液溶液和步骤s15配制的混合标准品中间工作液，使用人血清作为稀释液，分别配制成7个梯度的混合标准品工作液，浓度见下表；
[0067]
序号化合物名称c1c2c3c4c5c6c71喹硫平1837.5752253604509002n-脱烷基喹硫平1225501502403006003利培酮3.67.51545729018049-羟利培酮3.67.5154572901805奥氮平3.67.5154572901806阿立哌唑245010030048060012007脱氢阿立哌唑245010030048060012008氯氮平245010030048060012009n-去甲基氯氮平2450100300480600120010氨磺必利14.4306018028836072011齐拉西酮9.6204012019224048012氟西汀2450100300480600120013去甲氟西汀17.837.074.0222.0355.6444.0888.014舍曲林7.215309014418036015艾司西酞普兰4.81020609612024016度洛西汀612.5257512015030017文拉法辛1837.57522536045090018o-去甲文拉法辛1837.57522536045090019米氮平2.451030486012020奥卡西平1.22.55152430602110-羟基卡马西平1.22.551524306022左乙拉西坦1.22.551524306023拉莫三嗪0.30.6251.253.7567.515
[0068]
上表中，奥卡西平、10-羟基卡马西平、左乙拉西坦和拉莫三嗪的浓度单位均为μg/ml，其余均为ng/ml；
[0069]
步骤s17混合质控工作液的配制：依次准确移取步骤s14配制的拉莫三嗪标准品储备液溶液、奥卡西平标准品储备液溶液、10-羟基卡马西平标准品储备液溶液、左乙拉西坦标准品储备液溶液和步骤s15配制的混合标准品中间工作液，使用人血清作为稀释液，分别配制成低、中、高3个浓度水平的混合质控工作液，浓度见下表；
[0070]
序号化合物名称lqcmqchqc1喹硫平543604502n-脱烷基喹硫平362404803利培酮10.87214449-羟利培酮10.8721445奥氮平10.8721446阿立哌唑724809607脱氢阿立哌唑724809608氯氮平724809609n-去甲基氯氮平7248096010氨磺必利43.228857611齐拉西酮28.819238412氟西汀7248096013去甲氟西汀53.3355.6711.114舍曲林21.614428815艾司西酞普兰14.49619216度洛西汀1812024017文拉法辛5436072018o-去甲文拉法辛5436072019米氮平7.2489620奥卡西平3.624482110-羟基卡马西平3.6244822左乙拉西坦3.6244823拉莫三嗪0.9612
[0071]
上表中，奥卡西平、10-羟基卡马西平、左乙拉西坦和拉莫三嗪的浓度单位均为μg/ml，其余均为ng/ml；
[0072]
步骤s2，向待测样本按体积比1：4的加入4倍体积量的内标工作液，涡旋混合；
[0073]
步骤s3，取步骤s2中混合好的各样本进行离心，离心后取上清液按体积比1：20的加入20倍体积量的0.1％甲酸水溶液进行稀释，再进行lc-ms/ms分析。
[0074]
所述的液相色谱的条件如下：
[0075]
分析柱：agilent eclipse plus c18 rrhd 1.8μm 2.1
×
50mm；
[0076]
流动相：a相：含0.1％甲酸的水溶液；b相：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
[0077]
洗脱梯度：流动相a 流动相b＝100％；0～0.8min，流动相a体积保持95％；0.8～2.0min，流动相a体积由95％递减至80％；2.0～7.0min，流动相a体积由80％递减至62％；7.0～8.0min，流动相a体积由62％递减至5％；8.0～9.0min，流动相a体积保持5％；9.0～9.01min，流动相a体积由5％升高至95％；9.01～10.0min，流动相a体积保持95％；
[0078]
流速：0.35ml/min；柱温：40℃。
[0079]
所述的质谱条件如下：
[0080]
离子源温度(temperature(tem))：450℃；离子源雾化气(ion source gas1
(gs1))：35psi；离子源加热辅助气(ion source gas2(gs2))：35psi；气帘气(curtain gas(cur))：20psi；喷雾毛细管电压(ionspray voltage(is))：5500v；碰撞气(collision gas(cad))：9；质谱采用多反应监测，化合物mrm参数如下：
[0081]
[0082][0083]
采用esi离子源、正离子模式分段扫描分析。
[0084]
利用高效液相色谱-质谱联用仪检测上述7个梯度的混合标准品工作液，得到7个不同浓度的标准品溶液的色谱峰峰面积，分别以上述7个不同浓度的标准溶液的色谱峰峰面积与对应同位素内标的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述7个不同浓度的标准溶液的浓度作为标准曲线的横坐标x，将上述检测所得的7个不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到所有标准品对应的标准曲线方程为：y＝a*x b，结果如附图所示。
[0085]
对本发明提供的检测方法作进一步的可行性检测，过程和结果如下：
[0086]
首先，对本发明提供的方法进行进一步的批内及批间精密度分析，过程和结果如下：
[0087]
精密度描述分析物重复测定的接近程度，定义为测量值的相对标准差(变异系数cv％)应使用与证明准确度相同分析批样品的结果，获得在同一批内(批内精密度)和不同批间(批间精密度)低、中、高浓度质控样品的精密度。
[0088]
批内精密度：本发明采用空白人血清配制低、中、高浓度混合质控工作液；每个浓度检测6个重复，测定1天。
[0089]
批间精密度：本发明采用空白人血清配制低、中、高浓度混合质控工作液；每个浓度检测6个重复，连续测定3天。
[0090][0091]
[0092][0093][0094]
[0095][0096]
[0097][0098][0099]
[0100][0101][0102]
[0103][0104][0105]
[0106][0107][0108]
[0109][0110][0111]
[0112][0113][0114]
[0115][0116][0117]
[0118][0119]
[0120][0121][0122][0123]
批间精密度检测结果是：23个待测分析物的批间变异系数(cv％)均≤15％；批内精密度检测结果是：所有待测分析物的批内变异系数(cv％)均≤15％。
[0124]
残留测试：
[0125]
残留应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20％。
[0126]
本发明采用空白人血清配制校正标样uloq，通过在注射校正标样uloq后，连续注
射5针空白样品来评价；连续测定3天，检测结果显示：23个待测分析物的uloq后的空白样品中的残留均小于20％lloq；
[0127]
基质效应测试：
[0128]
本发明采用6批来自不同供体的空白人血清基质考察本方法下待测分析物在低浓度和高浓度下的基质效应。
[0129]
对于每批基质，通过计算基质存在下的峰面积(由空白人血清基质提取后加入混合标准品工作液和稳定同位素内标测得)，与不含人血清基质的相应峰面积(分析物和稳定同位素内标的纯溶液)比值，计算每一分析物和稳定同位素内标的基质因子；并进一步通过分析物的基质因子除以对应稳定同位素内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，检测结果如下表所示，23个待测分析物从6批基质计算的稳定同位素内标归一化的基质因子的变异系数均＜15％，说明本发明不存在明显的基质效应。
[0130]
本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。