喹啉芳香乙烯类衍生物在诱导环二鸟苷酸形成G-四链体中的应用的制作方法

喹啉芳香乙烯类衍生物在诱导环二鸟苷酸形成g-四链体中的应用
技术领域
1.本技术属于生物技术领域，尤其涉及喹啉芳香乙烯类衍生物在诱导环二鸟苷酸形成g-四链体中的应用。


背景技术：

2.最近三十年以来，随着人类对抗生素的误用和滥用，越来越多抗生素的效果逐渐降低，与之相反的是超级细菌逐渐进入人类的视野，越来越多的细菌逐渐产生了对某种抗生素的耐药性，超级细菌的威胁再一次给人类敲起了警钟。另外，在上世纪，抗生素的研究出现了井喷式发展之后，进入21世纪，似乎进入了研究的瓶颈期，抗生素的研发速度减慢，已经明显赶不上细菌出现耐药性的速度。同时，在抗生素研发的创新性方面，也出现后劲不足的局面，很多抗生素的研究都是基于前人研究的基础上，做进一步结构修饰和改造。如今，面对超级细菌的崛起，以及新型抗生素研发的滞后，人类不得不重新面对这场战争。


技术实现要素：

3.基于此，本技术公开了喹啉芳香乙烯类衍生物在诱导环二鸟苷酸形成g-四链体中的应用，喹啉芳香乙烯衍生物可直接作用于信号分子c-di-gmp，诱导其形成g-四链体，从而影响了细菌下游基因的表达，最终对细菌相关表型造成影响，而不直接杀死细菌，具有发开成新型抗菌药物的潜力。
4.本技术第一方面公开了喹啉芳香乙烯类衍生物在诱导环二鸟苷酸形成g-四链体中的应用。
5.环二鸟苷酸(c-di-gmp)是细菌中广泛存在的第二信使，它与其效应子结合后可调控细菌的许多生理活动，如细菌生物被膜发育、致病力、运动性、胞外多糖产生及细胞分化、细胞聚集等。c-di-gmp在一价阳离子如k

和芳香族小分子存在的条件下可以形成g-四链体高级结构，更重要的是，c-di-gmp在细菌体内多以单体或二聚体和四聚体等多聚体形式结合下游靶蛋白发挥信使功能，聚集成g-四链体后，其信使功能可能被抑制。
6.另一实施例中，所述g-四链体抑制所述细菌的鞭毛基因的表达。
7.另一实施例中，所述鞭毛基因为flen、fler和flie中的一种或多种。
8.另一实施例中，所述g-四链体抑制所述细菌的细菌药物外排泵基因的表达。
9.另一实施例中，所述外排泵基因选自mexa、mexb、mexf、mext和mexr中的一种或多种。
10.另一实施例中，所述细菌为铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
11.具体的，铜绿假单胞菌是临床上常见的致病菌和耐药菌之一，它的感染常伴随着生物被膜的产生，进而造成严重的慢性感染和持续性感染。由于铜绿假单胞菌生物被膜的产生使其产生耐药性，并能够逃避宿主免疫系统的攻击，因此传统治疗方法很难将其去除。
12.另一实施例中，所述喹啉芳香乙烯类衍生物具有如下结构；
[0013][0014]
其中，r1选自五元含氮杂环、六元含氮杂环、c3～c6的烷基取代烷基或c3～c6的羟基取代烷基中的一种；r2选自选自选自中的一种。
[0015]
另一实施例中，所述喹啉芳香乙烯类衍生物具有如下所示结构；
[0016][0016]
中的一种或多种。
[0017]
本技术第二方面公开了喹啉芳香乙烯类衍生物在制备细菌鞭毛抑制剂中的应用；
所述喹啉芳香乙烯类衍生物具有如下结构；
[0018][0019]
其中，r1选自五元含氮杂环、六元含氮杂环、c3～c6的烷基取代烷基或c3～c6的羟基取代烷基中的一种；r2选自选自选自中的一种。
[0020]
本技术第三方面公开了喹啉芳香乙烯类衍生物在制备细菌的药物外排泵抑制剂中的应用；所述喹啉芳香乙烯类衍生物具有如下结构；
[0021][0022]
其中，r1选自五元含氮杂环、六元含氮杂环、c3～c6的烷基取代烷基或c3～c6的羟基取代烷基中的一种；r2选自选自
中的一种。
[0023]
本技术第四方面提供了一种细菌鞭毛抑制剂，包括喹啉芳香乙烯类衍生物和药学上可接受的辅料；
[0024]
所述喹啉芳香乙烯类衍生物具有如下结构；
[0025][0026]
其中，r1选自五元含氮杂环、六元含氮杂环、c3～c6的烷基取代烷基或c3～c6的羟基取代烷基中的一种；r2选自选自选自中的一种。
[0027]
具体的，所述细菌鞭毛抑制剂包括或喹啉芳香乙烯类衍生物及其药学上可接受的盐、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或其混合物。
[0028]
本技术第五方面提供了一种药物外排泵抑制剂，包括喹啉芳香乙烯类衍生物和药学上可接受的辅料；
[0029]
所述喹啉芳香乙烯类衍生物具有如下结构；
[0030]
[0031]
其中，r1选自五元含氮杂环、六元含氮杂环、c3～c6的烷基取代烷基或c3～c6的羟基取代烷基中的一种；r2选自选自选自中的一种。
[0032]
具体的，所述药物外排泵抑制剂包括或喹啉芳香乙烯类衍生物及其药学上可接受的盐、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或其混合物。
[0033]
具体的，所述辅料选自赋形剂等药学可接受盐、溶剂等辅料。
[0034]
本技术第六方面提供了一种抑菌组合物，包括喹啉芳香乙烯类衍生物和抗生素；
[0035]
所述喹啉芳香乙烯类衍生物具有如下结构；
[0036][0037]
其中，r1选自五元含氮杂环、六元含氮杂环、c3～c6的烷基取代烷基或c3～c6的羟基取代烷基中的一种；r2选自选自选自中的一种。
[0038]
具体的，所述抗生素选自四环素、金霉素和土霉素的一种或多种。
[0039]
本技术公开了喹啉芳香乙烯类衍生物可诱导细菌体内第二信号分子c-di-gmp形成g-四链体，进而影响c-di-gmp与受体蛋白的结合，进而影响下游基因的转录水平，最终抑制铜绿假单胞菌鞭毛的合成，以及药物外排泵基因的表达。本技术公开的喹啉芳香乙烯类衍生物通过干扰细菌之间的通讯对细菌的行为进行调节，而不是直接杀死细菌。本技术的喹啉芳香乙烯类衍生物能诱导细菌信号分子c-di-gmp形成g-四链体，显著抑制细菌的运动能力，且毒副作用小，安全性高，可应用于制备细菌的鞭毛抑制剂，尤其是铜绿假单胞菌鞭毛抑制剂；也可应用于制备细菌的药物外排泵抑制剂。
[0040]
与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
[0041]
1、本技术的喹啉芳香乙烯类衍生物能通过诱导信号分子c-di-gmp形成g-四链体，抑制细菌的鞭毛基因和药物外排泵基因的表达，显著抑制细菌的运动能力。
[0042]
2、本技术的喹啉芳香乙烯类衍生物对正常动物细胞毒性较小，在制备抗生素药物的应用中安全性高。
附图说明
[0043]
为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0044]
图1为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5诱导c-di-gmp形成g-四链体的圆二色谱数据图；
[0045]
图2为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b1与c-di-gmp g-四链体的紫外滴定图；
[0046]
图3为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b2与c-di-gmp g-四链体的紫外滴定图；
[0047]
图4为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b3与c-di-gmp g-四链体的紫外滴定图；
[0048]
图5为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b4与c-di-gmp g-四链体的紫外滴定图；
[0049]
图6为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b5与c-di-gmp g-四链体的紫外滴定图；
[0050]
图7为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b4对铜绿假单胞菌鞭毛基因和药物外排泵基因的qpcr数据图；
[0051]
图8为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b4和dmso作用下铜绿假单胞菌的透射电镜图；
[0052]
图9为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5对铜绿假单胞菌泳动能力评价数据图；
[0053]
图10为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5对铜绿假单胞菌群集运动能力评价数据图；
[0054]
图11为本技术实施例提供的喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5与四环素协同作用试验结果。
具体实施方式
[0055]
本技术提供了喹啉芳香乙烯类衍生物在诱导环二鸟苷酸形成g-四链体中的应用，用于解决现有技术中耐药株的耐药性强，影响疾病治疗等缺陷。
[0056]
下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0057]
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
[0058]
以下实施例所用的喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5均为自制，喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5的制备方法参考申请号为202010966874.8(公布号为cn112174885a)专利中的方法。
[0059]
实施例1
[0060]
本技术实施例提供了喹啉芳香乙烯类衍生物的c-di-gmp g-四链体的诱导活性测定，采用圆二色谱(cd)法对喹啉芳香乙烯类衍生物诱导c-di-gmp形成g-四链体(在300nm左右有正的吸收峰)的能力进行测定，具体操作方法如下：
[0061]
1、将c-di-gmp溶于10mm tris-hcl缓冲液(ph7.3，含50mm kcl)，加热至95℃并在95℃保持5分钟，然后缓慢冷却至室温，加入化合物并在冰箱中于4℃孵育过夜(约12小时)，得测试液。
[0062]
2、以喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5作为待测化合物，测试液中，c-di-gmp的浓度为70μm、待测化合物浓度为30μm，以不加化合物为对照。结果如图1所示，喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5在300nm左右均形成正的吸收峰，表示喹啉芳香乙烯类衍生物可以诱导c-di-gmp形成g-四链体。
[0063]
实施例2
[0064]
本技术实施例提供了使用紫外光谱法验证喹啉芳香乙烯类衍生物与c-di-gmp之间的相互作用，具体操作步骤如下：
[0065]
1、c-di-gmp母液的配置：将c-di-gmp溶于10mm tris-hcl缓冲液(ph7.3，含60mm kcl)，配置成浓度为1mm c-di-gmp母液，加热至95℃并在95℃保持5分钟，然后缓慢冷却至室温，并在冰箱中于4℃孵育过夜(约12小时)。
[0066]
2、喹啉芳香乙烯类衍生物b1溶液的配置：以喹啉芳香乙烯类衍生物b1为待测化合物，将待测化合物用dmso配置浓度为5mm，然后用10mm tris-hcl缓冲液(ph7.3，含60mm kcl)稀释至15μm。
[0067]
3、在喹啉芳香乙烯类衍生物b1溶液中依次滴入配置好的c-di-gmp溶液，喹啉芳香乙烯类衍生物b1的浓度是15μm，c-di-gmp的浓度为0～50μm，测量其最大紫外吸收波长，直到饱和，采用紫外光谱法测定溶液的吸收峰，紫外滴定图如图2～图6(图中不同颜色曲线表示不同浓度的c-di-gmp与喹啉芳香乙烯类衍生物相互作用后吸收峰，c-di-gmp浓度范围为0～50μm)。图2～6可知，喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5随着c-di-gmp浓度的不断增加，吸收峰有着明显的红移现象，这说明喹啉芳香乙烯类衍生物与c-di-gmp结合时产生了多种相互作用。
[0068]
实施例3
[0069]
本技术实施例提供了荧光定量pcr检测喹啉芳香乙烯类衍生物诱导细菌的环二鸟苷酸形成g-四链体后细菌的鞭毛和外排泵基因转录水平，具体方法包括：
[0070]
为了研究鞭毛合成相关基因(flen、fler、flie)和药物外排泵基因(mexa、mexb、mexf、mext、mexr)的表达，设计了引物(表1)，并以16srrna作为参考基因。实验组将野生型p.aeruginosa pao1菌株在128μg/ml喹啉芳香乙烯类衍生物b4浓度的lb培养基中培养，以dmso作为对照组。培养24h后，进行rna提取。rna提取是利用minibest universal rna extraction kit(takara)进行的。所提取的rna通过琼脂糖电泳分析纯度，并用nanodrop1000 spectrophotometer(thermo)测定浓度。分别取相同量的实验组和对照组的rna进行反转录。cdna合成所用的反转录试剂盒为rt first strand cdna synthesis kit(servicebio)。real-time quantitative pcr所用的试剂盒是2
×
sybr green qpcr master mix(high rox)(servicebio)。rt-pcr反应是在real-time pcr system(abi)上进行的。反应参数为：预变性95℃，10min；循环(40次)95℃，15s
→
60℃，30s；熔解曲线65℃
→
95℃，每15s升温0.3℃。基因的相对转录量是通过2-δδct
方法进行计算的。实验结果如图7所示，图7表明，相比对照组，在喹啉芳香乙烯类衍生物b4作用下，野生型pao1菌株的鞭毛基因和外排泵基因都被下调。
[0071]
表1
[0072][0073]
实施例4
[0074]
本技术实施例提供了喹啉芳香乙烯类衍生物诱导细菌的环二鸟苷酸形成g-四链体后细菌的显微结构，具体方法包括：
[0075]
实验组将野生型p.aeruginosa pao1菌株在128μg/ml喹啉芳香乙烯类衍生物b4浓度的lb培养基中培养，以dmso作为对照组(dmso浓度为0.8％)。取培养24h的细菌，用2.5％戊二醛固定，滴加在400目的铜网上，用4％醋酸铀负染后用透射电镜tem观察，结果如图8所示。图8结果表明，相比对照组dmso，在喹啉芳香乙烯类衍生物b4作用下带鞭毛的铜绿假单胞菌菌体明显减少。
[0076]
实施例5
[0077]
本技术实施例提供了喹啉芳香乙烯类衍生物的最小抑制浓度(mic)实验，具体方法包括：
[0078]
采用临床和实验室标准协会(clsi)指南中描述的肉汤微量稀释法测定各受试化合物的最小抑菌浓度mic(μg/ml)值。
[0079]
(1)抗菌药物和培养基制备：以喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5为待测化合物，将待
测化合物溶于dmso配制成浓度为16mg/ml的储备液，过滤除菌备用。配好的mh肉汤培养基高压蒸汽灭菌30min，冷却后待用。
[0080]
(2)种板：菌悬液酶标仪600nm测菌浓度，mh肉汤稀释至浓度相当于0.5麦氏比浊管(含菌量0.5
×
108cfu/ml)，向96孔板中每孔加100μl菌液，待用。
[0081]
(3)96孔板中第1列与第12列不加药，为空白对照。向第2列孔中依次加入0.8μl步骤(2)中配制好的化合物b1～b5抗菌药物储备液，再分别补充100μl菌液，充分混匀后从第2列中吸取100μl混合液至对应的第3列孔，再次充分混匀后吸取100μl混合液至第4列，重复至第8列时吸取100μl混合液弃掉，即采用倍半稀释法加药使第2列至第11列每孔药物浓度分别为128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml。再以dmso作为溶剂对照组，以青霉素作为阳性对照组。
[0082]
(4)孵育：将96孔板放置37℃恒温培养箱孵育24h。
[0083]
(5)结果判断：以小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当空白对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。
[0084]
(6)微量肉汤稀释法中使用的细菌包括微量肉汤稀释法中使用的细菌包括革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌s.aureus atcc 29213、葡萄球菌s.aureus atcc baa-44、枯草芽孢杆菌b.subtilis 168。革兰氏阴性菌：铜绿假单胞菌pao1、大肠杆菌e.coli atcc 8739、大肠杆菌e.coli atcc 25922。
[0085]
表1
[0086][0087]
由上表可以看出，喹啉芳香乙烯类衍生物b1-b5对于革兰氏阳性菌具有中等抑菌活性(mic值8～64μg/ml)，对于革兰氏阴性菌抑菌活性较差。特别是铜绿假单胞菌p.aeruginosa pao1，喹啉芳香乙烯类衍生物及常用的抗生素氨苄青霉素和万古霉素在128μg/ml高浓度下均不能有效抑制细菌生长。
[0088]
实施例6
[0089]
本技术实施例提供了喹啉芳香乙烯类衍生物作用铜绿假单胞菌的游泳运动干预实验，具体方法包括：
[0090]
lb肉汤和0.3％(wt/vol)琼脂制成培养基，设对照组和4个干预组，dmso作为对照组(标记为control)，3个干预组分别含有浓度为128μg/ml、64μg/ml和32μg/ml的喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5。用无菌牙签挑选各菌株单个菌落，接种于培养基中间层，置于恒温37
℃培养箱，培养12h后，观察以接种中心蔓延的云雾状区域，结果如图9所示。图9表明，喹啉芳香乙烯类衍生物以浓度依赖的方式抑制铜绿假单胞菌游泳运动，且喹啉芳香乙烯类衍生物b2～b5的抑制能力更强。
[0091]
实施例7
[0092]
本技术实施例提供了喹啉芳香乙烯类衍生物作用铜绿假单胞菌的群集运动干预实验，具体方法包括：
[0093]
lb肉汤和0.5％(wt/vol)琼脂制成培养基，设对照组和3个干预组，dmso作为对照组(标记为control)，3个干预组分别含有浓度为128μg/ml、64μg/ml和32μg/ml的喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5。将菌液用lb肉汤培养隔夜后，用lb肉汤稀释各菌株至od600＝0.05，分别各吸1μl菌液接种于上述培养基表面中心，置于恒温37℃培养箱，培养24h后，观察以接种中心生长蔓延的区域，结果如图10所示。图10表明，喹啉芳香乙烯类衍生物以浓度依赖的方式抑制铜绿假单胞菌群集运动，128μg/ml喹啉芳香乙烯类衍生物b2～b5的抑制能力更强。
[0094]
实施例8
[0095]
本技术实施例提供了喹啉芳香乙烯类衍生物与四环素协同作用铜绿假单胞菌的mic实验，具体方法包括：
[0096]
采用的是棋盘法，喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5分别与四环素协同作用进行测试。铜绿假单胞菌pao1菌种的复苏、培养和种板过程参考mic的实验步骤。在添加喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5时，在同一块96孔板中，喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5的浓度梯度排列按照竖直方向进行倍半稀释而抗生素的浓度梯度排列则按照水平方向进行倍半稀释。在种板并加药后的96孔板放置于37℃电热恒温培养箱中培养24h，用酶标仪620nm读取各孔od值。结果如图11所示。
[0097]
由图11可知，单独的喹啉芳香乙烯类衍生物b1～b5或四环素均不能抑制铜绿假单胞菌生长，当喹啉芳香乙烯类衍生物与四环素二者联用时，可以在较低浓度下抑制铜绿假单胞菌的生长，具有很好的协同作用。
[0098]
综上所述，本技术解决了现有技术中的技术缺陷。上述的喹啉芳香乙烯类衍生物能诱导细菌信号分子c-di-gmp形成g-四链体，从而抑制细菌的鞭毛基因和药物外排泵基因的表达，显著抑制细菌的运动能力。
[0099]
以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。