片叶苔素D氨甲基衍生物靶向VPS18在肿瘤免疫治疗中的应用的制作方法

片叶苔素d氨甲基衍生物靶向vps18在肿瘤免疫治疗中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，涉及片叶苔素d氨甲基衍生物靶向vps18在肿瘤免疫治疗中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.t细胞介导的免疫反应在清除入侵的病原微生物及机体异常细胞(包括肿瘤细胞)，维持机体免疫平衡中发挥了重要作用，同时为避免攻击自身正常组织，机体正常细胞会表达共抑制性免疫检查点，如：cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4(ctla-4),t-cell immunoglobulin mucin 3(tim-3),pd-1(programmed cell death protein 1)及pd-l1(programmed death-ligand 1)等。但越来越多的研究表明，这些免疫检查点介导的抑制性信号被肿瘤细胞充分驯化，用来逃避免疫监视，促进肿瘤增殖，其中pd-1/pd-l1信号轴作为介导肿瘤免疫逃逸最为重要的抑制性信号被广泛研究。pd-1主要表达在t细胞表面，而pd-l1在肿瘤细胞中广谱表达，同时在巨噬细胞等也有表达。pd-l1与pd-1结合后，导致t细胞膜表面的t-cell receptor脱磷酸化，进而抑制t细胞的活化和增殖。多种肿瘤细胞通过上调pd-l1、抑制t细胞的活化，从而介导肿瘤的免疫逃逸。临床资料也显示，高表达的pd-l1与病人的预后成明显的负相关。
4.发明人发现，目前免疫检查点抑制剂的敏感性较差。现有的降低pd-l1表达的小分子抑制剂，在作用过程中仍然存在肿瘤免疫逃逸的问题。因此，如何降低pd-l1表达、增敏免疫检查点抑制剂、逆转肿瘤免疫逃逸，提高耐药肿瘤的治疗效果是很重要的。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术的不足，本发明提供了片叶苔素d氨甲基衍生物靶向vps18在肿瘤免疫治疗中的应用，片叶苔素d氨甲基衍生物riccardin d-n(rdn)的直接作用靶点为囊泡分选蛋白vacuole protein sorting 18(vps18)及其核心复合物c(vps18/vps11/vps16/vps33)，是肿瘤治疗的新靶点。同时rdn可下调pd-l1的表达，与免疫检查点抑制剂cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4(ctla-4)联用具有明显的协同增效作用，显著提高耐药肿瘤的治疗效果。因此，肿瘤治疗的新靶点vps18及其对免疫检查点的调控作用及机制、rdn通过靶向vps18及其增敏免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用都具有研发前景。
6.具体地，本发明是通过如下技术方案实现的：
7.在本发明的第一方面，叶苔素d氨甲基衍生物在如下任意一种或多种中的应用：
8.a1)肿瘤预后或制备肿瘤预后产品；
9.a2)下调pd-l1的表达或制备下调pd-l1的表达的产品；
10.a3)增敏免疫检查点抑制剂或制备增敏免疫检查点抑制剂的产品；
11.a4)逆转肿瘤的免疫逃逸或制备逆转肿瘤的免疫逃逸的产品；
12.a5)抑制肿瘤对免疫检查点抑制剂的耐药性或抑制肿瘤对免疫检查点抑制剂的耐药性的产品；
13.a6)逆转肿瘤耐药的活性或制备逆转肿瘤耐药的活性的产品。
14.在本发明的第二方面，一种降低pd-l1表达的小分子抑制剂，为片叶苔素d的氨甲基衍生物或其药学上可接受的盐。
15.在本发明的第三方面，一种组合物，所述组合物至少包括靶向vps18、抑制vps-c复合物组装的物质和免疫检查点抑制剂；
16.在本发明的第四方面，所述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
17.a1)肿瘤预后或制备肿瘤预后产品；
18.a2)下调pd-l1的表达或制备下调pd-l1的表达的产品；
19.a3)增敏免疫检查点抑制剂或制备增敏免疫检查点抑制剂的产品；
20.a4)逆转肿瘤的免疫逃逸或制备逆转肿瘤的免疫逃逸的产品；
21.a5)抑制肿瘤对免疫检查点抑制剂的耐药性或抑制肿瘤对免疫检查点抑制剂的耐药性的产品；
22.a6)逆转肿瘤耐药的活性或制备抑逆转肿瘤耐药的活性的产品；
23.所述产品为药物或实验试剂。
24.本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
25.(1)经体内、体外实验研究证明，叶苔素d氨甲基衍生物的直接作用靶点为囊泡分选蛋白vacuole protein sorting 18(vps18)及其核心复合物c(vps18/vps11/vps16/vps33)，已确定vps18高表达与多种恶性肿瘤的预后、耐药正相关，并且调控programmed death-ligand 1(pd-l1)的表达，是肿瘤治疗的新靶点。同时叶苔素d氨甲基衍生物可下调pd-l1的表达，与免疫检查点抑制剂cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4(ctla-4)联用具有明显的协同增效作用，显著提高耐药肿瘤的治疗效果。因此，肿瘤治疗的新靶点vps18及其对免疫检查点的调控作用及机制、rdn通过靶向vps18及其增敏免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用都具有研发前景。
26.(2)经体内外实验证实，叶苔素d氨甲基衍生物显著下调pd-l1的表达，成为阻断pd-1/pd-l1信号的新型小分子抑制剂，在逆转肿瘤免疫逃逸及增敏免疫检查点抑制剂方面具有应用前景。
27.(3)体内抗肿瘤实验表明，rdn不仅能够下调pd-l1表达，而且增加肿瘤浸润的t淋巴细胞，与免疫检查点抑制剂ctla4联用显著抑制耐药肿瘤的生长，具有很好的协同增敏作用，且毒性小。
28.(4)通过对rdn进行biotin标签修饰，利用免疫共沉淀、蛋白质谱、蛋白pulldown等技术筛选发现，rdn的靶标之一为囊泡分选蛋白vps18，结合于vps18蛋白c端ring结构域，并且抑制vps-c复合物的组装。
29.(5)vps18高表达与多种恶性肿瘤的预后正相关，并且促进多种肿瘤对化疗药物的耐药、正向调控programmed death-ligand 1(pd-l1)的表达，是肿瘤治疗、逆转耐药的新靶点。
附图说明
30.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
31.图1：rdn靶向vps18，其中图1a表示对rdn进行biotin标签修饰的实验步骤；图1b表示rdn-bio与vps18的结合试验。
32.图2：rdn下调pd-l1的表达；其中图2a表示在肺癌细胞a549中，rdn可下调pd-l1的蛋白表达；图2b表示在前列腺癌细胞pc3中，rdn可下调pd-l1的蛋白表达；图2c表示在肺癌细胞a549和前列腺癌细胞pc3中，rdn不影响pd-l1的转录水平；
33.图3：vps18在肿瘤组织高表达、促进肿瘤细胞耐药；其中图3a表示，在前列腺癌临床样本中，vps18在癌组织比临近的癌旁组织表达高；图3b表示在肺癌临床样本中，vps18在癌组织比临近的癌旁组织表达高；图3c表示在耐药细胞中，vps18高表达；图3d表示下调vps18后的蛋白表达检测；图3e表示下调vps18后，耐药细胞对多西他赛的半数致死量检测；
34.图4：vps18调控pd-l1的表达；其中图4a表示在肺癌细胞a549和前列腺癌细胞pc3中下调vps18后，检测pd-l1的蛋白表达；图4b表示在肺癌细胞a549和前列腺癌细胞pc3中下调vps18后，检测pd-l1的mrna表达。
35.图5：rdn逆转耐药；其中图5a表示不同浓度下doc和rdn对前列腺癌耐药细胞pc3/doc的生存率；图5b表示显微镜下检测，不同时间点rdn对pc3及其耐药细胞株pc3/doc的杀伤作用。
36.图6：rdn增敏免疫检查点抑制剂ctla4的抗肿瘤活性；其中图6a表示rdn及其阳性药hcq与ctla4单用或联用后，肿瘤大小图片；图6b表示rdn及其阳性药hcq与ctla4单用或联用后，各组肿瘤具体重量的统计图。
37.图7：rdn增加肿瘤浸润的t淋巴细胞的比例，与ctla4具有协同作用；其中图7a表示rdn及其阳性药hcq与ctla4单用或联用后，肿瘤浸润的cd45 cd8 细胞群比例；图7b表示流式细胞术检测体内实验rdn及其阳性药hcq对pd-l1的表达影响。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
39.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
40.在本发明的一种或多种实施例中，叶苔素d氨甲基衍生物在如下任意一种或多种中的应用：
41.a1)肿瘤预后或制备肿瘤预后产品；
42.a2)下调pd-l1的表达或制备下调pd-l1的表达的产品；
43.a3)增敏免疫检查点抑制剂或制备增敏免疫检查点抑制剂的产品；
44.a4)逆转肿瘤的免疫逃逸或制备逆转肿瘤的免疫逃逸的产品；
45.a5)抑制肿瘤对免疫检查点抑制剂的耐药性或抑制肿瘤对免疫检查点抑制剂的耐药性的产品；
46.a6)逆转肿瘤耐药的活性或制备抑逆转肿瘤耐药的活性的产品。
47.苔藓植物含有丰富的次生代谢产物，以萜类和酚类化合物为主，具有广泛的生物学活性。双联苄类化合物是苔藓植物中的一类特征性的成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗真菌等多种生物学活性。本发明研究发现双联苄类化合物riccardin d的氨甲基化衍生物rdn具有逆转多药耐药的作用，并且毒性小。同时经体内外实验证实，rdn显著下调pd-l1的表达，成为阻断pd-1/pd-l1信号的新型小分子抑制剂，在逆转肿瘤免疫逃逸及增敏免疫检查点抑制剂方面具有应用前景。
48.进一步地，所述肿瘤包括前列腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌细胞、胶质瘤、黑色素瘤和白血病等。
49.所述产品为药物或实验试剂，从而可供基础研究使用。
50.当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
51.所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
52.所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
53.优选的，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
54.优选的，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
55.进一步地，所述片叶苔素d的氨甲基衍生物是指结构式通式(ⅰ)所示的化合物，或通式(ⅰ)所示的化合物的药用盐：
[0056][0057]
其中，r1、r2、r3为二甲胺甲基、二乙氨甲基、二丙氨甲基、吡咯烷甲基、哌啶甲基、吗啉甲基、n-取代的哌嗪甲基和氢原子中的任意一种；优选的，r1和r3为二甲胺甲基，r2为氢原子。
[0058]
进一步地，根据所述的化合物或其药学上可接受的盐，其结构为以下化合物：
[0059][0060]
进一步地，所述化合物药学上可接受的盐为所述化合物与无机酸或有机酸反应得到；进一步地，所述无机酸为盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸；进一步地，所述有机酸为甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸。
[0061]
进一步地，所述免疫检查点抑制剂包括pd-1/pd-l1抑制剂，优选为抗pd-1/pd-l1抗体。
[0062]
进一步地，叶苔素d氨甲基衍生物直接靶向vps18，结合区域为vps18的c端，含ring结构域；抑制vps-c复合物的组装；所述vps-c复合物包括vps18、vps11、vps16和vps33。
[0063]
在本发明的一种或多种实施例中，一种降低pd-l1表达的小分子抑制剂，为通式(ⅰ)所示的片叶苔素d的氨甲基衍生物或其药学上可接受的盐。
[0064]
在本发明的一种或多种实施例中，所述的降低pd-l1表达的小分子抑制剂在逆转肿瘤免疫逃逸或制备逆转肿瘤免疫逃逸产品和增敏抗肿瘤免疫检查点抑制剂或制备增敏抗肿瘤免疫检查点抑制剂产品中的应用。
[0065]
在本发明的一种或多种实施例中，一种组合物，所述组合物至少包括靶向vps18、抑制vps-c复合物组装的物质和免疫检查点抑制剂；
[0066]
进一步地，所述靶向vps18、抑制vps-c复合物组装的物质为片叶苔素d的氨甲基衍生物。
[0067]
在本发明的一种或多种实施例中，权利要求9所述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
[0068]
a1)肿瘤预后或制备肿瘤预后产品；
[0069]
a2)下调pd-l1的表达或制备下调pd-l1的表达的产品；
[0070]
a3)增敏免疫检查点抑制剂或制备增敏免疫检查点抑制剂的产品；
[0071]
a4)逆转肿瘤的免疫逃逸或制备逆转肿瘤的免疫逃逸的产品；
[0072]
a5)抑制肿瘤对免疫检查点抑制剂的耐药性或抑制肿瘤对免疫检查点抑制剂的耐药性的产品；
[0073]
a6)逆转肿瘤耐药的活性或制备抑逆转肿瘤耐药的活性的产品；
[0074]
所述产品为药物或实验试剂。
[0075]
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
[0076]
实验1：rdn-biotin的生物合成
[0077]
方法：(1)rdn(0.2mmol)，csco3(0.5mmol)，biotin烷基化衍生物(0.3mmol)溶于2ml无水乙腈中，80℃回流5小时后加水终止反应。(2)用二氯甲烷萃取3次，合并有机相。用无水na2so4干燥，过滤，蒸干。剩余固体景柱层析分离纯化得目标化合物，无色晶体。
[0078]
结果：如图1a所示，利用上述反应，得到了rdn-biotin的标签化合物。
[0079]
实验2：rdn-biotin的免疫共沉淀
[0080]
方法：(1)pc3细胞经biotin 2um,rdn-biotin 2um,作用4小时后。冰上收集细胞，4度摇床裂解0.5小时。(2)1.2*10^4g度离心10分钟，取上清。bca检测蛋白浓度。(3)按照20μl/mg蛋白加入high capacity streptavidin agarose resin，4℃摇床孵育2小时。(4)3500g,4℃离心去上清，wash buffer(20mm tris-hcl,140mm nacl,0.1％np40)清洗3遍。(5)最后沉淀加入30μl 2*loading buffer,95℃，5分钟。离心取上清进行sds凝胶电泳。
[0081]
结果：如图1b所示，rdn-biotin可以与囊泡分选蛋白vps18紧密结合。
[0082]
实验3：rdn抑制pd-l1的表达(基因蛋白水平表达)
[0083]
方法：前列腺细胞系pc3、肺癌细胞系a549等经rdn处理12小时后，利用细胞裂解液收集蛋白，利用bca检测蛋白浓度。取15ug蛋白加入上样缓冲液中，8％sds-page凝胶分离，4℃恒流(280ma)转膜1.5小时，将nc膜取出进行5％脱脂牛奶封闭，以兔抗人的pd-l1抗体(abcam,1:1000稀释)进行孵育，4℃过夜。山羊抗兔二抗室温孵育1h，tbs清洗后，采用电化学免疫发光进行定量分析。
[0084]
结果：如图2a、2b所示，rdn在5μm浓度下可明显下调pd-l1的表达。
[0085]
实验4：rdn对pd-l1转录水平的影响(基因转录水平表达)
[0086]
方法：利用trizol法提取细胞总rna，根据takara反转录试剂盒提供说明书，反转录rna成稳定的cdna，反转录所配体系如下：
[0087]
5*rt enzyme mix2μltotal rna1ugrna enzyme free ddw补至10ul
[0088]
结果：如图2c所示，rdn在5μm浓度下对pd-l1的转录水平(基因名为cd274)无调控作用。
[0089]
实验5：vps18在肿瘤组织的表达及耐药中的作用
[0090]
方法：采用免疫组化(肿瘤组织经4％多聚甲醛固定后，经脱水、石蜡包埋后进行切片，石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复等步骤后进行一抗染色、以兔抗人的pd-l1抗体(abcam,1:500稀释)进行孵育，4℃过夜，pbs清洗后，采用dab进行显色。)、免疫沉淀(方法同实验3,4)检测vps18在前列腺癌及肺癌组织与其癌旁组织的表达水平，以及其在耐药细胞中的表达；利用小干扰rna敲低前列腺耐药细胞系pc3/doc中vps18的表达，经化疗药物处理24小时后，进行mtt分析。
[0091]
结果：如图3所示，vps18在肺癌组织高表达、促进肿瘤细胞对化疗药物的耐药。
[0092]
实验6：vps18调控pd-l1的表达
[0093]
方法：利用小干扰rna敲低vps18，采用免疫沉淀和rt-pcr(方法同实验3,4)检测vps18对pd-l1的表达调控作用结果：如图4a和4b所示，下调vps18可降低pd-l1的蛋白表达，但对其转录水平无明显调控作用。
[0094]
实验7：rdn逆转耐药
[0095]
方法：前列腺癌细胞pc3及其耐药细胞pc3/doc，经不同浓度的rdn和多烯紫杉醇处理24h后，进行显微拍照。同时进行mtt抗肿瘤活性分析。
[0096]
结果：如图5a和5b所示，与亲本株pc3相比，前列腺癌耐药细胞pc3/doc对多西紫杉醇耐受，但对rdn更为敏感。
[0097]
实验8：rdn增敏免疫检查点抑制剂ctla4
[0098]
方法：将鼠源前列腺癌细胞，按照1*10^5/只接种在小鼠的左侧腋下，待瘤块长至50mm3时，将小鼠平均分成6组，每组7只(分组如下：ctrl igg，ctrl ctla4，hcq igg，hcq ctla4,rdn igg，rdn ctla4，)；给药剂量为：hcq(60mg/kg),rdn(20mg/kg),ctla4(200ug/只)；给药的时间为：hcq和rdn每天一次，ctla4每3天一次，共计给药至第10天后，处理小鼠，收取肿瘤。进行后续检测。
[0099]
结果；如图6所示，rdn相比于阳性药羟基氯喹hcq，与免疫检查点抑制剂ctla4具有明显的协同抗肿瘤作用。
[0100]
实验9：肿瘤浸润的t淋巴细胞分离检测
[0101]
方法：脱臼处死实验小鼠，剥离肿瘤组织拍照及称重后，将肿瘤组织剪成2-4mm碎片，利用美天旎肿瘤组织解离液和八通道组织处理器将肿瘤组织解离成单细胞悬液，用于后续检测分析。将上述解离的肿瘤单细胞悬液，采用流式抗体标记cd45，cd8以及pd-l1，进行上机检测。
[0102]
结果：如图7所示，rdn与免疫检查点抑制剂ctla4联用与其他组相比能明显增加肿瘤浸润的t淋巴细胞的比例。同时rdn处理组相较于阳性药组，其pd-l1的表达明显下调。
[0103]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。