一种乳腺叶状肿瘤分子标志物CD146及其应用的制作方法

一种乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146及其应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146及其应用。


背景技术：

2.乳腺叶状肿瘤(phyllodes tumor,pt)是一种罕见的纤维上皮性肿瘤，其发生率在乳腺肿瘤中不足1％。世界卫生组织(world health organization，who)根据叶状肿瘤的组织学特性包括间质细胞数目，间质细胞异型性，间质过度增生以及肿瘤边界特征等将叶状肿瘤划分为良性、交界性及恶性[2]。目前，影像学检查：乳腺超声和钼靶的准确性有限。术前穿刺活检，由于肿瘤不同部位异质性的存在，很难进行准确的组织学分级。所以，目前诊断的金标准仍是术后病理组织学检查。然而，叶状肿瘤从良性到恶性呈现出一种形态学的连续性。目前，病理诊断变量的截断值仍未达到有效共识。因此，叶状肿瘤的病理诊断分类相对缺乏客观性。现有的分子标记物在诊断以及预测肿瘤生物学行为方面的价值也有限。叶状肿瘤易复发，交界性及恶性叶状肿瘤还会发生血行转移。化疗和放疗对叶状肿瘤的治疗效果均不确切，能够降低其复发、转移几率的治疗方法只有扩大的手术切除，但即使是扩大的手术切除，恶性叶状肿瘤的局部复发率仍高达28～67％不等，转移率高达21～30％，发生远处转移的病例中，死亡率高达88％。
[0003]
cd146(mcam)，属于免疫球蛋白超家族，为细胞表面i型跨膜蛋白，于1987由johnson团队首次从黑色素瘤中发现并克隆，因而也称为黑色素瘤粘附分子(mel-cam)。其主要表达于新生血管内皮，促进血管新生。同时在部分正常和恶性肿瘤组织中高表达，如黑色素瘤、三阴性乳腺癌、骨肉瘤等。cd146在黑色素瘤中的高表达促进黑色素瘤的生长和转移。在乳腺癌中，cd146参与上皮间质转化(emt)过程，具有促进肿瘤侵袭转移的作用。在骨肉瘤中，cd146的表达促进肿瘤的发展和转移。此外，还有报道显示cd146也表达于间充质干细胞上，参与间充质干细胞的分化、迁移等。
[0004]
不同于发病率较高的乳腺癌，目前针对乳腺叶状肿瘤发生发展及机制的研究甚少，尚缺乏特异性的标志物，相关诊断试剂及相应药物的开发则更少。寻找乳腺叶状肿瘤的分子标志物，对这类肿瘤的临床诊断和精准治疗尤为重要。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146及其应用。
[0006]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146，所述乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146包括具有与seq id no.1所示序列同源性80％以上的cd146基因或具有与seq id no.2或seq id no.3所示序列同源性80％以上的cd146蛋白。
[0007]
本发明还提供一种用于乳腺叶状肿瘤诊断的引物组，所述引物组是基于上述的乳
腺叶状肿瘤分子标志物cd146设计的引物。
[0008]
作为本发明所述的用于乳腺叶状肿瘤诊断的引物组的优选实施方式，所述引物组包括引物cd146-f和引物cd146-r；所述引物cd146-f的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述引物cd146-r的核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0009]
本发明还提供所述乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146作为分子标记物在制备用于诊断乳腺叶状肿瘤的试剂中的应用。
[0010]
本技术发明人经过大量的实验研究发现，cd146在不同组织学分级的乳腺叶状肿瘤中的表达规律：在乳腺叶状肿瘤癌旁组织及良性乳腺叶状肿瘤组织间质细胞上低表达，在交界性叶状肿瘤间质细胞上中等表达，而在恶性叶状肿瘤组织中高表达。在恶性乳腺叶状肿瘤组织中，70％以上的间质肿瘤细胞为cd146阳性，而在良性组织中，cd146阳性的间质细胞占比不到25％。此外，在纤维腺瘤实质细胞上cd146表达水平更低。因此，通过对cd146表达水平的病理检测，可以辅助乳腺叶状肿瘤的鉴别诊断、分类及预后，cd146作为分子标记物可应用于制备用于诊断乳腺叶状肿瘤的试剂。
[0011]
作为本发明所述的乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146作为分子标记物在制备用于诊断乳腺叶状肿瘤的试剂中的应用的优选实施方式，所述试剂包括免疫组织化学病理检测、分子生物学方法、基因芯片或蛋白芯片检测乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146的表达水平以诊断乳腺叶状肿瘤的试剂。
[0012]
本发明还提供所述乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146作为分子标记物在制备用于诊断乳腺叶状肿瘤、乳腺叶状肿瘤疗效监测或乳腺叶状肿瘤预后评估的试剂盒中的应用。
[0013]
作为本发明所述乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146作为分子标记物在制备用于诊断乳腺叶状肿瘤、乳腺叶状肿瘤疗效监测或乳腺叶状肿瘤预后评估的试剂盒中的应用的优选实施方式，所述试剂盒包括上述的引物组和用于组织水平cd146蛋白检测的抗体。
[0014]
本发明还提供所述乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146在制备治疗乳腺叶状肿瘤的药物中的应用。
[0015]
本技术发明人经大量的研究发现，针对cd146靶点，通过抑制性抗体或小分子药物等对cd146表达水平或其介导的信号通路进行调控，可有效抑制乳腺叶状肿瘤细胞的生长、迁移及恶性进展，为乳腺叶状肿瘤的治疗提供新思路和新方法。
[0016]
作为本发明所述乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146在制备治疗乳腺叶状肿瘤的药物中的应用的优选实施方式，所述药物包括抑制乳腺叶状肿瘤细胞增殖的药物、抑制乳腺叶状肿瘤侵袭和转移的药物、抑制cd146 mrna表达的药物、抑制cd146蛋白表达的药物、抑制cd146蛋白活性的药物或抑制cd146信号转导的药物。
[0017]
作为所述乳腺叶状肿瘤分子标志物cd146在制备治疗乳腺叶状肿瘤的药物中的应用的优选实施方式，所述药物包括核酸药物、抗体药物、小分子化学药物或细胞治疗药物；所述抗体药物包括单克隆抗体药物或抗体偶联药物。
[0018]
本发明的有益效果：本发明提供了cd146作为乳腺叶状肿瘤的分子标志物，其表达与叶状肿瘤的生长、转移等恶性进展密切相关，通过对叶状肿瘤cd146表达水平的检测，可辅助乳腺叶状肿瘤的鉴别诊断，分级及预后预测分析。针对cd146靶点，通过抑制性抗体或小分子药物等对cd146表达水平或其介导的信号通路进行调控，可有效抑制乳腺叶状肿瘤细胞的生长、迁移及恶性进展，为乳腺叶状肿瘤的靶向治疗提供新思路和新方法。
附图说明
[0019]
图1：a：cd146在乳腺叶状肿瘤细胞及组织中的表达水平结果；b：良性、交界性及恶性乳腺叶状肿瘤标本中cd146 mrna表达水平结果；c：良性及恶性乳腺叶状肿瘤标本中cd146蛋白表达水平情况；d：良性及恶性乳腺叶状肿瘤细胞系表面cd146表达水平流式分析图。
[0020]
图2：a：敲低cd146基因的恶性乳腺叶状肿瘤细胞中cd146 mrna表达水平结果；b：敲低cd146基因的恶性乳腺叶状肿瘤细胞增殖情况；c：敲低cd146基因的恶性乳腺叶状肿瘤细胞克隆形成情况；d：敲低cd146基因的恶性乳腺叶状肿瘤细胞迁移及侵袭情况；e：敲低cd146基因的恶性乳腺叶状肿瘤细胞胶原收缩情况。
[0021]
图3：a：过表达cd146的良性乳腺叶状肿瘤细胞内cd146 mrna表达水平结果；b：过表达cd146良性乳腺叶状肿瘤细胞增殖情况；c：过表达cd146良性乳腺叶状肿瘤细胞克隆形成情况；d：过表达cd146良性乳腺叶状肿瘤细胞迁移及侵袭情况；e：过表达cd146良性乳腺叶状肿瘤细胞胶原收缩情况。
[0022]
图4：a：cd146特异性抗体对恶性乳腺叶状肿瘤细胞增殖的影响；b：cd146特异性抗体对恶性乳腺叶状肿瘤细胞迁移及侵袭的影响；c：cd146特异性抗体对乳腺叶状肿瘤细胞类器官形成的影响。
[0023]
图5：a：cd146特异性抗体对乳腺叶状肿瘤pdx模型肿瘤生长的影响；b：cd146特异性抗体对乳腺叶状肿瘤pdx模型肿瘤体积的影响。
[0024]
图6：a：乳腺叶状肿瘤细胞内cd146相关信号通路富集分析结果；b：细胞系过表达或敲低cd146对pi3k/akt信号通路水平的影响；c：cd146抗体注射组pdx模型肿瘤组织磷酸化akt水平结果；d：cd146敲低及过表达对恶性乳腺叶状肿瘤细胞系dcbld2水平及akt信号的影响；e：蛋白酶体抑制剂mg132处理对cd146敲低细胞dcbld2水平的影响。
具体实施方式
[0025]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0026]
实施例1乳腺叶状肿瘤组织及细胞水平cd146表达谱分析
[0027]
1、本实施例采用cd146的特异性抗体，进行免疫组织化学染色，评估纤维腺瘤、乳腺叶状肿瘤组织中cd146蛋白水平。
[0028]
(1)实验方法：实验所采用病理切片均来自于73例临床确诊乳腺叶状肿瘤病例。按以下步骤进行石蜡包埋组织免疫组化染色：60℃烘烤处理，预热二甲苯脱蜡两次，每次5min；脱蜡后的切片经100％-95％-80％-70％-50％乙醇梯度及蒸馏水水化，每个梯度放置5min；0.01m(ph6.0)柠檬酸缓冲液高压热修复10min，自然冷却后pbs洗三次，每次5min；0.3％过氧化氢溶液处理30min，消除内源性过氧化物酶活性；pbs洗三次，每次5min；10％羊血清37℃封闭1h；滴加羊血清稀释一抗工作液(aa4)，4℃孵育过夜，pbs清洗；加入生物素标记二抗工作液，37℃孵育20min，pbs清洗三次；加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育20min，pbs清洗三次；滴加dab显色液，室温避光显色2min，pbs洗去多余显色液；苏木素复染，蒸馏水清洗；50％-70％-80％-90％-100％-100％乙醇梯度逐级脱水，每个梯度5min；
中性树脂封片，于显微成像系统拍片。
[0029]
(2)实验结果如图1a所示。由图1a可知，cd146在乳腺叶状肿瘤癌旁组织及良性乳腺叶状肿瘤组织间质细胞上低表达，在交界性叶状肿瘤间质细胞上中等表达，而在恶性叶状肿瘤组织中高表达。在恶性乳腺叶状肿瘤组织中，70％以上的间质肿瘤细胞为cd146阳性，而在良性组织中，cd146阳性的间质细胞占比不到25％。此外，在纤维腺瘤实质细胞上cd146表达水平更低。由此可知叶状肿瘤组织间质细胞上cd146蛋白或mrna表达水平与叶状肿瘤的恶性程度呈正相关。
[0030]
2、采用荧光定量pcr检测不同类型乳腺叶状肿瘤组织标本中cd146 mrna表达水平
[0031]
(1)实验方法：a.分别选取3例良性叶状肿瘤组织标本、1例交界性叶状肿瘤标本及8例恶性叶状肿瘤组织。b.提取肿瘤组织总mrna：将肿瘤组织研碎，加入trizol裂解液，反复吹打或振荡以裂解细胞，室温放置5min，按每1ml trizol裂解液加入0.2ml氯仿，用力振荡15s，室温静置2～3min后，于4℃，12000
×
g离心15min，取上层水相至新ep管中，加入等体积异丙醇沉淀rna；于4℃，12000
×
g离心10min；加入75％乙醇清洗，于4℃，7500
×
g离心15min，弃上清；室温下超静台内晾干rna沉淀，溶解于适量rnase-free水中，测定rna浓度及纯度。c.反转录合成cdna：反转录合成cdna：在pcr管中加入模板rna 1μg，4μl反转录酶superscript ii mix(含buffer、dntp、hiscript ii逆转录酶、rna酶、random primers/oligo dt)，补充rnase-free水至20μl，65℃反应5min，于冰上放置5min后加入8μl 5
×
buffer及2μl 0.1mdtt，混匀后补加ddh2o至40μl，50℃反应15min，85℃反应15s，4℃保存。d.实时定量pcr扩增：将模板cdna稀释3倍并混匀备用。每个实验组设置3个平行管。反应体系为cdna 1μl，sybr green染料5μl，正向引物0.3μl，反向引物0.3μl，ddh2o 3.4μl，离心混匀。95℃反应5min，95℃反应30s，55℃～60℃反应30s，共40个循环。e.以gapdh作为内参分析检测基因的相对转录水平。引物序列如下：gapdh-forward:5
’‑
atcaccatcttccaggagcga-3’；gapdh-reverse:5
’‑
ccttctccatggtgg tgaagac-3’。定量分析mrna相对表达水平。统计数据根据三次重复实验结果计算平均值，显著性差异由t-检验来判断，以p《0.05定义为有统计学差异。
[0032]
(2)实验结果如图1b所示。由图1b可知，良性叶状肿瘤组织中cd146mrna表达水平低，交界性肿瘤组织表达水平较良性高，而恶性叶状肿瘤组织中cd146 mrna表达水平至少为交界性肿瘤组织的2倍。
[0033]
3、蛋白免疫印迹(western blot)实验检测不同类型叶状肿瘤组织中cd146蛋白表达水平。
[0034]
(1)实验方法：经sds-page电泳、转膜、封闭之后，采用cd146特异性抗体(aa98)作为一抗孵育，进一步采用辣根过氧化物酶标二抗孵育之后进行凝胶成像分析。
[0035]
(2)实验结果如图1c所示。由图1c可知，6例恶性叶状肿瘤组织中cd146蛋白表达量较高，而在3例良性叶状肿瘤组织中cd146蛋白不表达或低表达。
[0036]
4、流式细胞术检测叶状肿瘤组织分离得到原代细胞株表面标志物。
[0037]
(1)实验方法：收集良性及恶性乳腺叶状肿瘤细胞，孵育pe标记抗cd146抗体及同型对照，采用流式细胞仪检测。
[0038]
(2)实验结果如图1d所示。由图1d的表达量直方图可知，恶性叶状肿瘤细胞系表面cd146表达显著高于良性肿瘤细胞系。
[0039]
实施例2
[0040]
本实施例对临床病乳腺叶状肿瘤cd146表达水平与临床病理指标情况相关性进行分析。
[0041]
(1)实验方法：以实施例1中的确诊为乳腺叶状肿瘤的203名患者为实验对象，统计203名患者的性别、肿瘤级别、肿瘤大小、局部复发情况、转移情况、核分裂像和间质细胞增生情况。
[0042]
(2)分析结果如表1所示。
[0043]
表1
[0044][0045][0046]
结果显示，cd146高表达(si≥4)与叶状肿瘤恶性分级有显著相关性(p《0.001)；此外，cd146高表达(si≥4)的病人局部复发率显著高于cd146低表达组(si《4)(p《0.01)；出现转移的情况中cd146高表达病人多于cd146低表达病人(p＝0.0811)。可见，cd146高表达与乳腺叶状肿瘤病理分级及预后情况密切相关。
[0047]
实施例3敲低cd146基因对恶性乳腺叶状肿瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及胶
原收缩能力的影响
[0048]
1、敲低cd146基因对恶性乳腺叶状肿瘤细胞增殖、克隆形成的影响
[0049]
(1)实验方法：采用lipo3000瞬时转染sirna(sirna1:sense:cca gcu ccg cgucuacaa adtdt,antisense:uuu gua gac gcg gag cug gdtdt；sirna2:sense:gggagagaaauacaucgautt,antisense:aucgauguauuucucuccctg；sirna3:sense:ggaacuacuggugaacuautt；antisense:auaguucaccaguaguucctg)至恶性乳腺叶状肿瘤细胞系中，敲低cd146表达(如图2a所示)；接种敲低cd146表达及未进行基因敲低的对照组细胞，采用mts比色法，测试不同时间点(1～4天)细胞存活率，绘制细胞增殖曲线。接种敲低cd146表达及未进行基因敲低的对照组细胞至60mm中皿的完全培养基中，每皿200个细胞，培养14天后，计数克隆形成数量。
[0050]
(2)实验结果如图2b和图2c所示。
[0051]
2、敲低cd146基因对恶性乳腺叶状肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响
[0052]
(1)实验方法：将敲低cd146基因表达及未进行基因敲低的对照组细胞以2*104/孔的密度接种于transwell板(costar)上层小室无血清培养基中或预铺matrigel薄层上层培养室中，下层为含10％胎牛血清的完全培养基，每组设置三个重复孔；37℃培养箱分别培养8小时或24小时后，小心擦去膜上层细胞，利用结晶紫对下室细胞进行染色，显微镜下计数发生迁移或侵袭的细胞数目。
[0053]
(2)实验结果如图2d所示。
[0054]
3、敲低cd146基因对恶性乳腺叶状肿瘤细胞胶原收缩能力的影响
[0055]
(1)实验方法：用含乙酸和naoh的dmem培养基稀释ⅰ型鼠尾胶原，叶状肿瘤细胞悬液与稀释后的鼠尾胶原1:1混合后，接种到24孔板中，加入含血清的培养基4小时后，换上无血清dmem培养基孵育过夜，使胶与孔壁分离，8小时后观察、测量收缩后的直径。
[0056]
(2)实验结果如图2e所示。
[0057]
由图2可知，敲低cd146基因使恶性乳腺叶状肿瘤细胞的增殖能力降低；敲低cd146基因使恶性乳腺叶状肿瘤细胞克隆形成能力显著降低；敲低cd146基因的恶性乳腺叶状肿瘤细胞的迁移及侵袭能力显著下降；敲低cd146基因使恶性乳腺叶状肿瘤细胞胶原收缩能力显著降低。cd146高表达于恶性乳腺叶状肿瘤细胞上，发挥促进细胞生长、迁移、侵袭及胶原收缩的功能，提示cd146可作为恶性乳腺叶状肿瘤的分子标志物，促进乳腺叶状肿瘤恶性进展。
[0058]
实施例4过表达cd146对良性叶状肿瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及胶原收缩能力的影响
[0059]
1、过表达cd146对良性乳腺叶状肿瘤细胞增殖的影响
[0060]
(1)实验方法：接种原代良性叶状肿瘤细胞至6孔板中，采用传染试剂viafect转染cd146过表达质粒(1.5μg/孔)，转染4～6小时后更换正常完全培养基，收集细胞提取rna样品，检测cd146过表达水平(如图3a所示)。接种过表达cd146及未进行处理的对照组细胞，采用mts比色法，测试不同时间点(1～4天)细胞存活率，绘制细胞增殖曲线。接种过表达cd146及未进行处理的对照组细胞至60mm中皿的完全培养基中，每皿200个细胞，培养14天后，计数克隆形成数量。
[0061]
(2)实验结果如图3b和图3c所示。
[0062]
2、过表达cd146对恶性乳腺叶状肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响
[0063]
(1)实验方法：将过表达cd146及未进行处理的对照组细胞以2*104/孔的密度接种于transwell板(costar)上层小室无血清培养基中或预铺matrigel薄层上层培养室中，下层为含10％胎牛血清的完全培养基，每组设置三个重复孔；37℃培养箱分别培养8小时或24小时后，小心擦去膜上层细胞，利用结晶紫对下室细胞进行染色，显微镜下计数发生迁移或侵袭的细胞数目。
[0064]
(2)实验结果如图3d所示。
[0065]
3、过表达cd146对恶性乳腺叶状肿瘤细胞胶原收缩能力的影响
[0066]
(1)实验方法：用含乙酸和naoh的dmem培养基稀释ⅰ型鼠尾胶原，叶状肿瘤细胞悬液与稀释后的鼠尾胶原1:1混合后，接种到24孔板中，加入含血清的培养基4小时后，换上无血清dmem培养基孵育过夜，使胶与孔壁分离，8小时后观察、测量收缩后的直径。
[0067]
(2)实验结果如图3e所示。
[0068]
由图3可知，在过表达cd146的乳腺叶状肿瘤细胞株中，观察到细胞的增殖，克隆形成、迁移、侵袭及胶原收缩能力显著增强，表现出与恶性叶状肿瘤细胞类似的生物学行为。
[0069]
实施例5cd146特异性抗体抑制恶性叶状肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及类器官形成
[0070]
1、cd146特异性抗体抑制恶性叶状肿瘤细胞增殖实验
[0071]
(1)实验方法：接种恶性乳腺叶状肿瘤细胞至96孔板，同时加入cd146抗体maa98(150μg/ml)或同型对照migg及pbs，培养至24、48、72、96小时，采用mts试剂检测细胞活力，绘制细胞增殖曲线。
[0072]
(2)实验结果如图4a所示。由图4a可知，相对于pbs及igg对照组，cd146抗体显著抑制恶性乳腺肿瘤细胞的生长，提示cd146可作为乳腺叶状肿瘤潜在的药物新靶点。
[0073]
2、cd146特异性抗体抑制恶性叶状肿瘤细胞迁移和侵袭
[0074]
(1)实验方法：将恶性叶状肿瘤细胞以2*104/孔的密度接种于transwell板(costar)上层小室无血清培养基中或预铺matrigel薄层上层培养室中，下层为含10％胎牛血清的完全培养基，接种细胞的同时加入cd146抗体maa98孵育，以加入migg或pbs的恶性叶状肿瘤细胞作为对照，37℃培养箱培养8小时或24小时后，统计分析细胞迁移及侵袭数量。
[0075]
(2)实验结果如图4b所示。由图4b可知，cd146抗体能够显著抑制乳腺叶状肿瘤细胞的迁移及侵袭，提示可利用靶向cd146的治疗性抗体进行乳腺叶状肿瘤抗转移新药的研制。
[0076]
3、cd146特异性抗体抑制恶性叶状肿瘤细胞类器官形成
[0077]
(1)实验方法：从临床标本中分离原代乳腺叶状肿瘤细胞，进行类器官培养，在微孔板中同时加入cd146抗体maa98(150μg/ml)进行孵育培养，以加入migg或pbs作为对照，分别在0、7、14、21、28及38天于显微镜下观察孔板中类器官形成情况。
[0078]
(2)实验结果如图4c所示。由图4c可知，cd146抗体aa98对原代叶状肿瘤细胞类器官形成具有显著的抑制作用。
[0079]
实施例6cd146特异性抗体抑制人恶性叶状肿瘤异种移植模型(pdx)肿瘤生长
[0080]
(1)实验方法：构建乳腺叶状肿瘤pdx模型：取恶性乳腺叶状肿瘤组织，将其剪成直径约1mm组织块，在距离小鼠左前肢腋窝部皮下乳房脂肪垫约2cm处做3mm切口，套管针通过皮下隧道将3-4个小组织块送至皮下脂肪垫。待肿瘤生长至100m3左右时，对荷瘤小鼠进行
随机分组，每组6只，分别腹腔注射cd146抗体(maa98、chaa98)及对照试剂(pbs、migg、higg)，注射剂量为250μg/只，每周注射两次，连续注射5次。每周持续监测肿瘤大小，根据公式v＝1/2(l
×
w2)计算移植瘤平均体积。待肿瘤体积达到直径1.5cm时停止注射，并绘制肿瘤生长变化曲线。
[0081]
(2)实验结果如图5a和图5b所示。由图5a和图5b可知，与对照组(pbs、migg或higg组)相比，cd146抗体注射组肿瘤生长明显被抑制。
[0082]
实施例7cd146通过激活下游pi3k-akt信号通路促进乳腺叶状肿瘤恶性进展
[0083]
(1)实验方法：a.采用良性乳腺叶状肿瘤细胞株及相应cd146过表达细胞，恶性乳腺叶状肿瘤细胞株及cd146敲低表达细胞，进行mrna表达谱芯片测序及差异基因表达、信号通路富集分析；b.采用western blot验证pi3k-akt信号通路下游相关信号蛋白的表达变化；c.对实施例5的小鼠pdx肿瘤组织进行western blot检测；d.恶性乳腺叶状肿瘤细胞系cd146敲低及过表达后dcbld2及akt信号变化；e.蛋白酶体抑制剂mg132处理(4h)对cd146敲低细胞中dcbld2水平的影响。
[0084]
(2)实验结果如图6所示。由图6a可知，pi3k-akt信号通路及细胞因子相互作用通路均涉及较多的基因表达水平改变；由图6b可知，相对于良性乳腺叶状肿瘤细胞，在cd146过表达或恶性乳腺叶状肿瘤细胞中，磷酸化akt(p-akt)表达显著上调，p-akt上调表明akt信号通路激活，akt信号通路的活化与肿瘤的发生、发展与转移密切相关；由图6c可知，对照组相比(pbs、migg或higg组)，cd146抗体(maa98、chaa98)注射组肿瘤组织磷酸化akt(p-akt)表达显著下调；由图6d可知，由图6d可知，敲低cd146抗体显著下调dcbld2表达及p-akt水平，恢复cd146表达可上调dcbld2表达及p-akt水平；由图6e可知，使用蛋白酶体抑制剂mg132处理cd146敲低细胞系可抑制dcbld2水平的下调，表明cd146可抑制dcbld2的蛋白降解，从而激活下游akt信号通路。
[0085]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。