对非人动物进行基因改造和构建免疫缺陷动物模型的方法与流程

1.本技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种对非人动物进行基因改造的方法和构建重度免疫缺陷动物模型的方法。


背景技术：

2.小鼠免疫系统人源化通常是指在免疫缺陷型小鼠体内植入人外周血白细胞(hpbmc)或人造血干细胞(cd34 hsc)以后，在小鼠体内重建一种或几种人免疫细胞。一方面，小鼠免疫系统人源化过程可以用于检测人类造血干细胞及基于人类造血干细胞的治疗细胞的分化和定植功能，另一方面人源化的小鼠还能够更好地模拟人类免疫系统及肿瘤免疫微环境，在传染性疾病、抗体药物开发，自身免疫病以及肿瘤学研究等多领域的有不可替代的作用。
3.免疫系统人源化通常需要使用重度免疫缺陷小鼠。在重度免疫缺陷小鼠表达某些人源化的细胞因子，有助于在小鼠重建完善的人免疫系统。重度免疫缺陷小鼠通常是指nod scid il2rγko小鼠(scid突变及il2rγ敲除的nod小鼠)，balb/c rag1ko.il2rγko(il2rγ及rag1敲除的balb/c小鼠)或balb/c rag2ko.il2rγko小鼠(il2rγ及rag2敲除的balb/c小鼠。相较于仅有scid、rag1或rag2敲除的普通的免疫缺陷小鼠，重度免疫缺陷小鼠进一步敲除了il2rγ，不仅缺少t细胞，b细胞，而且缺少nk细胞功能，并且巨噬细胞、树突状细胞的数量也大量减少，进一步降低了免疫功能的小鼠，更加有利于人源化免疫系统的构建。
4.二十年前，日本的实验动物中央研究所(clea)发展了以nod为遗传背景的重度免疫缺陷型小鼠(nod scid il2rγko，)。随后，美国的jackson lab也开发了类似的小鼠，命名为很多中国公司也开发了以nod为背景的重度免疫缺陷型小鼠，分别命名为npg，ncg，nsi，b-ndg，m-nsg等。除了以nod为遗传背景的重度免疫缺陷小鼠，还有以balb/c为遗传背景的balb/c rag1/2ko il2rγko小鼠。目前，广泛用于重建人免疫系统的重度免疫缺陷小鼠是nod scid il2rγko小鼠，而balb/c rag1/2ko il2rγko小鼠天然免疫活性比nod scid il2rγko小鼠要高，重建人免疫系统能力也比nod scid il2rγko小鼠要弱，如果要提高balb/c rag1or2ko il2rγko小鼠重建人免疫系统的程度，需要经过更多的基因修饰。因此，balb/c rag1or2ko il2rγko小鼠在应用上不如nod scid il2rγko小鼠广泛。以上所述重度免疫缺陷小鼠被统称为第一代重度免疫缺陷小鼠。
5.在重度免疫缺陷型小鼠体内重建人源化免疫系统通常是通过向小鼠体内植入人的造血干细胞(cd34 hsc)来实现的。一段时间后，人造血干细胞可在小鼠体内重建出各种免疫细胞，例如人t细胞、人b细胞、人髓系细胞等。人的免疫系统通常需要人细胞因子的支持才能分化成熟。但由于第一代重度免疫缺陷小鼠缺少人mhc分子，而且部分小鼠细胞因子和人细胞因子缺少交叉反应，因此在一代重度免疫缺陷小鼠体内重建的人免疫系统存在功能缺陷，例如髓系细胞比较少，淋巴组织发育不全，t细胞和b细胞功能不完善。
6.因此，不断有人尝试在重症免疫缺陷小鼠体内表达人细胞因子或可发挥与人细胞因子同等作用的工程化细胞因子。然而目前广泛用于重建人免疫系统的nod scid il2rγ
ko小鼠由于遗传背景的特性，其胚胎干细胞(es细胞)不适于进行基因改造。而且这种小鼠的受精卵受孕率低，细胞核发育不成熟，也很难直接用于制作基因敲入或者过表达的转基因小鼠。由于对这种小鼠进行基因修饰的难度大，因此制作转基因重度免疫缺陷小鼠的方法通常是先对c57bl小鼠进行基因修饰，然后和nod scid il2rγko小鼠连续回交10代。经过约两年后，c57bl遗传背景的转基因小鼠可转变为nod scid il2rγko遗传背景的转基因小鼠。
7.虽然免疫缺陷小鼠已经缺少了全部被动免疫系统，但是还保留了一部分先天免疫系统，例如保留巨噬细胞对细菌的吞噬功能。这部分与维持小鼠天然免疫功能相关的细胞因子对于维持重度免疫缺陷型小鼠的健康非常重要。例如gmcsf对于促进小鼠髓系细胞的成熟比较重要。但是人和小鼠的gm-csf的序列同源性比较低，功能上没有交叉活性。因此，在缺乏人gm-csf的小鼠体内重建的人免疫系统的髓系细胞的将受到影响。如果为了改善重建的人免疫系统功能而将这些细胞因子人源化，人源后的细胞因子不会代偿鼠源细胞因子的功能，因此小鼠先天免疫特别是髓系细胞的功能会受到损伤，出现肺泡蛋白沉着症(pulmonary alveolar proteinosis，pap)造成呼吸困难，肺部感染风险上升。再如，tpo可促进巨核细胞前体细胞增殖和分化。但是人源化后，人源化的tpo不能替代小鼠tpo的功能。小鼠会表现出血小板减少导致的寿命的减少。因此将这种与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子人源化不利于重度免疫缺陷小鼠的健康，繁殖和商业化。还有一种情况是，有些小鼠细胞因子主要在t细胞和b细胞表达，而重度免疫缺陷小鼠没有t细胞和b细胞，因此在这些细胞因子原为人源化后，检测不到基因的表达。如il3和il2主要在小鼠t细胞表达，但是在重度免疫缺陷小鼠人源化后，在血清中检测不到il3和il2的表达。因此，以上这两种情况需要过表达人源的细胞因子。
8.以il3和gm-csf为例。人il3和人gm-csf和小鼠同源蛋白序列相似度比较低，没有交叉活性。因此小鼠的il3和gm-csf不能促进人髓系细胞的发育，反之亦然。因此，在重度免疫缺陷小鼠体内表达il3和gm-csf有助于在其中重建人免疫系统，特别是人的各种髓系细胞。然而如果将小鼠il3和gm-csf替换为人的或人源化的il3和gm-csf，nod scid il2rγko小鼠的髓系细胞会因为缺少内源鼠il3和gm-csf的支持而影响自身的天然免疫保护作用，从而影响小鼠的健康和寿命。于是，有人考虑采用过表达而非用人源化基因替代小鼠原有基因的方式。然而现有技术中过表达人的某些细胞因子也会影响小鼠生理功能。例如美国jackson lab的nsg sgm3小鼠是利用cmv启动子过表达人scf，il3和gm-csf，其细胞因子血清表达量为2000～4000pg/ml。日本clea研究所sv40启动子在nog小鼠过表达人il3(80pg/ml)和人gm-csf(35pg/ml)，命名为nog exl小鼠。无论nsg sgm3小鼠还是nog exl小鼠都是先在c57bl小鼠过表达人的基因，然后通过与nod scid il2rγko小鼠连续侧交实现的。另外，这两种小鼠都使用组成性表达启动子(cmv启动子和sv40启动子)，会持续过表达的细胞因子都会对随后人免疫系统产生不同程度的激活作用。例如，nsg sgm3高表达的人细胞因子可以加速人免疫系统的重建速度，但持续表达的细胞因子也会因过度激活人巨噬细胞。过度激活的人巨噬细胞可以吞噬小鼠的血细胞，从而使小鼠因缺血症影响小鼠的寿命，缩短实验窗口期。nog exl小鼠的细胞因子表达量比较低，小鼠寿命比较长，寿命任然少于非转基因的免疫缺陷小鼠。因此，本技术在nod scid il2rγko小鼠中保留其本身的鼠源il-3和gm-csf，同时探索如何适度表达人il3和gm-csf成为优化的选择。
9.目前,在免疫缺陷型小鼠过表达人细胞因子主要是组成性表达的启动子,例如cmv启动子和sv40启动子。这种类型的启动子可使基因表达产物在所有组织细胞中持续表达。因此，非生理水平基因表达产物一方面会对某些组织器官产生基因毒性，另一方面持续表达的细胞因子会持续激活人的免疫系统，给随后小鼠的健康和功能性分析带来干扰。过去研究发现，在免疫缺陷小鼠人源化免疫系统过程中，鼠源的血液白细胞主要是髓系细胞会递减甚至被人免疫细胞替换，因此选择髓系细胞的启动子可以避免外源表达基因在免疫系统人源化后的持续表达，有助于维持小鼠健康和功能性分析。
10.综上所述，现有技术中对nod scid il2rγko小鼠直接进行基因改造的成功率低，难度大，因此需要利用其它遗传背景的小鼠进行多代回交，导致消耗大量的时间和人力成本。并且现有技术中小鼠体内的人源细胞因子过表达，或与小鼠自身细胞因子的互相干扰，对小鼠本身发育成长和寿命产生不良影响，同时也会影响到在小鼠体内构建的人免疫系统的功能。对于与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子，在小鼠体内进行人源化替代小鼠原有细胞因子或是使用现有技术进行过表达均会影响小鼠的健康和寿命，以及在其体内构建人免疫系统的功能。


技术实现要素：

11.技术问题
12.为更方便高效地引入人细胞因子或人源化细胞因子，构建更加适宜于重建人造血干细胞系统的小鼠，同时降低时间和人力成本，本技术利用优化的基因工程学方法，同时在一些步骤上进行创造性的改进，直接改造非人动物，例如nod scid il2rγko重度免疫缺陷型小鼠的受精卵细胞以避免回交，得到更加适宜于重建多功能人免疫系统的重度免疫缺陷型小鼠。
13.本技术解决了一些细胞因子在小鼠及构建的人免疫系统中不兼容的问题，即如何适时适度地表达人细胞因子，因为一些需要在小鼠体内表达的细胞因子为人免疫系统分化、成熟、维持或发挥免疫学或生理相关功能所需要，然而当其过度表达时又会影响小鼠健康或缩短小鼠寿命，如果直接将小鼠同源细胞因子人源化以获得一个生理性表达水平，小鼠本身又会因为缺失鼠源细胞因子而影响健康与发育或者因为细胞因子表达的组织特异性，在重度缺陷小鼠人源化后检测不到人源化基因的表达。
14.技术方案
15.具体来说，本技术涉及如下技术方案：
16.1.一种对非人动物进行基因改造的方法，其包括：
17.对非人动物细胞的受精卵进行基因改造，
18.基因改造包括利用piggy转座酶依赖的转基因系统对非人动物的受精卵进行基因编辑；
19.优选地，所述受精卵是体外受精的受精卵；
20.进一步优选地，所述受精卵是通过体外受精得到的，并且在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。
21.2.根据项1所述的方法，其中，对非人动物细胞的受精卵进行基因改造是通过对受
gsg-f2a(rakr-gsg-vkqtlnfdllklagdvesnpgp)介导不同蛋白的过表达，其中，rakr是furin剪切短肽的序列，gsg是linker；
41.优选地，所述双重自我剪切短肽为rakr-gsg-p2a，编码双重自我剪切短肽rakr-gsg-p2a的基因的序列如seq id no.4所示。
42.8.根据项6所述的方法，其中，利用piggybac转座子系统质粒来在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白，在piggybac转座子系统质粒中还插入有bgh polya序列，优选其序列如seq id no.1所示；
43.优选地，在piggybac转座子系统质粒中还插入有反响重复序列，优选其序列如seq id no.7或seq id no.8所示。
44.9.根据项4～8中任一项所述的方法，其中，
45.所述非人动物是以nod为遗传背景的小鼠；
46.所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod小鼠；
47.所述小鼠再进一步优选是敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠。
48.10.根据项4～9中任一项所述的方法，其中，所述非人动物的受精卵是通过体外受精获得的；
49.优选地，对所述非人动物的受精卵进行基因改造之前对体外受精得到的受精卵在体外培养一定时间，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。
50.11.根据项6所述的方法，其中，所述对所述非人动物的受精卵进行基因改造是对受精卵的细胞质进行胞浆注射，胞浆注射的物质包括：
51.piggybac转座子系统质粒和piggybac转座酶；
52.优选地，piggybac转座子系统质粒包括seq id no.2所示的序列。
53.12.一种构建重度免疫缺陷的动物模型的方法，该方法包括：
54.在非人动物中过表达目标蛋白，所述目标蛋白为目标蛋白一和/或目标蛋白二；
55.其中，所述目标蛋白一主要在t细胞、b细胞和nk细胞中表达；所述目标蛋白二可能会影响免疫缺陷小鼠的健康；
56.优选地，在非人动物中过表达的目标蛋白包括以下任意一种或两种以上：人白细胞介素-3(人il3)、人白细胞介素-2(人il2)、人血小板生成素(人tpo)、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(人gm-csf)、人巨噬细胞集落刺激因子(人mcsf)；
57.优选地，在非人动物中过表达人白细胞介素-3(人il3)和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(人gm-csf)；
58.优选地，编码人白细胞介素-3(人il3)的人il3 cdna的序列如seq id no.5所示；编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(人gm-csf)的人gm-csf cdna的序列如seq id no.6所示。
59.13.根据项12所述的方法，其中，
60.对非人动物进行基因改造的方法是对非人动物的受精卵进行基因改造使得在非人动物中过表达目标蛋白是指在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白；
61.优选利用特异性在髓系细胞表达的启动子来在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白；
62.优选所述髓系细胞表达的启动子选自人cd68启动子、csf1r启动子、cd11c启动子、cx3cr1启动子、langerin/cd207启动子、mmlv ltr启动子、visna virus ltr启动子、dc-stamp启动子、human msr启动子、msr-a启动子、cd4启动子、cd2启动子、iba-aif-1启动子、cd11b启动子、c-fms启动子、scavenger receptor a(sr-a)启动子、lysozyme启动子和mhc class ii启动子(mhc-ii)，启动子在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白；
63.进一步优选利用人cd68启动子在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白；
64.进一步优选利用piggybac转座子系统质粒和piggybac转座酶来在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白。
65.14.根据项13所述的方法，其中，在非人动物中过表达两个以上目标蛋白时，利用双重自我剪切短肽rakr-gsg-p2a(rakr-gsg-atnfsllkqagdveenpgp)、rakr-gsg-t2a(rakr-gsg-egrgslltcgdveenpgp)、rakr-gsg-e2a(rakr-gsg-qctnyallklagdvesnpgp)或rakr-gsg-f2a(rakr-gsg-vkqtlnfdllklagdvesnpgp)介导不同目标蛋白的过表达，其中rakr是furin剪切短肽的序列，gsg是linker；
66.优选地，所述双重自我剪切短肽为rakr-gsg-p2a，编码双重自我剪切短肽pakr-gsg-p2a的基因的序列如seq id no.4所示。
67.15.根据项13所述的方法，其中，利用piggybac转座子系统质粒来在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白，在piggybac转座子系统质粒中还插入有pgh polya序列，优选其序列如seq id no.1所示；
68.优选地，在piggybac转座子系统质粒中还插入有反响重复序列，优选其序列如seq id no.7或seq id no.8所示。
69.16.根据项12～15中任一项所述的方法，其中，
70.所述非人动物是以nod为遗传背景的小鼠；
71.所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod小鼠；
72.所述小鼠再进一步优选是进一步敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠。
73.17.根据项12～16中任一项所述的方法，其中，所述非人动物的受精卵是通过体外受精获得的；
74.优选地，对所述非人动物的受精卵进行基因改造之前对体外受精得到的受精卵在体外培养一定时间，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。
75.18.根据项13所述的方法，其中，所述对所述非人动物的受精卵进行基因改造是对受精卵的细胞质进行胞浆注射，胞浆注射的物质包括：
76.piggybac转座子系统质粒和piggybac转座酶；
77.优选地，piggybac转座子系统质粒包括seq id no.2所示的序列。
78.19.一种piggybac转座子系统质粒，其序列如seq id no.2所示。
79.发明的效果
80.本技术直接对nod scid il2rγko小鼠受精卵进行基因改造，得到表达人源化细胞因子的nod scid il2rγko小鼠，避免多代回交，从而节省时间和人力成本。另外，对于与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子，本技术做到了适时适度的表达，一方面减少了在该小鼠体内构建人免疫系统时对人免疫系统分化定植及功能的影响，另一方面又避免了过度表达的人细胞因子对小鼠发育及生理功能的影响，从而维持了小鼠的健康，延长了小鼠寿命及实验窗口期。此外，普通dna显微注射需要大片段进入受精卵细胞核，而piggybac技术可以进行受精卵染色质注射，因此特别适合细胞发育不全或迟缓的受精卵。
81.综上所述，本技术涉及一种工程化重度免疫缺陷小鼠的方法，所述工程化重度免疫缺陷小鼠可用于更加完整高效地在小鼠体内重建人免疫系统。相较于现有技术，使用本技术所述方法获取工程化小鼠更加省时高效，并且所获得的小鼠健康状况更好，具有更长的试验窗口期，利用所述小鼠重建的人免疫系统功能也更加完备。
附图说明
82.图1为piggybac cd68pro-intron-hgm-csf-pakr-gsg-p2a-hil3-pa重组质粒。
83.图2为piggybac转基因小鼠pcr鉴定电泳图，数字标号为阳性小鼠，m为1kb dna标记物。其中3、4、5、6、10为f0代nod-scid il2rγko-tg(hcd68-hil3/gmcsf)小鼠，12、13、14为f0代nod-scid il2rγko-tg(sv40-hil3/gmcsf)小鼠，wt为阴性转基因小鼠。
84.图3为反向pcr的工作原理图。
85.图4为反向pcr产物电泳结果图。
86.图5为人il3和人gm-csf在转基因小鼠组织内表达特异性鉴定结果图。
87.图6(a)～(d)为注射人cd34干细胞第12周后，人免疫系统在小鼠体内的表型特征。
88.图7为移植人cd34干细胞后小鼠的存活比例。
89.图8为注射人cd34干细胞第12周后小鼠血浆中细胞因子的表达水平。
90.图9为注射人cd34干细胞第16周后小鼠血红蛋白数。
具体实施方案
91.定义
92.如本文中使用的术语“后代”包括子孙后代，并且包括自亲本细胞衍生的分化的或未分化的后代细胞。在一种用法中，术语后代包括与亲本遗传相同的后代细胞。在另一种使用中，术语后代包括与亲本遗传且表型相同的后代细胞。在又一种用法中，术语后代包括已经自亲本细胞分化的后代细胞。
93.如本文中使用的术语“启动子”包括与要转录的核酸序列(诸如编码期望分子的核酸序列)可操作连接的dna序列。启动子一般位于要转录的核酸序列的上游，并且提供rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。在特定的实施方案中，启动子一般位于转录的核酸序列的上游以生成期望的分子，并且提供rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。
94.如本文中使用的术语“免疫缺陷的”意指非人动物在其天然免疫系统的一个或多个方面是缺陷的，例如动物在一种或多种类型的发挥功能的宿主免疫细胞方面是缺陷的，例如在非人b细胞数目和/或功能、非人t细胞数目和/或功能、非人nk细胞数目和/或功能等
方面是缺陷的。
95.在本文中使用的术语“非人动物”例如实验室动物、家畜、牲畜等，例如诸如鼠、啮齿类、犬、猫、猪、马、牛、绵羊、非人灵长类等物种；例如小鼠、大鼠、家兔、仓鼠、豚鼠、牛、猪、绵羊、山羊、和其它转基因动物物种，特别是哺乳动物物种，如本领域中已知的。在某些实施方案中，主题经遗传修饰的动物是小鼠、大鼠或家兔。
96.在一个实施方案中，非人动物是哺乳动物。在一些此类实施方案中，非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠总科(dipodoidea)或鼠总科(muroidea)的。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物是啮齿类。在一个实施方案中，啮齿类选自小鼠、大鼠、和仓鼠。在一个实施方案中，啮齿类选自鼠总科。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物来自选自下述的科：丽仓鼠科(calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(cricetidae)(例如仓鼠、新世界(newworld)大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺小鼠(spiny mice)、鬃毛大鼠(crested rats))、马岛鼠科(nesomyidae)(攀爬小鼠(climbing mice)、岩石小鼠(rock mice)、有尾大鼠(with-tailed rat)、马达加斯加(malagasy)大鼠和小鼠)、刺山鼠科(platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠(spiny dormice))、和鼢鼠科(spalacidae)(例如鼹鼠(mole rates)、竹鼠(bamboo rat)、和鼢鼠(zokors))。在一个具体的实施方案中，经遗传修饰的啮齿类选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、多刺小鼠、和鬃毛大鼠。在一个实施方案中，经遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。
97.如本文中使用的术语，nod小鼠是指no obesity diabetes即非肥胖糖尿病小鼠。nod小鼠有很多衍生品系，包括nod/scid nod/ltj小鼠等。
98.如本文中使用的术语“免疫缺陷小鼠”是指先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的小鼠，其常见突变基因型是，scid突变，rag1敲除，rag2敲除，主要表型是缺少t细胞和b细胞。
99.如本文中使用的术语“重度免疫缺陷鼠”通常是指进一步敲除了il2rγ基因功能的免疫缺陷型小鼠。il2rγ为很多细胞因子的共有受体。il2rγ的敲除可进一步降低小鼠免疫系统的功能。重度免疫缺陷鼠主要表型是缺少t细胞，b细胞，nk细胞功能，而且巨噬细胞、树突状细胞的数量也大量减少。重度免疫缺陷鼠的主要用途是在小鼠重建人的免疫系统。
100.如本文中使用的术语“免疫系统人源化小鼠”通常是指在重度免疫缺陷型小鼠植入了人外周血白细胞(hpbmc)或人造血干细胞(cd34 hsc)以后，在小鼠体内重建一种或几种人免疫细胞的小鼠。
101.如本文中使用的术语“crispr/cas9”是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定dna修饰的技术。以crispr/cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。
102.如本文中使用的术语“piggy转座系统”也称为sleeping beauty转座系统(或piggybac系统)，piggybac(pb)转座子来源于鳞翅目昆虫，在分类上属于真核生物的第二类转座子，是一个自主因子，长2476bp，有短的末端反向重复序列(itr)和一个开放编码框(orf)。piggy转座子主要采取“cut-paste”机制发生转座。piggy转座系统转座效率高，宿主
范围广，广泛应用于昆虫等低等生物的基因转移及突变筛选。利用piggy转座子构成的载体-辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕。转座时转座酶通过与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，转座子完全切离后，通过其3'oh末端攻击靶dna序列中ttaa位点的5'末端，转座子5'序列的ttaa悬垂与靶dna打开的单链ttaa相配对，与整合位置两侧的空隙重新连接，连接过程不需要合成dna。
103.在本文中使用的术语“白细胞介素”是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导t、b细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白细胞介素interleukin缩写为il，功能关系免疫反应的表达和调节，这种调节有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等的许多因子参与。来源于淋巴细胞的有淋巴细胞活素，来源于巨噬细胞的总称为monokine，其中的各个因子的生物活性各有不同(例如巨噬细胞活化，促进t细胞繁殖等)，因子自身的物理化学性质多不清楚。
104.血小板生成素(tpo)是催化甲状腺激素的重要酶。tpo由甲状腺滤泡细胞合成，它是由933个氨基酸残基组成的分子量为103kd的10％糖化的血色素样蛋白质，在滤泡腔面的微绒毛处分布最为丰富。tpo以过氧化氢为氧化剂。试验中摘除大鼠垂体48h后，tpo活性消失，注入促甲状腺激素后，tpo活性即恢复，可见tpo的生成和活性受tsh调节。硫脲类药物能抑制tpo活性，因而可抑制甲状腺激素的合成，是临床上用于治疗甲状腺功能亢进(甲亢)的常用药物。
105.白细胞介素-3(il3)是白细胞介素家族重要成员之一，又名多向性集落刺激因子(multi-csf)，是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种。它是由t淋巴细胞所产生，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。在本技术中涉及的编码人白细胞介素-3(人il3)的人il3 cdna的序列如seq id no.5所示。
106.白细胞介素-2(il2)是趋化因子家族的一种细胞因子。它是由多细胞来源(主要由活化t细胞产生)，又具有多向性作用的细胞因子(主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化)；对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的t细胞增殖；能活化t细胞，促进细胞因子产生；刺激nk细胞增殖，增强nk杀伤活性及产生细胞因子，诱导lak细胞产生；促进b细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。可用于临床研究和肿瘤治疗。
107.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)是造血生长因子之一，它参与造血调节过程。gm-csf在体内体外维持着造血细胞的生存、增殖和分化，并且也影响着成熟粒细胞、单核-巨噬细胞的生物功能。gm-csf临床应用方面发展很快，例如用于恶性肿瘤化疗、骨髓移植、骨髓增生异常综合征、中性粒细胞减少等等。在本技术中涉及的编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(人gm-csf)的人gm-csf cdna的序列如seq id no.6所示
108.巨噬细胞集落刺激因子(mcsf)也称为集落刺激因子-1(csf-1)，是一种具有谱系特异性的细胞因子。m-csf为链间二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，主要存在于骨髓腔内，对单核细胞的增殖、分化及维持其活性有重要作用。其受体为c-fms。
109.组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的mhc被称为hla(human leukocyte antigen，
hla)，即人白细胞抗原；小鼠mhc则被称为h-2。hla位于人的6号染色体短臂上，h-2位于小鼠的17号染色体上。根据基因的位置和功能，主要组织相容性复合体分为三类，分别为mhc class i、mhc class ii、mhc class iii。
110.mhc class i(mhc i)：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病外膜碎片之氨基酸链(peptide)透过mhc提示在细胞外侧，可以供杀手cd8 t细胞等辨识，以进行扑杀。
111.mhc class ii(mhc ii)：大多位于抗原提呈细胞(apc)上，如巨噬细胞等。这类提供则是细胞外部的情况，像是组织中有细菌侵入，则巨噬细胞进行吞食后，把细菌碎片利用mhc提示给辅助t细胞，启动免疫反应。
112.为了使在小鼠体内重建的人类免疫系统更加完善，需要在小鼠体内过表达人细胞因子或者将小鼠细胞因子人源化。本技术提供一种对非人动物，尤其是小鼠，尤其是以nod为遗传背景的小鼠进行基因改造的方法，其包括：对非人动物细胞的受精卵进行基因改造，基因改造包括利用piggy转座酶依赖的转基因系统对非人动物的受精卵进行基因编辑。
113.更具体来说，小鼠是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod、敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠。
114.在本技术一个具体实施方式中，所述非人动物的受精卵是上述重度免疫缺陷nod小鼠的受精卵，尤其是体外受精的受精卵。本技术的结果显示跟b6小鼠比较，nod小鼠体内受精的成胎率差。而体外受精的受精卵比体内受精的受精卵活性强。所以对于nod遗传背景的小鼠体外受精制备受精卵是首选。
115.在本技术一个具体方式中，进行基因改造的受精卵是对体外受精得到的，并且在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上得到的受精卵。研究发现，在体外培养一定时间可以等待细胞核的成熟，有助于对于小鼠的基因改造。
116.在本技术一个具体方式中，对非人动物细胞的受精卵进行基因改造是通过对受精卵的细胞核或细胞质进行注射来完成的。这猜测是由于nod小鼠细胞核不成熟，对于染色体随机整合大片段dna，很难进行要细胞核注射，几率也比较低。在本技术具体的实施方式中，对体外受精得到的，并且在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上得到的受精卵进行细胞核显微注射来完成的。
117.在本技术一个具体方式中，利用piggy转座酶方法，需要进行基因编辑的基因片段为环形质粒，对非人动物的受精卵进行基因编辑是对非人动物细胞的受精卵的细胞质进行细胞浆或细胞核注射。在使用转座酶技术如，piggybac可以以质粒的方式注入细胞质，这增加了成功率。
118.在本文中，原位人源化是指将小鼠基因或基因的一部分在同一基因位置替换成同源的人的基因或者人的基因一部分。
119.在具体的实施方式中，非人动物是以nod为遗传背景的小鼠。具体来说，小鼠是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod、且敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠。
120.在一个具体实施方式中，本技术的方法包括：在非人动物中过表达目标蛋白一和/或目标蛋白二；
121.其中，所述目标蛋白一主要在t细胞、b细胞和nk细胞中表达；所述目标蛋白一的基因原位人源化后，在重度免疫缺陷非人动物中检测不到所述目标蛋白一的基因的表达；
122.所述目标蛋白二可能会影响免疫缺陷非人动物的健康；
123.可能会影响免疫缺陷小鼠的健康的目标蛋白是指人和小鼠之间的同源性较低的目标蛋白，将这些目标蛋白人源化时，会影响免疫缺陷小鼠的健康。例如人和小鼠的同源性在50％以下的细胞因子，优选同源性在40％以下的细胞因子，进一步优选同源性在30％以下的细胞因子，进一步优选同源性在20％以下的细胞因子，进一步优选同源性在10％以下的细胞因子，进一步优选同源性在5％以下的细胞因子。
124.例如，gm-csf对于保持巨噬细胞的成熟和发育至关重要。但是人和小鼠的gm-csf同源性很低，没有交叉活性。当小鼠gm-csf被人源化后，人gm-csf并不能替代小鼠gm-csf的功能。在人源化gm-csf后，小鼠因巨噬细胞的活性降低，而产生肺炎。又如，血小板生成素(tpo)被人源化后，人源化的tpo并不能促进小鼠血小板的生长，因而会导致小鼠得贫血症。对于这类细胞因子需采取过表达策略。
125.在一个具体的实施方式中，所述目标蛋白一包括但不限于以下任意一种或两种：人白细胞介素-3(人il3)、人白细胞介素-2(人il2)；由于il2和il3主要在t细胞表达，免疫缺陷小鼠没有t细胞，因此人源化后，没有细胞因子表达。优选所述目标蛋白一为人白细胞介素-3(人il3)；所述目标蛋白二包括但不限于以下任意一种或两种以上：人血小板生成素(人tpo)、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(人gm-csf)、人巨噬细胞集落刺激因子(人mcsf)；优选所述目标蛋白二为人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(人gm-csf)。
126.在一个具体的实施方式中，在非人动物中过表达目标蛋白一和目标蛋白二。
127.在一个具体的实施方式中，在非人动物中过表达人白细胞介素-3(人il3)和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(人gm-csf)。具体来说，对非人动物进行基因改造的方法是对非人动物的受精卵进行基因改造使得在非人动物中过表达目标蛋白是指在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白，优选利用特异性在髓系细胞表达的启动子来在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白。具体来说，在髓系细胞表达的启动子包括但不限于人cd68启动子、csf1r启动子、cd11c启动子、cx3cr1启动子、langerin/cd207启动子、mmlv ltr启动子、visna virus ltr启动子、dc-stamp启动子、human msr启动子、msr-a启动子、cd4启动子、cd2启动子、iba-aif-1启动子、cd11b启动子、c-fms启动子、scavenger receptor a(sr-a)启动子、lysozyme启动子和mhc class ii启动子(mhc-ii)中等启动子。利用上述启动子在髓系细胞进行表达是因为通常观察到在免疫缺陷小鼠被打入人的造血干细胞之后，在人细胞因子的帮助下会在小鼠体内重建人原化的免疫系统，这时小鼠的髓系细胞会逐渐消失，这样过表达的外源表达基因也会降低或者消失，从而过表达的人的细胞因子不会因持续表达而过度激活已经完全人源化的免疫系统，从而保障小鼠的健康。
128.在一个具体实施方式中，进行基因改造的非人动物是以nod为遗传背景的小鼠，所述小鼠是敲除了重组激活基因1(rag1)或敲除了重组激活基因2(rag2)或scid突变的、缺失了t细胞和b细胞的免疫缺陷nod小鼠，且进一步敲除了il2受体γ链的缺失了nk细胞的重度免疫缺陷nod小鼠。具体来说，非人动物的受精卵是通过体外受精获得的。对所述非人动物
的受精卵进行基因改造之前对体外受精得到的受精卵在体外培养一定时间，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。
129.在一个具体的实施方式中，利用人cd68启动子在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白，即过表达人白细胞介素-3(人il3)和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(人gm-csf)。
130.在一个具体的实施方式中，利用piggybac转座子系统质粒和piggybac转座酶来在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白。
131.在一个具体的实施方式中，在非人动物中过表达两个以上目标蛋白时利用双重自我剪切短肽rakr-gsg-p2a(rakr-gsg-atnfsllkqagdveenpgp)、rakr-gsg-t2a(rakr-gsg-egrgslltcgdveenpgp)、rakr-gsg-e2a(rakr-gsg-qctnyallklagdvesnpgp)或rakr-gsg-f2a(rakr-gsg-vkqtlnfdllklagdvesnpgp)介导不同目标蛋白的过表达，其中，rakr是furin剪切短肽的序列，gsg是linker。具体来说，双重自我剪切短肽为rakr-gsg-p2a，编码双重自我剪切短肽rakr-gsg-p2a的基因的序列如seq id no.4所示。
132.在一个具体的实施方式中，利用piggybac转座子系统质粒来在非人动物的髓系细胞中过表达目标蛋白，在piggybac转座子系统质粒中还插入有bgh polya序列，优选其序列如seq id no.1所示。
133.在一个具体的实施方式中，在piggybac转座子系统质粒中插入有反响重复序列，优选其序列如seq id no.7或seq id no.8所示。其中适合插入piggybac 5’端的itr的如seq id no.7所示，适合插入piggybac 3’端的itr的如seq id no.8所示。
134.在一个具体的实施方式中，对所述非人动物的受精卵进行基因改造是对受精卵的细胞质进行胞浆或细胞核注射，胞浆或细胞核注射的物质包括：piggybac转座子系统质粒和piggybac转座酶。其中，piggybac转座子系统质粒包括seq id no.2所示的序列。
135.在本技术中，还涉及一种构建重度免疫缺陷的动物模型的方法，该方法包括：在非人动物中过表达目标蛋白，所述目标蛋白为目标蛋白一和/或目标蛋白二；其中，所述目标蛋白一主要在t细胞、b细胞和nk细胞中表达；所述目标蛋白二可能会影响免疫缺陷小鼠的健康。具体来说，其中涉及的内容可以上述针对本技术所描述的全部内容。
136.本技术还涉及一种piggybac转座子系统质粒，其序列如seq id no.2所示。
137.为了使在小鼠体内重建的人类免疫系统更加完善，需要在小鼠体内过表达人细胞因子或者将小鼠细胞因子人源化。
138.对于与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子，在nod scid il2rγko小鼠中保留其本身的鼠源il-3和gm-csf，同时探索如何适度表达人il3和gm-csf成为优化的选择。
139.本技术用piggybac技术，在nod scid il2rγko小鼠巨噬细胞过表达单拷贝的人il3和人gm-csf。过表达的人il3和人gm-csf可以支持nod scid il2rγko小鼠重建人髓系细胞，进而也可提高人t细胞和b细胞的生长成熟。另外，由于使用了组织特异性启动子，这些细胞因子会局限在小鼠髓系细胞表达。在小鼠免疫系统完全人源化的时候，小鼠髓系细胞会被人免疫细胞替换掉，所以小鼠体内过表达的外源人il3和gm-csf会随着人免疫系统的成熟而逐渐减少。这时免疫系统人源化小鼠体内检测到的人il3和人gm-csf主要来自于人免疫系统的t细胞和巨噬细胞。这样的设计即提供了必要的人细胞因子支持人免疫系统
在小鼠体内的成熟，又不会使过表达的外源人细胞因子过度激活成熟后的人免疫系统，从而影响小鼠的健康和以后的功能分析。类似的设计也可用于在小鼠体内过表达跟重建人天然免疫相关的细胞因子，如g-mcsf，tpo，m-csf等。
140.本技术通过优化的显微注射方法直接对nod scid il2rγko小鼠的受精卵进行基因修饰，得到过表达il3/gmcsf双转基因的重度免疫缺陷型小鼠。
141.本技术利用piggybac转基因技术和优化的受精卵显微注射技术直接在nod scid il2rγko小鼠过表达人il3和人gm-csf，节省了小鼠开发的时间。本技术利用了人cd68启动子将人细胞因子在小鼠的髓系细胞过表达。因为在重度免疫缺陷型小鼠重建人免疫系统的过程，小鼠内源的髓系细胞会逐渐被人免疫细胞替代，所以在髓系细胞表达的外源细胞因子随着人免疫系统重建水平的增高而降低。这种设计的优点即可加快人免疫系统的重建速度，也可以避免随后过度激活人免疫系统导致的小鼠寿命的降低。
142.过表达的人il3和人gmcsf的nod scid il2rγko小鼠，即nod scid il2rγko tg(hil3/hgmcsf)小鼠，其优势除了可直接在重度免疫系统小鼠进行基因修饰外，还限制这些细胞因子在小鼠髓系细胞表达。因为小鼠髓系细胞在小鼠免疫系统人源化后会逐渐消失，过表达的人细胞因子也会随着小鼠髓系细胞的减少而降低，所以可以避免过表达人细胞因子给小鼠人源化的免疫系统带来的基因毒性。
143.经过优化的重度免疫缺陷小鼠在用于重建人免疫系统的过程中，其表达人细胞因子的内源髓系细胞会逐渐被外源的人免疫细胞替代，从而一方面加快人免疫系统的重建速度，另一方面避免随后过度激活人免疫系统导致的小鼠寿命的降低。
144.本技术使用的转基因方法与直接将小鼠自身同源基因人源化的方法相比较，优点在于本技术既可以保留小鼠同源基因的活性，也可以得到表达水平多样的转基因小鼠。外源基因不同的表达水平会赋予转基因小鼠不同的功能。为了同时表达多个细胞因子，本技术中还使用了furin(rark)-gsg-p2a双重自我剪切短肽介导人il3和gm-csf的共表达。除furin-gsg-p2a以外，其他与furin-gsg-p2a功能类似的自我剪切肽也可以达到本技术中类似的效果。本技术还利用了hcd68将细胞因子表达在小鼠的髓系细胞。在髓系细胞表达人细胞因子的优点在于可以减少基因毒性，减少过量外源细胞因子对人免疫系统的过度激活。本技术还有助于表达其他与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子，例如：人tpo、m-csf等。
145.实施例
146.实施例1在nod scid il2rγko小鼠表达外源基因：人il3和人gm-csf
147.1.piggybac重组质粒(piggy hcd68-gmcsf/il3)的构建
148.本技术利用piggy转座酶依赖的转基因系统在小鼠过表达人gm-csf和人il3。因piggybac转座酶倾向于将目的片段插入到转录活跃的区域，所以将大大提高获得阳性表达的转基因小鼠的几率。
149.为使基因过表达仅发生于在小鼠的单核细胞等髓系细胞，载体使用了3.1kb的人的cd68的启动子。为了同时表达不同的靶标基因，载体利用双重自我剪切短肽rakr-gsg-p2a，连接人il3和人gm-csf基因。
150.在表达原件hcd68pro-intron-hgm-csf-pakr-gsg-p2a-hil3-pa的两侧设计了piggy转座酶依赖的反响向重复序列(itr)。利用基因合成和经典分子克隆技术将含有itr
序列的表达元件克隆到pbr322载体(sigma，cata:10481238001)。重组质粒设计原理见图1。重组插入序列见seq id no.2所示。为了显示在重建人免疫系统的过程中，本技术与现有技术的优势，发明人将前述表达原件中的人cd68启动子替换为通用的sv40启动子(seq id no.3)构建了作为对照的piggybac载体(piggy sv40-gmcsf/il3)，其它重组元件不变。
151.2.小鼠受精卵的制备和显微注射
152.nod scid il2rγko小鼠(实验组)和c57bl小鼠(对照组)作为精子及卵子的供体。cd1小鼠为假孕母鼠。nod scid il2rγko小鼠源自nod scid小鼠为购自上海南方模型的m-nsg小鼠，其为利用crispr/cas9技术敲除了il2rγ基因第四到第八个外显子得到的重度免疫缺陷小鼠，将其命名为nvg小鼠。
153.3.受精
154.自然受精(nature mating)制备受精卵:选择雌鼠注射pmsg，46h～48h后注射人绒毛膜促性腺激素hcg(sigma chemical inc.，cat.no.cg10-1vl)，注射后即与正常雄鼠按照1:1合笼。第2天，断颈处死成栓受精卵供体鼠，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶～0.3mg/m2液(sigma chemical，cata:m7167)中。显微镜下，仔细观察放在透明质酸酶m2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入m2液中洗涤，最后放在m16液(sigma chemical，cat.no.m7292)中放入5％co2，37℃培养箱培养。在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，细胞核清晰可见的受精卵待用。
155.体外受精(ivf)制备受精卵:按照常规操作促排卵，选择适龄雌鼠(6周)注射孕马血清促性腺激素(pmsg(sigma chemical inc.，cat.no.g4877-2000iu))，46h～48h后注射hcg，第二天检验阴道成栓。收集精子：将符合要求的性成熟(8周以上)的雄鼠颈椎脱臼处死，取出附睾上体尾部，去除脂肪与血迹后，置于htf液(millipore，cata:mr-070-d)内。利用眼科剪在液滴内横断附睾尾，当精子充分游离出附睾尾后，将组织从液滴内取出，将培养皿置于培养箱。处死超排后的雌鼠，取出两侧的输卵管，用显微镊将卵母细胞团拨到受精滴中。用10μl移液器从精子滴吸取精子，加到卵子滴中，根据卵团大小情况以及精子的活力每滴加8μl左右的精子。将精卵混合后，最后放在m16液中放入5％co2，37℃培养箱培养。
156.4.piggybac转基因操作
157.将nod scid il2rγko小鼠作为精子和卵子的供体。cd1小鼠为假孕母鼠。以上小鼠均购自上海南方模式生物公司。使用显微注射将携带有外源基因的piggybac转座子系统质粒(piggy hcd68-gmcsf/il3或piggy sv40-gmcsf/il3)与piggybac转座酶mrna(上海南方模式)共同通过胞浆注射法注入体外受精卵或体内受精卵，注射时机为体外受精完成后16～18h。注射时，piggybac转座子系统质粒的浓度为50ng/μl，piggybac转座酶mrna(上海南方模式)50ng/μl，注射体积为15pl。当针穿透卵质膜后，控制注射针将dna注入胞浆内。注射受精卵同一天，用移卵针吸取约20枚受精卵植入见栓假孕雌鼠的输卵管壶腹部。然后将卵巢和输卵管送回假孕鼠体内，缝合伤口。
158.5.f0代转基因小鼠基因型和表型的测定
159.5.1pcr基因型鉴定
160.注射后20天左右出生的小鼠为首建鼠(f0代小鼠)。通过pcr方法对其进行基因型鉴定。设计引物进行pcr后，鉴定到阳性小鼠。引物序列如表1所示：
161.表1
162.引物序列5'
‑‑
》3'引物类型vgcggggcagcctcaccaa(seq id no.13)正向viaattcattccagtcaccgtcctt(seq id no.14)反向
163.按照经典分子生物学的方法鉴定阳性pcr条带，大小为639bp。pcr鉴定电泳结果如图2所示。其中3、4、5、6、10为f0代nod scid il2rγko-tg(hcd68-hil3/gmcsf)小鼠，12、13、14为f0代nod scid il2rγko-tg(sv40-hil3/gmcsf)小鼠。
164.5.2f0代转基因鼠基因组插入位点的鉴定
165.为了鉴定外源基因在小鼠基因组的插入位置，采用反向pcr鉴定插入基因两侧的基因序列。反向pcr参见经典分子生物学方法和试剂盒说明书。以zymo research的dna提取试剂盒(catalog#d3024)提取小鼠尾巴的基因组dna。随后，基因组被dpnii限制性内切酶(neb biolabs，catalog#r0543s)酶切3hr后，80℃20分钟灭活内切酶。酶切产物用t4连接酶(enzymatics，catalog#l6030-lc-l)进行环化链接1个小时，然后放入-20℃冰箱终止反应。建立嵌套pcr反应，扩增插入基因两侧的基因组dna。dna聚合酶选用phusion dna polymerase(neb biolabs，catalog#m0530s)。扩增引物如表2所示：
166.表2
167.引物序列5'
‑‑
》3'引物类型viigctctatggcttctgtttgt(seq id no.15)正向_1
st
viiigataaaacacatgcgtcaattt(seq id no.16)正向_2
nd
ixccaatcctcccccttgctgtcc(seq id no.17)反向_1
st
xaaacaacagatggctggcaacta(seq id no.18)反向_2
nd
xigtaaaacgacggccag(seq id no.19)m13正向
168.其中引物vii和ix用于扩增第一轮的连接产物，引物viii和引物x用于扩增第一轮的pcr产物。反向pcr原理(图3)和第二次pcr扩展电泳结果(图4)如图所示。第二轮pcr产物克隆到puc18质粒，用m13正向通用引物(xi)测序克隆产物。测序结果在ncbi网站进行序列比对。经过序列比对，各转基因鼠插入位置如表3所示。结果显示，使用piggybac转基因方法，多个小鼠存在多个转基因插入位点，且位于已知基因的内部。但是有些小鼠的插入位点为功能未知区域。
169.表3 f0代piggybac转基因小鼠基因组插入位置分析
[0170][0171]
5.3转基因鼠细胞因子表达水平的测定
[0172]
由于部分f0代小鼠有多个插入位点，因此利用pcr引物筛选出插入位点不在已知功能基因内部的转基因小鼠。侧交f0代小鼠，在f2代筛选获得下列小鼠：sv40-12-6，sv40-14-x，cd68-6-13，cd68-10-12。检测血清中人细胞因子的表达水平。从各筛选出的小鼠眼眶静脉取抗凝血，离心制备血清。分别使用human il-3quantikine elisa kit(r&d systems，catalog#d3000)和human gm-csf quantikine elisa kit(r&d systems，catalog#dgm00)检测f2代小鼠血清细胞因子表达量。检测结果见表4。实验证明，不同的转基因小鼠系，插入位点不同，细胞因子表达量不同。将获得的cd68-10-12小鼠命名为nvg-hcd68-10-12小鼠，将获得的sv40-14-x小鼠命名为nvg-sv40-14-x小鼠。
[0173]
表4人il3和人gm-csf在小鼠血清的表达水平
[0174]
f2代小鼠基因组插入位置(grcm38)hil3(pg/ml)hgm-csf(pg/ml)wt小鼠n/a1.5
±
0.61.5
±
0.6sv40-12-6chr6:51，053，900-51，054，904312
±
74533
±
91sv40-14-xchrx:126586507-126585891112
±
34212
±
42cd68-6-13chr13:51083363-5108346035
±
729
±
4cd68-10-12chr6:51，053，900-51，054，904195
±
26245
±
42
[0175]
5.4人细胞因子组织特异性表达鉴定
[0176]
转基因小鼠分别选用人cd68启动子和sv40启动子表达人il3和人gm-csf细胞因子。为了鉴定这些启动子驱动的细胞因子表达的组织特异性，用real-time rt-pcr分别检测人il3和内源gapdh在不同组织(骨髓，肌肉，肺，肾脏和脾脏)的mrna的丰度。具体方案如
下：以trizol(thermofisher，catalog#15596026)提取小鼠骨髓，肌肉，肺，肾脏和脾脏的rna。以primescript rt master mix(takara，catalog#rr036a)反转录mrna成cdna。用tb qpcr premix(takara，catalog#639676)对cdna进行realtime pcr反应。人il3 cdna的扩增引物选自sinobiological(catalog#hp104624)，鼠源gapdh cdna的扩增引物购自sinobiological(catalog#mp200537)。人il3 mrna相对于鼠gapdh mrna的相对量用2-δδct
公式计算。从结果显示，nod scid il2rγko tg(sv40-il3/gm-csf)(表示以sv40启动子表达人il3和人gmcsf)小鼠在多种组织表达高丰度的il-3mrna，而nod scid il2rγko tg(hcd68-il3/gm-csf)(表示以人cd68启动子表达人il3和人gmcsf)只是在髓系细胞富集的组织，如肺，脾脏，骨髓，表达高丰度的il3 mrna，而在肌肉和肾脏的表达量很少(如图5所示)。
[0177]
实施例2
[0178]
分别向nvg小鼠(对照组)、对实施例1获得的nvg-hcd68-10-12小鼠(实验组1)和nvg-sv40-14-x小鼠(实验组2)进行全身γ照射(175cgy)，以降低鼠源免疫系统的活性，照射24小时后注射10万个个人cd34干细胞，12周后，检测人免疫系统在各对照组和实验组小鼠体内的表型，测定结果如图6(a)～(d)所示，在注射人cd34干细胞后，人淋巴细胞、人cd3t细胞、人cd33髓系来源细胞在实验组nvg-hcd68-10-12小鼠和nvg-sv40-14-x小鼠血液中的频率显著高于其在对照组nvg小鼠血液中的频率。
[0179]
如图7所示，nvg-sv40-14-x小鼠在注射cd34干细胞120天后存活率骤降，约160天后存活率仅为10％；nvg-hcd68-10-12小鼠在130天左右存活率降低至80％且没有继续降低；nvg小鼠的存活率没有变化。
[0180]
注射人cd34干细胞第12周后，通过elisa方法测定对照组和实验组小鼠血浆中hgmcsf和hil3的平均表达水平，测定结果如图8所示，nvg小鼠体内，hgmcsf平均血浆表达浓度为0，hil3平均血浆表达浓度约为0；nvg-sv40-14-x小鼠体内，hgmcsf平均血浆表达浓度约为200pg/ml，hil3平均血浆表达浓度约为150pg/ml；nvg-hcd68-10-12小鼠体内，hgmcsf平均血浆表达浓度约为25pg/ml，hil3平均血浆表达浓度约为25pg/ml。
[0181]
注射cd34干细胞8周后和16周后，分别测定对照组和实验组小鼠体内的血红蛋白数，结果如图9所示，注射16周后，nvg-sv40-14-x小鼠小鼠血细胞数目的减少最为明显，其次为nvg-hcd68-10-12小鼠，最后为nvg小鼠。
[0182]
以上各实验结果表明，持续过表达的人细胞因子也会过度激活人源化的免疫系统，如nvg-sv40-14-x小鼠使用sv40启动子持续过表达gm-csf和il3，有可能会过度激活人的巨噬细胞，从而引起小鼠血细胞数目的减少，小鼠的生存率受到影响。使用hcd68启动子，可以局限人细胞因子在小鼠淋巴细胞(mcd45)表达。在小鼠免疫系统人源化后，小鼠的淋巴细胞得到了减少，因此，过表达的人细胞因子浓度也大为减少。从而避免人细胞因子过度激活人免疫系统。
[0183]
本技术使用的是piggybac技术在nod scid il2rγko表达人il3和人gm-csf。由于实验采用了优化的体外受精和显微注射条件，因此其它具有类似性质的转基因技术，例如tol2、sleep beauty等转座酶依赖的转基因技术，也可在nod scid il2rγko遗传背景的小鼠中使用，以达到与本实施例中相似的发明效果。然而，跟其他转基因技术比较，piggybac转基因技术的优点是只需要向细胞浆注射环状质粒，而不需要向细胞核注射线性dna，从而
提高了受精卵的生殖活性。piggybac转基因技术还可将大片段外源基因以单拷贝的形式整合到高转录活性区域，保证了外源基因的表达率。因此本技术优选地使用piggybac转基因技术。
[0184]
本技术使用的转基因方法与直接将小鼠自身同源基因人源化的方法相比较，优点在于本技术既可以保留小鼠同源基因的活性，也可以得到表达水平多样的转基因小鼠。外源基因不同的表达水平会赋予转基因小鼠不同的功能。为了同时表达多个细胞因子，本实施例中还使用了furin(rark)-gsg-p2a双重自我剪切短肽介导人il3和人gm-csf的共表达。除furin-gsg-p2a以外，其他与furin-gsg-p2a功能类似的自我剪切肽也可以达到本技术中类似的效果。本实施例还利用了hcd68将细胞因子表达在小鼠的髓系细胞。在髓系细胞表达人细胞因子的优点在于可以减少基因毒性，减少过量外源细胞因子对人免疫系统的过度激活。本技术还有助于表达其他与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子，例如：人tpo，m-csf等。
[0185]
工业实用性
[0186]
利用本技术所述方法可以更高效便捷地构建表达人细胞因子的重度免疫缺陷小鼠，节省人力物力成本。并且，利用本技术所述方法构建的小鼠更加利于人类免疫系统及其组成部分的定植和发挥功能，为免疫学相关动物试验提供更加优质的实验材料。例如，用于检测人类造血干细胞及基于人类造血干细胞的治疗细胞的分化和定植功能；模拟人类免疫系统及肿瘤免疫微环境，在抗体药物、细胞免疫药物等的开发，传染性疾病、自身免疫病以及肿瘤学研究等多个领域发挥重要作用。
[0187]
序列表
[0188]
bgh polya序列(seq id no.1)
[0189]
ctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctgggga
[0190]
itr-hcd68pro-intron-hgm-csf-pakr-gsg-p2a-hil3-pa-itr重组元件序列(seq id no.2)，
[0191]
其包括piggybac依赖itr序列(小写斜体)，hcd68启动子和内含子插入序列(大写)，人gm-csf和人il3cdna序列(大写黑体)，双重自剪切短肽pakr-gsg-p2a(小写下横线)，pgh polya(小写黑体下划线)
[0192]
seq id no.2：
[0193]
[0194][0195]
sv40启动子序列(seq id no.3)：
[0196]
tgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatcgctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaa
[0197]
rakr-gsg-p2a的基因序列(seq id no.4)
[0198]
gtgccaagcgaggctccggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtccc
[0199]
人il3cdna的基因序列(seq id no.5)
[0200]
atgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatctctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggag
[0201]
人gmcsfcdna的序列(seq id no.6)
[0202]
atgagccgcctgcccgtcctgctcctgctccaactcctggtccgccccggactccaagctcccatgacccagacaacgcccttgaagacaagctgggttaactgctctaacatgatcgatgaaattataacacacttaaagcagccacctttgcctttgctggacttcaacaacctcaatggggaagaccaagacattctgatggaaaataaccttcgaaggccaaacctggaggcattcaacagggctgtcaagagtttacagaacgcatcagcaattgagagcattcttaaaaatctc
ctgccatgtctgcccctggccacggccgcacccacgcgacatccaatccatatcaaggacggtgactggaatgaattccggaggaaactgacgttctatctgaaaacccttgagaatgcgcaggctcaacagacgactttgagcctcgcgatcttttga
[0203]
piggybac依赖itr序列
[0204]
适合插入piggybac 5’端的itr:(seq id no.7)
[0205]
ttaaccctagaaagatagtctgcgtaaaattgacgcatgcattcttgaaatattgctctctctttctaaatagcgcgaatccgtcgctgtgcatttaggacatctcagtcgccgcttggagctcccgtgaggcgtgcttgtcaatgcggtaagtgtcactgattttgaactataacgaccgcgtgagtcaaaatgacgcatgattatcttttacgtgacttttaagatttaactcatacgataattatattgttatttcatgttctacttacgtgataacttattatatatatattttcttgttatagatatc
[0206]
适合插入piggybac 3’端的itr:(seq id no.8)
[0207]
tttgttactttatagaagaaattttgagtttttgtttttttttaataaataaataaacataaataaattgtttgttgaatttattattagtatgtaagtgtaaatataataaaacttaatatctattcaaattaataaataaacctcgatatacagaccgataaaacacatgcgtcaattttacgcatgattatctttaacgtacgtcacaatatgattatctttctagggttaa
[0208]
p2a的氨基酸序列(seq id no.9)
[0209]
atnfsllkqagdveenpgp
[0210]
t2a的氨基酸序列(seq id no.10)
[0211]
egrgslltcgdveenpgp
[0212]
e2a的氨基酸序列(seq id no.11)
[0213]
qctnyallklagdvesnpgp
[0214]
f2a的氨基酸序列(seq id no.12)
[0215]
vkqtlnfdllklagdvesnpgp
[0216]
引物v(seq id no.13)
[0217]
gcggggcagcctcaccaa
[0218]
引物vi(seq id no.14)
[0219]
aattcattccagtcaccgtcctt
[0220]
引物vii(seq id no.15)
[0221]
gctctatggcttctgtttgt
[0222]
引物viii(seq id no.16)
[0223]
gataaaacacatgcgtcaattt
[0224]
引物ix(seq id no.17)
[0225]
ccaatcctcccccttgctgtcc
[0226]
引物x(seq id no.18)
[0227]
aaacaacagatggctggcaacta
[0228]
引物xi(seq id no.19)
[0229]
gtaaaacgacggccag