一种酵母来源的副猪嗜血杆菌hps06257蛋白亚单位疫苗制备方法及应用技术背景1.本发明属于动物医药领域，具体涉及一种酵母来源的副猪嗜血杆菌hps06257蛋白亚单位疫苗制备方法及应用。2.
背景技术：
：：3.副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis,hps)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide,nad)依赖的非运动、多形态、有荚膜的革兰氏阴性小杆菌，为猪的上呼吸道常驻菌，在特定条件下如应激、免疫力低下和混合感染时，毒力菌株可以侵入宿主深部组织引起严重的革拉瑟氏病，引起猪全身性炎症反应，主要表现为急性渗出性纤维素炎、多发性纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等，多见于断奶前后和仔猪阶段[1,2]。该菌已报道至少有15种血清型，各菌株间毒力差距较大，不同国家和地区的流行的优势血清型也不尽相同。血清型调查表明国内外流行的的血清型主要是5型、4型等毒力较强的血清型[3-7]。近年来养猪生产的日益规模化、集约化，养猪生产方式的改变给该病的发展和传播提供了便利。加之常常与常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒、链球菌、大肠杆菌等混合感染，使得副猪嗜血杆菌成为保育仔猪死亡的主要原因，给全球的养猪业带来了巨大损失[8-10]。[0004]临床上副猪嗜血杆菌病的防控主要还是依赖灭活疫苗和抗菌药物，传统灭活疫苗因各血清型间有限的交叉保护，需结合当地的菌株血清型流行情况使用方能取得良好效果，难以达到广谱保护。且存在生物安全风险、副反应较大等问题，限制了其推广应用。亚单位疫苗，安全性好，稳定性高已逐渐成为疫苗开发的重点方向，加之近年来滥用抗生素造成的危害繁多，因此亟需开发优质的副猪嗜血杆菌亚单位疫苗以预防和控制革拉瑟氏病的爆发。[0005]目前国内外已报道了大量h.parasuis的亚单位疫苗，如荚膜、菌毛、外膜蛋白、脂多糖、转铁蛋白等。在早期研究中，我们发现了副猪嗜血杆菌转铁蛋白hps06257可作为候选的免疫原用于副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的制备，该疫苗在小鼠水平上的安全性及有效性都得到了试验肯定[11]。该疫苗采用大肠杆菌bl21表达，大肠杆菌是革兰氏阴性菌，在生长期和稳定期以及细菌死亡崩解时会释放出内毒素[12]。内毒素对猪可产生广泛的损害，包括发热、败血性休克、厌食、炎症反应、组织损伤及生产性能下降[13]。在使用过程中若残留内毒素含量控制不当极易引起不良反应。且大肠杆菌表达体系，表达外源蛋白的游离质粒也存在丢失的可能。[0006]巴氏毕赤酵母(pichiapastoris)是1969年由ogata等首次发现的，并于20世纪80年代迅速发展为一个新兴的表达系统，被广泛用于外源基因的表达[14]。在酵母表达系统中，由于酵母体内不存在天然质粒，目的基因是以整合的方式进入酵母基因组中进行表达的，避免了表达质粒以游离的形式存在时被酵母降解的风险。在毕赤酵母表达体系中要设计一个最优的外源蛋白表达体系包含许多关键的步骤：如(1)选择具有适当的折叠和翻译后修饰功能的宿主菌；(2)选择一个合适的载体(附加型或整合型)、启动子(组成型、诱导型或阻遏型)和选择性标记；(3)对基因进行密码子优化；(4)如果要对蛋白进行亲和纯化或检测核糖体蛋白的活性，则需要加上表位标签；(5)选择信号肽使核糖体蛋白靶向性的由胞内释放到胞外的介质中；(6)优化发酵条件等[15]。[0007]密码子偏好性优化策略是目前最常用的密码子优化策略，主要是将供体密码子与宿主基因组中具有最高频率的同义密码子进行替换，利用宿主中最丰富的密码子来编码优化序列中的氨基酸[16]。密码子偏好性对蛋白的表达有着直接的影响，能通过trna在翻译水平上改变蛋白的翻译速度[17]。但也有部分实验结果表明，利用密码子偏好性的优化策略来进行蛋白表达时，非但没有增加蛋白的表达含量，反而使蛋白的含量降低[18]。因此需结合实际情况进行密码子优化序列的选择。[0008]另外虽然都属于酵母菌，但针对相同的根据酵母菌密码子优化后的序列依然存在表达量的显著性差异(cn2014108403710)，因此，可以看到，蛋白表达量至少受到密码子优化和菌株选择的影响，需要二者之间达到很好的兼容蛋白表达量才能有显著提高。[0009]参考文献：[0010]1.蔡旭旺,etal.,副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定.华中农业大学学报,2005(01):p.55-58.[0011]2.周雪,etal.,副猪嗜血杆菌的培养及流行血清型鉴定.黑龙江畜牧兽医,2012(11):p.111-112.[0012]3.morikoshi,t.,etal.,characterizationofhaemophilusparasuisisolatedinjapan.nihonjuigakuzasshi,1990.52(3):p.667-9.[0013]4.kielstein,p.andv.j.rapp-gabrielson,designationof15serovarsofhaemophilusparasuisonthebasisofimmunodiffusionusingheat-stableantigenextracts.jclinmicrobiol,1992.30(4):p.862-5.[0014]5.rubies,x.,etal.,prevalenceofhaemophilusparasuisserovarsisolatedinspainfrom1993to1997.vetmicrobiol,1999.66(3):p.245-8.[0015]6.rafiee,m.andp.j.blackall,establishment,validationanduseofthekielstein-rapp-gabrielsonserotypingschemeforhaemophilusparasuis.austvetj,2000.78(3):p.172-4.[0016]7.cai,x.,etal.,serologicalcharacterizationofhaemophilusparasuisisolatesfromchina.vetmicrobiol,2005.111(3-4):p.231-6.[0017]8.zhang,b.,etal.,updateonthepathogenesisofhaemophilusparasuisinfectionandvirulencefactors.vetmicrobiol,2014.168(1):p.1-7.[0018]9.黄润标,etal.,副猪嗜血杆菌的流行病学及预防保护研究进展.广东农业科学,2010.37(08):p.175-177.[0019]10.张昆丽and李春玲,副猪嗜血杆菌病研究进展.广东农业科学,2020.47(12):p.166-174.[0020]11.zhou,m.,etal.,identificationandcharacterizationofnovelimmunogenicoutermembraneproteinsofhaemophilusparasuisserovar5.vaccine,2009.27(38):p.5271-7.[0021]12.wells,j.e.andj.b.russell,theeffectofgrowthandstarvationonthelysisoftheruminalcellulolyticbacteriumfibrobactersuccinogenes.applenvironmicrobiol,1996.62(4):p.1342-6.[0022]13webel,d.m.,etal.,timecourseofincreasedplasmacytokines,cortisol,andureanitrogeninpigsfollowingintraperitonealinjectionoflipopolysaccharide.janimsci,1997.75(6):p.1514-20.[0023]14.siegel,r.s.andr.a.brierley,methylotrophicyeastpichiapastorisproducedinhigh-cell-densityfermentationswithhighcellyieldsasvehicleforrecombinantproteinproduction.biotechnolbioeng,1989.34(3):p.403-4.[0024]15.田晓娟,酵母表达系统研究概述.陇东学院学报,2018.29(01):p.72-76.[0025]16.villalobos,a.,etal.,genedesigner:asyntheticbiologytoolforconstructingartificialdnasegments.bmcbioinformatics,2006.7:p.285.[0026]17.sabi,r.andt.tuller,modellingtheefficiencyofcodon-trnainteractionsbasedoncodonusagebias.dnares,2014.21(5):p.511-26.[0027]18.zhu,d.,etal.,comparisonoftwocodonoptimizationstrategiesenhancingrecombinantsusscrofalysozymeproductioninpichiapastoris.cellmolbiol(noisy-le-grand),2015.61(2):p.43-9.技术实现要素：[0028]本发明的目的在于提供了一种酵母来源的副猪嗜血杆菌hps06257蛋白亚单位疫苗制备方法，方法简单，可大批量的对该蛋白进行制备，适合工业化生产。[0029]本发明的另一个目的在于提供了上述方法制备副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：[0030]一种酵母来源的副猪嗜血杆菌hps06257蛋白亚单位疫苗制备方法，包括将seqidno.1所示基因插入表达载体pgapzaa中，转化毕赤酵母(pichiapastoris)x33中进行表达。[0031]本发明的保护范围还包括上述方法制备的副猪嗜血杆菌病亚单位蛋白在制备疫苗中的应用。[0032]与现有技术相比，本发明具有以下优点：[0033]1.本技术使用的毕赤酵母真核表达体系，所表达的hps06257蛋白经过密码子优化，目的蛋白结构与功能与天然状态完全一致，更易于在毕赤酵母表达系统中翻译和合成。[0034]2.本技术中，利用毕赤酵母组成型表达系统分泌表达副猪嗜血杆菌的hps06257蛋白，蛋白产量高，纯度高，制备工艺简单，无内毒素，安全性更高。附图说明[0035]图1为重组表达载体pgapzaa-06257-1双酶切鉴定图。[0036]图2为酵母来源副猪嗜血杆菌蛋白hps06257(a)特性鉴定和(b)免疫原性鉴定。[0037]图3为副猪嗜血杆菌蛋白hps06257亚单位疫苗的免疫攻菌保护结果。[0038]图4为副猪嗜血杆菌蛋白hps06257亚单位疫苗的抗体消长结果。具体实施方式[0039]本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。[0040]申请人前期对不同组成型表达载体，不同酵母菌的目的蛋白的表达的影响进行了探索，申请人针对酵母菌的特点，针对相同的外源基因，获得优化密码子的基因序列，将该外源基因转入不同的酵母表达载体中，以电转法转化至gs115、smd1168、km71和x33酵母中进行表达，并对不同表达载体-宿主表达体系的表达量差异进行比较，发现表达载体pgapzaa与各酵母菌兼容性最好。因此，申请人根据不同酵母菌进一步对密码子进行优化，利用表达载体pgapzaa进行表达量的探索。[0041]实施例1:[0042]一种酵母来源的副猪嗜血杆菌hps06257蛋白亚单位疫苗制备方法，包括下述步骤：[0043](一)、重组表达载体pgapzaa-06257的构建[0044]1.获取目的基因06257[0045]参照副猪嗜血杆菌血清5型sh0165株蛋白06257基因序列，根据酵母密码子的偏爱性，人工合成711bp的三条06257orf，分别命名为06257orf-1(seqidno.1)、06257orf-2(seqidno.2)、06257orf-3(seqidno.3)。优化后的序列均在羧基端引入6*his标签肽序列，为目的蛋白的亲和纯化奠定基础。合成的目的基因06257orf置于质粒载体puc-18(invitrogen公司)上，即以puc-18-06257的形式取得，分别为puc-18-06257-1，puc-18‑ꢀ06257-2，puc-18-06257-3。[0046]2.构建重组表达载体pgapzaa-06257-1、pgapzaa-06257-2和pgapzaa-06257-3[0047]以06257orf-1(seqidno.1)序列构建重组表达载体pgapzaa-06257-1为例进行说明，具体的重组表达载体构建过程如下：[0048]①酶切：本技术采用xhoi、noti两个限制性内切酶(购自takara)酶切位点，对人工合成基因06257-1从puc-18-06257-1上进行双酶切；同时用相同的限制性内切酶对表达载体pgapzaa进行酶切。体系如下：[0049][0050]酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。[0051]②连接：[0052][0053][0054]③转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态dh10b中，涂博来霉素抗性平板。[0055]④提取重组质粒pgapzaa-06257-1：从平板上挑取单克隆菌落于博来霉素抗性培养基37度培养,过夜培养菌液采用质粒抽提试剂盒提取质粒，酶切鉴定结果见图1。[0056]根据上述方法成功构建重组质粒pgapzaa-06257-2和pgapzaa-06257-3。[0057](二)、转化酵母感受态细胞[0058]将上述重组质粒pgapzaa-06257-1，pgapzaa-06257-2，pgapzaa-06257-3分别转入毕赤酵母表达菌株gs115、smd1168、km71和x33中，对阳性酵母重组子在200ml摇瓶发酵水平进行蛋白表达量差异比较。[0059]以重组质粒pgapzaa-06257-1转化毕赤酵母x33为例，具体的毕赤酵母转化过程如下：[0060]将10ug经限制性内切酶avrii线性化的重组表达载体pgapzaa-06257-1加入一支x33酵母感受态中，轻弹管壁混匀，转移至电转杯中，置于冰上孵育5min。冰浴后将电转杯杯壁上水分充分擦干，按照invitrogen公司毕赤酵母电转化指导方法进行电转，电转后迅速加入1ml预冷的1m山梨醇轻柔地吹打混匀，于30℃静置2h。取200ul静置后菌悬液涂布于博来霉素抗性的ypd平板板上，30℃倒置培养3天。[0061](三)、酵母重组子的小量表达鉴定[0062]在博来霉素抗性筛选板上挑取若干重组酵母菌接种于3mlypd培养基中，30℃培养2d(250rpm)。离心取上清样在12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至pvdf膜上，用实验室制备hps06257蛋白猪阳性血清和羊抗猪-igg-hrp分别作为一抗和二抗进行westernblot检测。[0063](四)、副猪嗜血杆菌重组蛋白hps06257的表达与纯化[0064]取上步鉴定的阳性重组子接种于3mlypd培养基中，30℃培养1d(250rpm)后按照1:100的转接比例接种于200mlypd培养基中，30℃培养2d(250rpm)，离心取上清。[0065]纯化方法采用常规镍柱亲和层析法。具体操作步骤如下：表达hps06257重组酵母菌离心上清，用0.45um的滤膜过滤除去细小杂质；过滤后的上清与经平衡后的镍柱进行结合过柱；洗杂缓冲液(40mm咪唑，20mmtris，200mmnacl)过柱洗杂；洗脱缓冲液(250mm咪唑，20mmtris，200mmnacl)过柱洗脱；洗脱液用透析缓冲液(20mmtris，200mmnacl)置于4℃透析过夜，得到目的蛋白。对纯化蛋白进行sds-page和westernblot检测。检测结果见图2。[0066]在上述重组质粒pgapzaa-06257-1，pgapzaa-06257-2，pgapzaa-06257-3与酵母表达菌株gs115、smd1168、km71和x33中的载体-宿主组合中，各选一阳性酵母重组子在200ml摇瓶发酵水平进行蛋白表达量差异比较，当用等量毕赤酵母菌体以等量体积发酵时，不同载体-宿主组合中，pgapzaa-06257-1转化重组菌x33中目的蛋白hps06257表达量更高，每升发酵液能得到的目的蛋白hps06257纯化量为50mg。能被副猪嗜血杆菌阳性血清识别，具有免疫原性。相较于实验室前期大肠杆菌表达的06257[11]单位纯化量的42mg/l提高了19％。其他载体-宿主组合中表达蛋白也具有免疫原性，但在等量重组酵母同等发酵条件下获得目的蛋白含量低于均低于40mg/l。[0067]因此，将重组质粒pgapzaa-06257-1转化x33酵母菌后，可获得较大的hps06257蛋白表达量。[0068]实施例2：[0069]实施例1制备得到的副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257在制备疫苗中的应用：[0070]纯化得到的酵母来源hps06257蛋白和实验室大肠杆菌表达hps06257[11]分别测定浓度后经0.22um无菌滤膜过滤，与无菌201佐剂(购自seppic公司)按照1：1的比例分别乳化制备成重组亚单位蛋白hps06257疫苗，使每毫升疫苗中的hps06257抗原含量均为250ug，2ml为一头份，置于4℃保存待用。同时用pbs缓冲液与无菌201佐剂(购自seppic公司)按照1：1的比例乳化制备对照苗，置于4℃保存待用。[0071]副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257疫苗在猪体内评价[0072]1.副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257疫苗在猪体内进行安全性评价[0073]购买约2周龄副猪嗜血杆菌阴性猪9头，随机分成a、b、c三组，隔离饲养，每组3头。采用颈部肌肉注射方式，a组每头猪免疫1头份酵母来源hps06257亚单位疫苗，b组每头猪免疫1头份大肠杆菌来源hps06257亚单位疫苗，3周后进行第二次免疫，c组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内a免疫猪健康状况良好，未出现因疫苗注射引起的局部脓肿，溃烂或全身不良反应，与非免疫猪一致，b组有一头猪在首次免疫后第一天，第二天体温偏高(偏离基础温度值小于1.5℃)，第三天又恢复。此结果表明酵母来源亚单位疫苗对本体动物猪是安全的，在不良反应控制方面优于大肠杆菌来源的亚单位疫苗。[0074]2.副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257疫苗在猪体内进行有效性评价[0075]为进一步评价上述制备亚单位疫苗对本体动物猪的免疫效力，购买约2周龄副猪嗜血杆菌阴性猪30头，随机分成a、b、c、d、e、f六组，隔离饲养，每组5头。a组和c组每头猪免疫1头份酵母来源hps06257亚单位疫苗，b组和d组每头猪免疫1头份大肠杆菌来源hps06257亚单位疫苗，e、f组免疫pbs乳化的对照苗，作为阴性对照。3周后进行第二次免疫，二免后14天a、b、e组采用腹腔注射方式攻5型菌sh0165株(2001年分离自石家庄一病猪猪肺[7])，攻菌剂量一个致死剂量6×109cfu，攻菌后观察5天，a免疫组5/5保护，b免疫组4/5，攻菌对照组全部死亡，结果如图3。[0076]结果表明酵母来源副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257疫苗具有良好的免疫原性，能够保护猪只免于副猪嗜血杆菌的致死性攻击。c、d、f在首次免疫后的14日、21日、35日、60日、90日、120、150日、180日分别采血，检测副猪嗜血杆菌iha抗体效价，结果如图4，f组抗体效价均小于4，为阴性。酵母来源和大肠杆菌来源hps06257制备亚单位疫苗的iha抗体均在首免后21d开始检测到抗体，在60-90天达到峰值，之后缓步下降，120d酵母来源亚单位疫苗组副猪嗜血杆菌iha效价均值为64，大肠杆菌来源亚单位疫苗组iha效价均值为44.8；150天的对应数据分别为28.8和20.8；180天的对应数据分别为16和10.4。[0077]综上，在激起抗体水平和峰值抗体效价上两免疫组无明显差异，90天峰值以后的抗体维持水平上酵母来源组略优于大肠杆菌来源组，能保护猪只免于副猪嗜血杆菌的致死性攻击。并且能在免疫后180日内维持副猪嗜血杆菌iha抗体阳性。当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：3.副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis,hps)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide,nad)依赖的非运动、多形态、有荚膜的革兰氏阴性小杆菌，为猪的上呼吸道常驻菌，在特定条件下如应激、免疫力低下和混合感染时，毒力菌株可以侵入宿主深部组织引起严重的革拉瑟氏病，引起猪全身性炎症反应，主要表现为急性渗出性纤维素炎、多发性纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等，多见于断奶前后和仔猪阶段[1,2]。该菌已报道至少有15种血清型，各菌株间毒力差距较大，不同国家和地区的流行的优势血清型也不尽相同。血清型调查表明国内外流行的的血清型主要是5型、4型等毒力较强的血清型[3-7]。近年来养猪生产的日益规模化、集约化，养猪生产方式的改变给该病的发展和传播提供了便利。加之常常与常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒、链球菌、大肠杆菌等混合感染，使得副猪嗜血杆菌成为保育仔猪死亡的主要原因，给全球的养猪业带来了巨大损失[8-10]。[0004]临床上副猪嗜血杆菌病的防控主要还是依赖灭活疫苗和抗菌药物，传统灭活疫苗因各血清型间有限的交叉保护，需结合当地的菌株血清型流行情况使用方能取得良好效果，难以达到广谱保护。且存在生物安全风险、副反应较大等问题，限制了其推广应用。亚单位疫苗，安全性好，稳定性高已逐渐成为疫苗开发的重点方向，加之近年来滥用抗生素造成的危害繁多，因此亟需开发优质的副猪嗜血杆菌亚单位疫苗以预防和控制革拉瑟氏病的爆发。[0005]目前国内外已报道了大量h.parasuis的亚单位疫苗，如荚膜、菌毛、外膜蛋白、脂多糖、转铁蛋白等。在早期研究中，我们发现了副猪嗜血杆菌转铁蛋白hps06257可作为候选的免疫原用于副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的制备，该疫苗在小鼠水平上的安全性及有效性都得到了试验肯定[11]。该疫苗采用大肠杆菌bl21表达，大肠杆菌是革兰氏阴性菌，在生长期和稳定期以及细菌死亡崩解时会释放出内毒素[12]。内毒素对猪可产生广泛的损害，包括发热、败血性休克、厌食、炎症反应、组织损伤及生产性能下降[13]。在使用过程中若残留内毒素含量控制不当极易引起不良反应。且大肠杆菌表达体系，表达外源蛋白的游离质粒也存在丢失的可能。[0006]巴氏毕赤酵母(pichiapastoris)是1969年由ogata等首次发现的，并于20世纪80年代迅速发展为一个新兴的表达系统，被广泛用于外源基因的表达[14]。在酵母表达系统中，由于酵母体内不存在天然质粒，目的基因是以整合的方式进入酵母基因组中进行表达的，避免了表达质粒以游离的形式存在时被酵母降解的风险。在毕赤酵母表达体系中要设计一个最优的外源蛋白表达体系包含许多关键的步骤：如(1)选择具有适当的折叠和翻译后修饰功能的宿主菌；(2)选择一个合适的载体(附加型或整合型)、启动子(组成型、诱导型或阻遏型)和选择性标记；(3)对基因进行密码子优化；(4)如果要对蛋白进行亲和纯化或检测核糖体蛋白的活性，则需要加上表位标签；(5)选择信号肽使核糖体蛋白靶向性的由胞内释放到胞外的介质中；(6)优化发酵条件等[15]。[0007]密码子偏好性优化策略是目前最常用的密码子优化策略，主要是将供体密码子与宿主基因组中具有最高频率的同义密码子进行替换，利用宿主中最丰富的密码子来编码优化序列中的氨基酸[16]。密码子偏好性对蛋白的表达有着直接的影响，能通过trna在翻译水平上改变蛋白的翻译速度[17]。但也有部分实验结果表明，利用密码子偏好性的优化策略来进行蛋白表达时，非但没有增加蛋白的表达含量，反而使蛋白的含量降低[18]。因此需结合实际情况进行密码子优化序列的选择。[0008]另外虽然都属于酵母菌，但针对相同的根据酵母菌密码子优化后的序列依然存在表达量的显著性差异(cn2014108403710)，因此，可以看到，蛋白表达量至少受到密码子优化和菌株选择的影响，需要二者之间达到很好的兼容蛋白表达量才能有显著提高。[0009]参考文献：[0010]1.蔡旭旺,etal.,副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定.华中农业大学学报,2005(01):p.55-58.[0011]2.周雪,etal.,副猪嗜血杆菌的培养及流行血清型鉴定.黑龙江畜牧兽医,2012(11):p.111-112.[0012]3.morikoshi,t.,etal.,characterizationofhaemophilusparasuisisolatedinjapan.nihonjuigakuzasshi,1990.52(3):p.667-9.[0013]4.kielstein,p.andv.j.rapp-gabrielson,designationof15serovarsofhaemophilusparasuisonthebasisofimmunodiffusionusingheat-stableantigenextracts.jclinmicrobiol,1992.30(4):p.862-5.[0014]5.rubies,x.,etal.,prevalenceofhaemophilusparasuisserovarsisolatedinspainfrom1993to1997.vetmicrobiol,1999.66(3):p.245-8.[0015]6.rafiee,m.andp.j.blackall,establishment,validationanduseofthekielstein-rapp-gabrielsonserotypingschemeforhaemophilusparasuis.austvetj,2000.78(3):p.172-4.[0016]7.cai,x.,etal.,serologicalcharacterizationofhaemophilusparasuisisolatesfromchina.vetmicrobiol,2005.111(3-4):p.231-6.[0017]8.zhang,b.,etal.,updateonthepathogenesisofhaemophilusparasuisinfectionandvirulencefactors.vetmicrobiol,2014.168(1):p.1-7.[0018]9.黄润标,etal.,副猪嗜血杆菌的流行病学及预防保护研究进展.广东农业科学,2010.37(08):p.175-177.[0019]10.张昆丽and李春玲,副猪嗜血杆菌病研究进展.广东农业科学,2020.47(12):p.166-174.[0020]11.zhou,m.,etal.,identificationandcharacterizationofnovelimmunogenicoutermembraneproteinsofhaemophilusparasuisserovar5.vaccine,2009.27(38):p.5271-7.[0021]12.wells,j.e.andj.b.russell,theeffectofgrowthandstarvationonthelysisoftheruminalcellulolyticbacteriumfibrobactersuccinogenes.applenvironmicrobiol,1996.62(4):p.1342-6.[0022]13webel,d.m.,etal.,timecourseofincreasedplasmacytokines,cortisol,andureanitrogeninpigsfollowingintraperitonealinjectionoflipopolysaccharide.janimsci,1997.75(6):p.1514-20.[0023]14.siegel,r.s.andr.a.brierley,methylotrophicyeastpichiapastorisproducedinhigh-cell-densityfermentationswithhighcellyieldsasvehicleforrecombinantproteinproduction.biotechnolbioeng,1989.34(3):p.403-4.[0024]15.田晓娟,酵母表达系统研究概述.陇东学院学报,2018.29(01):p.72-76.[0025]16.villalobos,a.,etal.,genedesigner:asyntheticbiologytoolforconstructingartificialdnasegments.bmcbioinformatics,2006.7:p.285.[0026]17.sabi,r.andt.tuller,modellingtheefficiencyofcodon-trnainteractionsbasedoncodonusagebias.dnares,2014.21(5):p.511-26.[0027]18.zhu,d.,etal.,comparisonoftwocodonoptimizationstrategiesenhancingrecombinantsusscrofalysozymeproductioninpichiapastoris.cellmolbiol(noisy-le-grand),2015.61(2):p.43-9.技术实现要素：[0028]本发明的目的在于提供了一种酵母来源的副猪嗜血杆菌hps06257蛋白亚单位疫苗制备方法，方法简单，可大批量的对该蛋白进行制备，适合工业化生产。[0029]本发明的另一个目的在于提供了上述方法制备副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：[0030]一种酵母来源的副猪嗜血杆菌hps06257蛋白亚单位疫苗制备方法，包括将seqidno.1所示基因插入表达载体pgapzaa中，转化毕赤酵母(pichiapastoris)x33中进行表达。[0031]本发明的保护范围还包括上述方法制备的副猪嗜血杆菌病亚单位蛋白在制备疫苗中的应用。[0032]与现有技术相比，本发明具有以下优点：[0033]1.本技术使用的毕赤酵母真核表达体系，所表达的hps06257蛋白经过密码子优化，目的蛋白结构与功能与天然状态完全一致，更易于在毕赤酵母表达系统中翻译和合成。[0034]2.本技术中，利用毕赤酵母组成型表达系统分泌表达副猪嗜血杆菌的hps06257蛋白，蛋白产量高，纯度高，制备工艺简单，无内毒素，安全性更高。附图说明[0035]图1为重组表达载体pgapzaa-06257-1双酶切鉴定图。[0036]图2为酵母来源副猪嗜血杆菌蛋白hps06257(a)特性鉴定和(b)免疫原性鉴定。[0037]图3为副猪嗜血杆菌蛋白hps06257亚单位疫苗的免疫攻菌保护结果。[0038]图4为副猪嗜血杆菌蛋白hps06257亚单位疫苗的抗体消长结果。具体实施方式[0039]本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。[0040]申请人前期对不同组成型表达载体，不同酵母菌的目的蛋白的表达的影响进行了探索，申请人针对酵母菌的特点，针对相同的外源基因，获得优化密码子的基因序列，将该外源基因转入不同的酵母表达载体中，以电转法转化至gs115、smd1168、km71和x33酵母中进行表达，并对不同表达载体-宿主表达体系的表达量差异进行比较，发现表达载体pgapzaa与各酵母菌兼容性最好。因此，申请人根据不同酵母菌进一步对密码子进行优化，利用表达载体pgapzaa进行表达量的探索。[0041]实施例1:[0042]一种酵母来源的副猪嗜血杆菌hps06257蛋白亚单位疫苗制备方法，包括下述步骤：[0043](一)、重组表达载体pgapzaa-06257的构建[0044]1.获取目的基因06257[0045]参照副猪嗜血杆菌血清5型sh0165株蛋白06257基因序列，根据酵母密码子的偏爱性，人工合成711bp的三条06257orf，分别命名为06257orf-1(seqidno.1)、06257orf-2(seqidno.2)、06257orf-3(seqidno.3)。优化后的序列均在羧基端引入6*his标签肽序列，为目的蛋白的亲和纯化奠定基础。合成的目的基因06257orf置于质粒载体puc-18(invitrogen公司)上，即以puc-18-06257的形式取得，分别为puc-18-06257-1，puc-18‑ꢀ06257-2，puc-18-06257-3。[0046]2.构建重组表达载体pgapzaa-06257-1、pgapzaa-06257-2和pgapzaa-06257-3[0047]以06257orf-1(seqidno.1)序列构建重组表达载体pgapzaa-06257-1为例进行说明，具体的重组表达载体构建过程如下：[0048]①酶切：本技术采用xhoi、noti两个限制性内切酶(购自takara)酶切位点，对人工合成基因06257-1从puc-18-06257-1上进行双酶切；同时用相同的限制性内切酶对表达载体pgapzaa进行酶切。体系如下：[0049][0050]酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。[0051]②连接：[0052][0053][0054]③转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态dh10b中，涂博来霉素抗性平板。[0055]④提取重组质粒pgapzaa-06257-1：从平板上挑取单克隆菌落于博来霉素抗性培养基37度培养,过夜培养菌液采用质粒抽提试剂盒提取质粒，酶切鉴定结果见图1。[0056]根据上述方法成功构建重组质粒pgapzaa-06257-2和pgapzaa-06257-3。[0057](二)、转化酵母感受态细胞[0058]将上述重组质粒pgapzaa-06257-1，pgapzaa-06257-2，pgapzaa-06257-3分别转入毕赤酵母表达菌株gs115、smd1168、km71和x33中，对阳性酵母重组子在200ml摇瓶发酵水平进行蛋白表达量差异比较。[0059]以重组质粒pgapzaa-06257-1转化毕赤酵母x33为例，具体的毕赤酵母转化过程如下：[0060]将10ug经限制性内切酶avrii线性化的重组表达载体pgapzaa-06257-1加入一支x33酵母感受态中，轻弹管壁混匀，转移至电转杯中，置于冰上孵育5min。冰浴后将电转杯杯壁上水分充分擦干，按照invitrogen公司毕赤酵母电转化指导方法进行电转，电转后迅速加入1ml预冷的1m山梨醇轻柔地吹打混匀，于30℃静置2h。取200ul静置后菌悬液涂布于博来霉素抗性的ypd平板板上，30℃倒置培养3天。[0061](三)、酵母重组子的小量表达鉴定[0062]在博来霉素抗性筛选板上挑取若干重组酵母菌接种于3mlypd培养基中，30℃培养2d(250rpm)。离心取上清样在12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至pvdf膜上，用实验室制备hps06257蛋白猪阳性血清和羊抗猪-igg-hrp分别作为一抗和二抗进行westernblot检测。[0063](四)、副猪嗜血杆菌重组蛋白hps06257的表达与纯化[0064]取上步鉴定的阳性重组子接种于3mlypd培养基中，30℃培养1d(250rpm)后按照1:100的转接比例接种于200mlypd培养基中，30℃培养2d(250rpm)，离心取上清。[0065]纯化方法采用常规镍柱亲和层析法。具体操作步骤如下：表达hps06257重组酵母菌离心上清，用0.45um的滤膜过滤除去细小杂质；过滤后的上清与经平衡后的镍柱进行结合过柱；洗杂缓冲液(40mm咪唑，20mmtris，200mmnacl)过柱洗杂；洗脱缓冲液(250mm咪唑，20mmtris，200mmnacl)过柱洗脱；洗脱液用透析缓冲液(20mmtris，200mmnacl)置于4℃透析过夜，得到目的蛋白。对纯化蛋白进行sds-page和westernblot检测。检测结果见图2。[0066]在上述重组质粒pgapzaa-06257-1，pgapzaa-06257-2，pgapzaa-06257-3与酵母表达菌株gs115、smd1168、km71和x33中的载体-宿主组合中，各选一阳性酵母重组子在200ml摇瓶发酵水平进行蛋白表达量差异比较，当用等量毕赤酵母菌体以等量体积发酵时，不同载体-宿主组合中，pgapzaa-06257-1转化重组菌x33中目的蛋白hps06257表达量更高，每升发酵液能得到的目的蛋白hps06257纯化量为50mg。能被副猪嗜血杆菌阳性血清识别，具有免疫原性。相较于实验室前期大肠杆菌表达的06257[11]单位纯化量的42mg/l提高了19％。其他载体-宿主组合中表达蛋白也具有免疫原性，但在等量重组酵母同等发酵条件下获得目的蛋白含量低于均低于40mg/l。[0067]因此，将重组质粒pgapzaa-06257-1转化x33酵母菌后，可获得较大的hps06257蛋白表达量。[0068]实施例2：[0069]实施例1制备得到的副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257在制备疫苗中的应用：[0070]纯化得到的酵母来源hps06257蛋白和实验室大肠杆菌表达hps06257[11]分别测定浓度后经0.22um无菌滤膜过滤，与无菌201佐剂(购自seppic公司)按照1：1的比例分别乳化制备成重组亚单位蛋白hps06257疫苗，使每毫升疫苗中的hps06257抗原含量均为250ug，2ml为一头份，置于4℃保存待用。同时用pbs缓冲液与无菌201佐剂(购自seppic公司)按照1：1的比例乳化制备对照苗，置于4℃保存待用。[0071]副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257疫苗在猪体内评价[0072]1.副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257疫苗在猪体内进行安全性评价[0073]购买约2周龄副猪嗜血杆菌阴性猪9头，随机分成a、b、c三组，隔离饲养，每组3头。采用颈部肌肉注射方式，a组每头猪免疫1头份酵母来源hps06257亚单位疫苗，b组每头猪免疫1头份大肠杆菌来源hps06257亚单位疫苗，3周后进行第二次免疫，c组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内a免疫猪健康状况良好，未出现因疫苗注射引起的局部脓肿，溃烂或全身不良反应，与非免疫猪一致，b组有一头猪在首次免疫后第一天，第二天体温偏高(偏离基础温度值小于1.5℃)，第三天又恢复。此结果表明酵母来源亚单位疫苗对本体动物猪是安全的，在不良反应控制方面优于大肠杆菌来源的亚单位疫苗。[0074]2.副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257疫苗在猪体内进行有效性评价[0075]为进一步评价上述制备亚单位疫苗对本体动物猪的免疫效力，购买约2周龄副猪嗜血杆菌阴性猪30头，随机分成a、b、c、d、e、f六组，隔离饲养，每组5头。a组和c组每头猪免疫1头份酵母来源hps06257亚单位疫苗，b组和d组每头猪免疫1头份大肠杆菌来源hps06257亚单位疫苗，e、f组免疫pbs乳化的对照苗，作为阴性对照。3周后进行第二次免疫，二免后14天a、b、e组采用腹腔注射方式攻5型菌sh0165株(2001年分离自石家庄一病猪猪肺[7])，攻菌剂量一个致死剂量6×109cfu，攻菌后观察5天，a免疫组5/5保护，b免疫组4/5，攻菌对照组全部死亡，结果如图3。[0076]结果表明酵母来源副猪嗜血杆菌重组亚单位蛋白hps06257疫苗具有良好的免疫原性，能够保护猪只免于副猪嗜血杆菌的致死性攻击。c、d、f在首次免疫后的14日、21日、35日、60日、90日、120、150日、180日分别采血，检测副猪嗜血杆菌iha抗体效价，结果如图4，f组抗体效价均小于4，为阴性。酵母来源和大肠杆菌来源hps06257制备亚单位疫苗的iha抗体均在首免后21d开始检测到抗体，在60-90天达到峰值，之后缓步下降，120d酵母来源亚单位疫苗组副猪嗜血杆菌iha效价均值为64，大肠杆菌来源亚单位疫苗组iha效价均值为44.8；150天的对应数据分别为28.8和20.8；180天的对应数据分别为16和10.4。[0077]综上，在激起抗体水平和峰值抗体效价上两免疫组无明显差异，90天峰值以后的抗体维持水平上酵母来源组略优于大肠杆菌来源组，能保护猪只免于副猪嗜血杆菌的致死性攻击。并且能在免疫后180日内维持副猪嗜血杆菌iha抗体阳性。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
