华法林-4-O-乙酰-Gly-Pro-Arg-Pro-AA1及其合成、活性和应用的制作方法

华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa1及其合成、活性和应用
技术领域
1.本发明涉及4种华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa的化合物,涉及它们的制备方法,涉及它们无出血副作用的优点,涉及它们的活性以及在制备药物中的应用。本发明属于生物医药领域。


背景技术：

2.血栓性疾病是严重威胁人类生命健康的病症,具有发病率高与致死率高的特点。根据血栓块形成位置的不同,血栓性疾病可分为动脉血栓栓塞疾病与静脉血栓栓塞疾病两类,其中静脉血栓栓塞性疾病(vte)是最为多见的血栓性疾病,其主要病症包括深静脉血栓(dvt)与肺栓塞(pe),pe所造成的死亡率很高,而dvt若疏于防范,也可带来严重的并发症。vte的主要临床治疗方案为使用抗凝药物进行抗凝治疗,以华法林为代表的维生素k1拮抗剂是最常用的抗凝药物之一。可是,华法林有个体用药剂量差异大及出血副作用严重等缺点。针对华法林的缺点发明人曾经公开华法林-4-氧乙酰-gly-pro-arg-pro(cn 107686506a)和华法林-4-氧乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为ala,glu,gly和pro残基,cn 108976285a；以及aa为asp,ile,leu,phe,tyr和val残基,cn 108976284a)。可是它们对静脉血栓用作用意义的组织因子/凝血因子vii无拮抗作用。在进一步探索和研究的努力中,发明人发现华法林-4-氧乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为arg,asn,gln和lys残基)不仅拮抗剂凝血因子ii,而且拮抗组织因子/凝血因子vii。根据这些发现,发明人提出了本发明。


技术实现要素：

3.本发明的第一个内容是提供下式的4种华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为arg,asn,gln和lys残基)。
[0004][0005]
本发明的第二个内容是提供4种华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为arg,asn,gln和lys残基)的制备方法,该方法包括：
[0006]
1)合成华法林-4-o-乙酸苄酯；
[0007]
2)合成华法林-4-o-乙酸；
[0008]
3)合成boc-gly-pro-obzl；
[0009]
4)将boc-gly-pro-obzl转化为gly-pro-obzl；
[0010]
5)华法林-4-o-乙酸与gly-pro-obzl反应合成华法林-4-o-乙酰-gly-pro-obzl；
[0011]
6)将华法林-4-o-乙酰-gly-pro-obzl转化为华法林-4-o-乙酰-gly-pro；
[0012]
7)合成boc-arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl,boc-arg(no2)-pro-asn-obzl,boc-arg(no2)-pro-gln-obzl和boc-arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl；
[0013]
8)将boc-arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl,boc-arg(no2)-pro-asn-obzl,boc-arg(no2)-pro-gln-obzl和boc-arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl转化为arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl,arg(no2)-pro-asn-obzl,arg(no2)-pro-gln-obzl和arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl；
[0014]
9)华法林-4-o-乙酰-gly-pro与arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl,arg(no2)-pro-asn-obzl,arg(no2)-pro-gln-obzl及arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl反应合成华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl,华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-asn-obzl,华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-gln-obzl及华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl；
[0015]
10)华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl,华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-asn-obzl,华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-gln-obzl及华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl转化为华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa,式中aa为arg残基,asn残基,gln残基及lys残基。
[0016]
本发明的第三个内容是评价4种华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为arg,asn,gln和lys残基)的抗静脉血栓活性。
[0017]
本发明的第四个内容是评价4种华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为arg,asn,gln和lys残基)的出血副作用。
[0018]
本发明的第五个内容是评价4种华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为arg,asn,gln和lys残基)对凝血因子ii的拮抗作用。
[0019]
本发明的第五个内容是评价4种华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为arg,asn,gln和lys残基)对组织因子/凝血因子vii的拮抗作用。
附图说明
[0020]
图1.华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(aa为arg,asn,gln和lys残基)的合成路线.(i)溴-2-乙酸苄酯,丙酮,k2co3,45℃；(ii)ch3oh,pd/c,h2；(iii)二环己基碳二亚胺,1-羟基苯并三唑,n-甲基吗啉,四氢呋喃；(iv)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4n)；(v)三氟乙酸,三氟甲磺酸。
具体实施方式
[0021]
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
[0022]
实施例1制备华法林-4-o-乙酸苄酯(1)
[0023]
将26.48g(80.00mmol)华法林分散于400ml丙酮中,45℃搅拌至华法林溶解,向反应液中加入12.1g(88.0mmol)k2co3,而后加入14ml(88mmol)溴乙酸苄酯,继续于45℃搅拌96小时,tlc(石油醚/乙酸乙酯,2/1)显示原料点消失,过滤,滤液减压浓缩,得到的淡黄色油状物用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯,8/1),得到19.77g(54％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):457[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝7.89(dd,j1＝3.0hz,j2＝9.0hz,1h),7.63(dt,j1＝3.0hz,j2＝9.0hz,1h),7.43～7.31(m,9h),7.24(t,j＝9.0hz,
2h),7.15(tt,j＝9.0hz,1h),5.26(s,2h),5.61(s,1h),5.02(d,j＝15.0hz,1h),4.85(d,j＝15.0hz,1h),4.97(t,j＝9.0hz,1h),3.45(dq,j1＝9.0hz,j2＝18.0hz,2h),2.11(s,3h)。
[0024]
实施例2制备华法林-4-o-乙酸(2)
[0025]
将19.77g(43.36mmol)华法林-4-o-乙酸苄酯(1)溶于150ml四氢呋喃中,加入4.94g pd/c并搅拌,抽去空气,通入氢气,室温下搅拌72小时。tlc(石油醚/乙酸乙酯,2/1)显示原料点消失,过滤,滤液减压浓缩,得到15.58g(98.％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):367[m h]

；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝12.86(s,1h),7.90(d,j＝6.0hz,1h),7.63(t,j＝6.0hz,1h),7.43～7.34(m,4h),7.27(t,j＝9.0hz,2h),7.17(t,j＝9.0hz,1h),4.99(t,j＝9.0hz,1h),4.75(dd,j1＝15.0hz,j2＝30.0hz,2h),3.54～3.47(m,2h),2.14(s,3h)。
[0026]
实施例3制备boc-gly-pro-obzl
[0027]
将7.730g(44.15mmol)boc-gly溶解于100ml干燥的四氢呋喃中,0℃加入5.940g(44.00mmol)1-羟基苯并三唑及9.888g(48.00mmol)二环己基碳二亚胺,搅拌30分钟。0℃将9.665g(40.00mmol)hcl
·
pro-obzl加入反应液中,用n-甲基吗啉调节反应液ph值到9,室温下搅拌17小时,tlc(二氯甲烷/甲醇,20/1)显示原料点消失,过滤,将滤液减压浓缩,残留物用150ml乙酸乙酯溶解,过滤,滤液用饱和nahco3水溶液洗(50ml
×
3),饱和nacl水溶液洗(50ml
×
3),5％khso4水溶液洗(50ml
×
3),饱和nacl水溶液洗(50ml
×
3),饱和nahco3水溶液洗(50ml
×
3),饱和nacl水溶液洗(50ml
×
3),乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥12小时,过滤,滤液减压蒸浓缩,得到的淡黄色固体用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯,3/1),得到13.42g(92.7％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):363[m h]

。
[0028]
实施例4制备hcl
·
gly-pro-obzl
[0029]
将13.42g(37.05mmol)boc-gly-pro-obzl溶解于50ml干燥的乙酸乙酯中,0℃加入100ml浓度为4n的氯化氢的乙酸乙酯溶液,室温搅拌至tlc(二氯甲烷/甲醇,10/1)显示反应完成,将反应液减压浓缩,残留物用干燥乙酸乙酯复溶后再减压浓缩,得到的无色油状物用无水乙醚研磨。倾情去乙醚,得到10.85g(98.0％)标题化合物,为无色发粘固体。esi-ms(m/e):263[m h]

。
[0030]
实施例5制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-obzl(3)
[0031]
采用实施例3的方法从15.58g(42.57mmol)华法林-4-o-乙酸和11.56g(38.70mmol)hcl
·
pro-obzl得到21.07g(89％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):611[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.50(dd,j1＝5.7hz,j2＝11.4hz,1h),7.91(dt,j1＝1.5hz,j2＝8.7hz,1h),7.64(td,j1＝1.5hz,j2＝6.0hz,1h),7.43(d,j＝7.5hz,4h),7.34(m,6h),7.29(t,j＝3.3hz,2h),7.19(m,1h),5.15(m,2h),4.92(t,j＝7.5hz,1h),4.58(t,j＝3.9hz,2h),4.44(dd,j1＝3.9hz,j2＝9.0hz,1h),4.10(m,2h),3.61(m,2h),3.47(d,j＝7.2hz,2h),2.22(m,1h),2.14(s,3h),1.99～1.76(m,3h)。
[0032]
实施例6制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro(4)
[0033]
将21.07g(34.53mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro-obzl溶解于100ml四氢呋喃中,向内加4.214g pd/c,搅拌并抽去空气,通入氢气,室温搅拌3天。tlc(二氯甲烷/甲醇,15/1与2滴冰醋酸)显示原料点消失,过滤,滤液减压浓缩,得到14.68g(82％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):521[m h]

。
[0034]
实施例7制备boc-pro-arg-obzl
[0035]
采用实施例3的方法从2.365g(11.00mmol)boc-pro和4.357g(9.989mmol)tos
·
arg(no2)-obzl得到4.69g(84％)标题化合物,为淡黄色固体。esi-ms(m/e):507[m h]

。
[0036]
实施例8制备hcl
·
pro-arg(no2)-obzl
[0037]
采用实施例4的方法从3.800g(7.510mmol)boc-pro-arg-obzl得到3.05g(100％)标题化合物,为淡黄色粉末。esi-ms(m/e):407[m h]

。
[0038]
实施例9制备boc-arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl
[0039]
采用实施例3的方法从2.971g(9.313mmol)boc-arg(no2)和3.05g(7.512mmol)hcl
·
pro-arg(no2)-obzl得到3.181g(60％)标题化合物,为无色固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.50(m,2h),8.33(d,j＝7.5hz,1h),7.35(m,5h),6.94(d,j＝7.8hz,1h),5.10(dd,j1＝12.6hz,j2＝19.2hz,2h),4.30(m,2h),4.15(m,1h),3.53(m,2h),3.14(m,4h),1.99～1.58(m,12h),1.36(s,9h)。
[0040]
实施例10制备hcl
·
arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl
[0041]
采用实施例4的方法从1.655g(2.341mmol)boc-arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl得到1.500g(100％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):608[m h]

。
[0042]
实施例11制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl(5a)
[0043]
采用实施例3的方法从1.431g(2.751mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro(4)和1.500g(2.331mmol)hcl
·
arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl得到1.41g(55％)标题化合物,为无色固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.50(m,3h),8.34(m,1h),8.15(m,1h),7.89(d,j＝7.5hz,1h),7.62(d,j＝7.2hz,1h),7.42(m,2h),7.35(m,7h),7.26(t,j＝7.2hz,2h),7.18(m,1h),5.10(m,2h),4.90(m,1h),4.58(m,2h),4.42(m,2h),4.30(m,2h),4.06(m,2h),3.55(m,4h),3.49(d,j＝10.2hz,2h),3.15(m,4h),2.14(s,3h),1.92～1.58(m,16h)。
[0044]
实施例12制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-arg(6a)
[0045]
将382mg(0.36mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-arg(no2)-obzl(5a)溶解于4ml三氟乙酸中,而后逐滴加入1.5ml三氟甲磺酸,0℃反应1小时,tlc(乙酸乙酯/冰醋酸/水,3/1/1)显示原料点消失。将反应液于0℃减压浓缩,残留物用30ml冰冷的乙醚磨洗,静置10分钟后倾倒出上层的澄清溶液,残留物继续用30ml冰冷的乙醚磨洗,静置10分钟后再倾倒出上层的澄清溶液。最后将残留物用2ml水溶解,于0℃用10％氨水调节溶液ph＝7,过滤,得到3ml淡黄色溶液,用sephadex-g10凝胶过滤色谱柱将该溶液初步纯化,收集经tlc监测有uv显色的洗脱液,冷冻干燥得到113mg(34％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):930[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.56(m,1h),8.43(s,2h),8.26(m,1h),7.90(m,1h),7.64(m,2h),7.51(s,3h),7.44～7.35(m,5h),7.26(m,2h),7.19(m,2h),4.90(t,j＝7.5hz,1h),4.58(d,j＝3.3hz,2h),4.50(m,1h),4.40(dd,j1＝7.8hz,j2＝3.6hz,1h),4.25(m,1h),4.05(m,2h),3.70(m,3h),3.56(m,2h),3.46(d,j＝7.5hz,2h),3.08(m,4h),2.14(s,3h),2.05～1.42(m,16h)。
[0046]
实施例13制备boc-pro-asn-obzl
[0047]
采用实施例3的方法从0.713g(3.32mmol)boc-pro和0.801g(3.10mmol)hcl
·
asn-obzl得到1.13g(87％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/e):420[m h]

。
[0048]
实施例14制备hcl
·
pro-asn-obzl
[0049]
采用实施例4的方法从1.062g(2.535mmol)boc-pro-asn-obzl得到0.90g(100％)标题化合物,为黄色油状物。esi-ms(m/e):320[m h]

。
[0050]
实施例15制备boc-arg(no2)-pro-asn-obzl
[0051]
采用实施例3的方法从0.877g(2.75mmol)boc-arg(no2)和0.889g(2.50mmol)hcl
·
pro-asn-obzl得到1.32g(85％)标题化合物,为无色固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.44(m,1h),8.17(d,j＝7.8hz,1h),7.44(s,1h),7.35(s,5h),7.32(d,j＝4.5hz,2h),6.98(s,1h),6.90(d,j＝7.5hz,1h),5.08(s,2h),4.63(dd,j1＝13.8hz,j2＝6.0hz,1h),4.37(m,1h),4.16(m,1h),3.56(m,2h),3.12(m,1h),2.55(t,j＝4.8hz,2h),1.94～1.42(m,8h),1.36(s,9h)。
[0052]
实施例16制备hcl
·
arg(no2)-pro-asn-obzl
[0053]
采用实施例4的方法从0.700g(1.12mmol)boc-arg(no2)-pro-asn-obzl得到0.514g(83％)标题化合物,为无色固体粉末。esi-ms(m/e):521[m h]

。
[0054]
实施例17制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-asn-obzl(5b)
[0055]
采用实施例3的方法从0.5792g(1.113mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro(4)和0.514g(0.924mmol)hcl
·
arg(no2)-pro-asn-obzl得到0.396g(42％)标题化合物,为无色固体。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.43(m,2h),8.16(m,2h),7.87(d,j＝8.0hz,1h),7.61(t,j＝8.3hz,1h),7.42～7.37(m,3h),7.35～7.28(m,7h),7.23(t,j＝7.5hz,2h),7.14(m,1h),6.97(s,1h),5.05(m,2h),4.87(m,1h),4.61(m,1h),4.55(m,2h),4.49(m,1h),4.37(m,2h),4.03(m,2h),3.63～3.39(m,4h),3.43(d,j＝7.4hz,2h),3.11(s,2h),2.54(m,2h),2.12(s,3h),2.04～1.54(m,12h)。
[0056]
实施例18制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-asn(6b)
[0057]
采用实施例12的方法从200mg(0.20mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-asn-obzl(5b)得到95mg(54％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):886[m-h]-；1h nmr(500mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.40(m,1h),8.37(m,1h),8.19(m,1h),7.88(m,1h),7.62(m,1h),7.44～7.33(m,6h),7.26～7.22(m,3h),7.19～7.14(m,4h),6.65(s,1h),4.90～4.82(m,1h),4.56(d,j＝4.7hz,2h),4.53～4.38(m,2h),4.23(m,1h),4.02(m,2h),3.83(m,1h),3.66(m,2h),3.50(m,2h),3.44(d,j＝7.4hz,2h),3.08(m,2h),2.38(m,2h),2.12(s,2h),1.96～1.52(m,13h)。
[0058]
实施例19制备boc-pro-gln-obzl
[0059]
采用实施例3的方法从0.724g(3.37mmol)boc-pro和0.817g(3.00mmol)hcl
·
gln-obzl得到1.10g(85％)标题化合物,为无色固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.30(d,j＝6.6hz,1h),7.36(m,5h),7.29(d,j＝21.0hz,1h),6.78(s,1h),5.10(s,2h),4.27(m,1h),4.15(m,1h),3.34(m,1h),3.24(m,1h),2.15(t,j＝7.5hz,2h),2.05～1.72(m,6h),1.32(s,9h)。
[0060]
实施例20制备hcl
·
pro-gln-obzl
[0061]
采用实施例4的方法从1.09g(2.52mmol)boc-pro-gln-obzl得到0.98g(100％)标题化合物,为黄绿色固体。esi-ms(m/e):334[m h]

。
[0062]
实施例21制备boc-arg(no2)-pro-gln-obzl
[0063]
采用实施例3的方法从0.895g(2.81mmol)boc-arg(no2)和0.92g(2.49mmol)hcl
·
pro-gln-obzl得到0.556g(36％)标题化合物,为无色固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.47(m,1h),8.33(d,j＝7.2hz,1h),7.36(s,5h),7.20(s,1h),6.95(d,j＝7.6hz,1h),6.80(s,1h),5.10(m,2h),4.33(m,1h),4.24(m,1h),4.14(m,1h),3.57(m,2h),3.11(m,2h),2.17(m,2h),1.99～1.44(m,10h),1.36(s,9h)。
[0064]
实施例22制备hcl
·
arg(no2)-pro-gln-obzl
[0065]
采用实施例4的方法从0.556g(0.944mmol)boc-arg(no2)-pro-gln-obzl得到0.622g(98％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):633[m h]

。
[0066]
实施例23制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-gln-obzl(5c)
[0067]
采用实施例3的方法从0.5031g(0.967mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro(4)和0.5022g(0.7500mmol)hcl
·
arg(no2)-pro-gln-obzl得到0.583g(75％)标题化合物,为无色固体。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.41(m,2h),8.31(m,1h),8.14(d,j＝7.6hz,1h),7.87(m,1h),7.61(m,1h),7.39(m,1h),7.35～7.30(m,8h),7.23(t,j＝7.5hz,2h),7.19(m,1h),7.14(m,1h),6.80(m,1h),5.08(m,2h),4.87(m,1h),4.55(m,2h),4.49(m,1h),4.40(m,1h),4.31(m,1h),4.22(m,1h),4.03(m,2h),3.67～3.39(m,4h),3.43(d,j＝7.3hz,2h),3.11(s,2h),2.17(m,2h),2.11(s,3h),2.07～1.49(m,14h)。
[0068]
实施例24制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-gln(6c)
[0069]
采用实施例12的方法从200mg(0.19mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-gln-obzl(5c)得到96mg(56％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):900[m-h]-；1h nmr(500mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.28(m,1h),9.69(m,1h),8.36(m,1h),8.19(m,1h),7.88(m,1h),7.62(m,1h),7.44～7.33(m,5h),7.25～7.22(m,4h),7.15(m,2h),7.09(m,3h),6.62(s,1h),4.85(m,1h),4.55(d,j＝5.4hz,2h),4.45(m,2h),4.37(dd,j1＝8.5hz,j2＝3.2hz,1h),4.19(m,1h),4.00(m,2h),3.69(m,2h),3.63(m,1h),3.55～3.47(m,2h),3.44(d,j＝7.4hz,2h),3.09(m,2h),2.12(s,2h),2.00(m,3h),1.88(m,9h),1.76(s,2h),1.60(m,2h)。
[0070]
实施例25制备boc-pro-lys(cbz)-obzl
[0071]
采用实施例3的方法从1.065g(4.953mmol)boc-pro和1.260g(4.498mmol)hcl
·
lys(cbz)-obzl得到2.33g(91％)标题化合物,为黄色油状物。esi-ms(m/e):568[m h]

。
[0072]
实施例26制备hcl
·
pro-lys(cbz)-obzl
[0073]
采用实施例4的方法从将2.10g(3.70mmol)boc-pro-lys(cbz)-obzl得到1.99g(100％)标题化合物,为无色油状物。esi-ms(m/e):468[m h]

。
[0074]
实施例27制备boc-arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl
[0075]
采用实施例3的方法从1.053g(3.301mmol)boc-arg(no2)和1.241g(2.465mmol)hcl
·
pro-lys(cbz)-obzl得到1.84g(98％)标题化合物,为无色固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.48(m,1h),8.26(d,j＝7.2hz,1h),7.33(m,10h),7.26(m,1h),6.92(d,j＝7.5hz,1h),5.09(dd,j1＝21.0hz,j2＝12.3hz,2h),5.00(s,2h),4.36(m,1h),4.19(m,2h),3.53(m,2h),3.12(m,2h),2.95(m,2h),1.94～1.24(m,14h),1.36(s,9h)。
[0076]
实施例28制备hcl
·
arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl
[0077]
采用实施例4的方法从1.840g(2.395mmol)boc-arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl得到1.68g(100％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):669[m h]

。
[0078]
实施例29制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-lys(z)-obzl(5d)
[0079]
采用实施例3的方法从1.431g(2.751mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro和1.537g(2.187mmol)hcl
·
arg(no2)-pro-lys(z)-obzl得到1.97g(77％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):1171[m h]

。
[0080]
实施例30制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-lys(6d)
[0081]
采用实施例12的方法从200mg(0.17mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-lys(cbz)-obzl(5d)得到77mg(50％)标题化合物,为无色固体。esi-ms(m/e):902[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.34(m,1h),9.53(m,1h),8.57(m,1h),8.41(m,1h),8.26(m,1h),7.90(m,1h),7.64(m,1h),7.54～7.35(m,5h),7.29～7.24(m,6h),4.89(m,1h),4.58(d,j＝3.6hz,2h),4.51(m,1h),4.40(dd,j1＝8.1hz,j2＝3.0hz,1h),4.22(m,1h),4.05(m,2h),3.70(m,4h),3.55(m,1h),3.47(d,j＝7.2hz,2h),3.13(m,2h),2.73(t,j＝7.5hz,2h),2.36(s,1h),2.14(s,2h),2.06～1.19(m,18h)。
[0082]
实施例31评价6a-d的抗静脉血栓作用
[0083]
实验材料
[0084]
乌拉坦(氨基甲酸乙酯,cas:51-79-6,国药集团化学试剂有限公司),华法林钠(cas:129-06-6,百灵威科技有限公司)。
[0085]
实验动物
[0086]
雄性sd大鼠(250
±
20g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司。评价时用于制备大鼠下腔静脉结扎模型。
[0087]
给药剂量
[0088]
本发明的4种华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro-aa(式中aa为arg残基,asn残基,gln残基和lys残基)溶解于生理盐水,剂量为0.82μmol/kg；阳性对照华法林溶解于生理盐水,剂量为0.82μmol/kg；阴性对照为生理盐水。
[0089]
实验操作
[0090]
大鼠在手术前适应环境并禁食一天,大鼠灌胃给予化合物6a-d的生理盐水溶液,剂量为0.1μmol/kg；或者华法林的生理盐水溶液,剂量为4.87μmol/kg；或者生理盐水。给药30分钟后于手术前2分钟大鼠用20％乌拉坦溶液腹腔给药麻醉。然后固定于大鼠固定板上,腹部备皮且消毒,然后沿腹白线打开腹腔,上至露出肝脏一角,开口大小约4cm长即可。移开腹腔内小肠等器官并用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围结缔组织,暴露下腔静脉及其分支,在左肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开,然后用生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉交汇处将下腔静脉结扎,按解剖位置将肠等器官移回腹腔,用缝合线逐层缝合腹腔后将大鼠置于25～28℃的环境中循环4小时。之后接受乙醚麻醉,打开腹腔,逐个将下腔静脉的各个分支血管结扎,从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处开始取出2cm下腔静脉,从中取出血栓。血液留作测定凝血因子ii及组织因子/凝血因子vii的样品。血栓称重并利用t检验的方式统计结果。手术以每组四只交替进行。血栓重见表1。
[0091]
表1治疗大鼠的静脉血栓重
[0092][0093][0094]
a)与生理盐水比,p＜0.01；b)与生理盐水比,p＜0.01,与warfarin比,p》0.05,n＝8
[0095]
表1的数据表明,在0.1μmol/kg口服剂量下化合物6a-d治疗4小时有效地抑制大鼠静脉血栓。可见,本发明有显著的技术效果。此外,本发明的化合物6a-d的抗静脉血栓活性比华法林至少强48.7倍。
[0096]
实施例32评价6a-d对出血时间的影响
[0097]
实施例31的大鼠在取栓前接受麻醉,而后在大鼠的距鼠尾8cm处用手术刀开一个2mm深的创口,同时开始计时,每5秒钟用滤纸将血拭去,在滤纸上不能看到任何血迹的时候停止计时,所记的时间为大鼠尾出血时间。出血时间用t检验的方式统计结果。手术以每组四只交替进行。出血时间见表2。
[0098]
表2治疗大鼠尾出血时间
[0099][0100]
a)与生理盐水及6a-d比p＜0.01；n＝11
[0101]
表2的数据表明,在0.1μmol/kg的口服剂量下化合物6a-d治疗4小时,大鼠的尾出血时间与生理盐水治疗的大鼠无差异,而在4.87μmol/kg的口服剂量下华法林经治疗4小
时,大鼠的尾出血时间显长于生理盐水治疗大鼠的尾出血时间,显示明显的出血副作用。化合物6a-d没有造成与华法林类似的出血事件,比华法林安全。可见,本发明有意想不到的技术效果。
[0102]
实施例33评价6a-d对凝血时间的影响
[0103]
实施例31的大鼠在取栓前接受麻醉,令其腹部朝下卧于鼠板上,用蘸有医用酒精的脱脂棉球擦拭鼠尾以消毒,用直尺从大鼠鼠尾尖部量取8cm并做出标记,约为大鼠鼠尾中部的位置找到位于鼠尾正中处的血管,用手术刀片割出长约5mm,深约2mm的创口,待有血液流出时立刻用玻璃板取一滴血液并开始计时。而后用注射器针尖反复挑动血滴,频率约为2次/秒,直至针尖可以挑出细丝状血栓则停止计时,由此得到的时间即为大鼠凝血时间。得到的凝血时间利用t检验的方式统计结果。手术以每组四只交替进行。凝血时间见表3。
[0104]
表3治疗大鼠的凝血时间
[0105][0106]
a)与生理盐水及6a-d比,p＜0.01；n＝10
[0107]
表3的数据表明,在0.1μmol/kg的口服剂量下化合物6a-d治疗4小时,大鼠的鼠尾凝血时间与生理盐水治疗的大鼠没有差异,然而在4.87μmol/kg的口服剂量下华法林经治疗4小时,大鼠的尾凝血时间明显长于生理盐水治疗大鼠的尾凝血时间,显示明显的出血副作用。化合物6a-d没有造成与华法林类似的出血事件,比华法林安全。可见,本发明有意想不到的技术效果。
[0108]
实施例34评价6a-d对大鼠国际标准化比值的影响
[0109]
国际标准化比值反映凝血酶原时间,可由半自动血凝仪(型号ts6000,md pacific)自动计算得出。具体测试方法为,实施例31采集的大鼠的全血3.6ml/只,置于装有0.4ml枸橼酸钠溶液(3.8％)的离心管中,于2500g离心15分钟后,吸取上层贫血小板血浆(ppp),于测试杯中加入100μl ppp,再加入一粒测试磁珠,将待测样品于仪器的预温区中预温180秒,而后加入200μl凝血酶原时间测试液(试剂盒货号:20-7011,md pacific),仪器开始自动检测得出凝血酶原时间,并自动计算国际标准化比值,用t检验的方式统计结果,国际标准化比值见表4。
[0110]
表4治疗大鼠的国际标准化比值
[0111][0112]
a)与生理盐水及6a-d比,p＜0.01；n＝10
[0113]
表4的数据表明,在0.1μmol/kg的口服剂量下化合物6a-d治疗4小时,大鼠的国际标准化比值与生理盐水治疗的大鼠没有差异,然而在4.87μmol/kg的口服剂量下华法林经治疗4小时,大鼠的国际标准化比值明显大于生理盐水治疗大鼠的国际标准化比值,显示明显的出血副作用。化合物6a-d治疗4小时没有造成与华法林类似的出血事件,比华法林安全。可见,本发明有意想不到的技术效果。
[0114]
实施例35评价6a-d对大鼠血浆凝血因子ii(fiia)含量的影响
[0115]
实施例31采集的大鼠的全血4.0ml/只,置于装有0.4ml枸橼酸钠溶液(3.8％)的离心管中,于1000g离心15分钟后,吸取上层贫血小板血浆(ppp)。每个实验组取6只给药后大鼠的ppp样本,使用试剂盒内标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应孔内。同时加入稀释的标准品50μl于反应孔内。立即加入50μl的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时。而后甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。接着每孔加入80μl的亲和链酶素-hrp,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。孵育结束后甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干,重复此操作3次。每孔加入底物a、b各50μl,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照,然后取出酶标板,迅速加入50μl终止液,加入终止液后应立即测定结果,在450nm波长处使用酶标仪测定各孔的od值。而后使用450nm处读取的od值减去540nm处读取的od值,并以此值为纵坐标,凝血因子ii(fiia)标准品浓度为横坐标,绘得标准曲线,样品的fiia含量可根据其od值由标准曲线换算出相应的浓度。利用spss22.0中单因素方差分析(anova one-way,lsd)的方法分析各组fiia含量的差异,大鼠血浆中的fiia含量如表5所示。
[0116]
表5治疗大鼠血浆中的fiia含量
[0117][0118]
a)与生理盐水比,p＜0.01；n＝5
[0119]
表5的数据表明,在0.1μmol/kg口服剂量下化合物6a-d治疗4小时,可有效地降低大鼠血浆fiia的含量。可见,本发明有显著的技术效果。
[0120]
实施例35评价6a-d对大鼠血浆tf/fviia含量的影响
[0121]
实施例31采集的大鼠的全血4.0ml/只,置于装有0.4ml枸橼酸钠溶液(3.8％)的离心管中,于1000g离心15分钟后,吸取上层贫血小板血浆(ppp)。每个实验组取6只给药后大鼠的ppp样本,每孔加入100μl各样本及标准品,覆上盖板膜后37℃条件下孵育2小时,之后倾倒板内所有液体,不洗板,直接于每孔中加入100μl biotin溶液,覆上新的盖板膜后于37℃孵育1小时。而后弃去板内液体,每孔加入200μl洗液,静置2min后弃去洗液并拍干96孔板,如此重复3次。接着每孔加入100μl hrp-avidin覆上新的盖板膜后于37℃再孵育1小时。孵育结束后上述洗板操作重复5次,除净各孔内液体。每孔加入90μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺,覆上新的盖板膜后于37℃避光孵育20分钟,然后每孔加入50μl终止液,迅速使用酶标仪于450nm及540nm双波长下读取每孔od值。用450nm处读取的od值减去540nm处读取的od值,并以此值为纵坐标,tf/fviia标准品浓度为横坐标,绘得标准曲线,样品的tf/fviia含量可根据其od值由标准曲线换算出相应的浓度。利用spss 22.0中单因素方差分析(anova one-way,lsd)的方法分析各组tf/fviia含量的差异,血浆tf/fviia含量如表6所示。
[0122]
表6治疗大鼠血浆中的tf/fviia含量
[0123]
[0124][0125]
a)与生理盐水比,p＜0.01；n＝5
[0126]
表6的数据表明,在0.1μmol/kg口服剂量下化合物6a-d治疗4小时,可有效地降低大鼠血浆tf/fviia的含量。可见,本发明有显著的技术效果。
[0127]
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。