用于眼部疗法的高密度脂蛋白纳米颗粒和RNA模板化脂蛋白颗粒的制作方法

用于眼部疗法的高密度脂蛋白纳米颗粒和rna模板化脂蛋白颗粒
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2019年4月26日递交的美 国专利申请序列号62/839,579的申请日的权益。上述申请的内容通过 引用由此整体并入本文。
3.政府支持
4.本发明是在由美国国立卫生卫生研究院(nih)所资助的r01ey019463和r01 ca167041的政府支持下完成的。美国政府享有本发 明一定的权利。
5.政府支持
6.眼部病症(眼睛疾病)、感染和损伤难以治疗，并且，如果未经 治疗则可能对患者造成毁灭性影响(例如，无法修复的损伤、失明等)。 例如，糖尿病角膜是法定盲的主要原因。糖尿病患者可发展为增生型 糖尿病视网膜病变(pdr)，而pdr患者通常会在5年内失去视力 (1型和2型分别为43％和60％)。在这些患者中，高达70％有角膜 问题。例如，此类问题可能表现为角膜厚度增加；上皮缺陷、脆性和 侵蚀；溃疡；浮肿；浅层点状角膜炎；内皮变化；神经病；以及伤口 修复延迟和/或不完全。使这些问题进一步复杂化的是，许多眼部疾病 没有早期症状，这增加了一旦确诊(例如眼部病症)对高效治疗的需 求。由于眼部病症、感染和损伤的常规治疗经常无效，因此越来越需 要改进的疗法。
7.发明概述
8.本公开内容提供了用于治疗眼睛(例如，眼前段(例如，角膜、 角膜缘和结膜))的疾病或损伤的组合物和方法。这些区域的治疗在 有效性方面面临多重病症。例如，眼睛包括多种物理屏障(例如，泪 膜、脂质层、水层、粘液层、上皮层和细胞层(例如，基质等)以及 机械屏障(例如，瞬目反射)。因此，本公开内容提供了能够克服这 些问题以递送用于治疗的组合物的新组合物。
9.本公开内容至少部分基于使用与纳米结构(例如，高密度脂蛋白 (hdl-np)或模板化脂蛋白颗粒(tlp)结合的rna(例如，mirna) 来治疗(例如，局部)眼前段(例如，角膜、角膜缘和结膜)的疾病 或损伤的组合物或方法。
10.因此，本公开内容的一个方面提供了纳米结构，其包含高密度脂 蛋白纳米颗粒(hdl-np)，所述hdl-np包含核心、载脂蛋白、与 核心相连的脂质壳，其中脂质壳包含磷脂和与磷脂缔合的rna分子。 本公开内容的另一个方面提供了纳米结构，其包含模板化脂蛋白颗粒 (tlp)，所述tlp包含核心、载脂蛋白、与核心相连的脂质壳，其 中脂质壳包含磷脂和与磷脂缔合的rna分子。在一些实施方案中， 纳米结构中的载脂蛋白是载脂蛋白a-i(在本文中也可被称为apoa-i、 a-1或ai)。在一些实施方案中，纳米结构还包含胆固醇。
11.本公开内容的另一个方面提供了治疗患有眼部病症的受试者的方 法，其包括将有效量的如本文所述的纳米颗粒中的至少一种施用于受 试者，从而治疗眼部病症。
12.本公开内容的另一个方面提供了治疗患有眼部损伤或眼部感染的 受试者的方法，其包括将有效量的如本文所述的纳米颗粒中的至少一 种施用于受试者，从而治疗眼部损伤或眼部感染。在一些实施方案中， 眼部病症、眼部损伤或眼部感染分别是角膜病症、角
膜损伤或角膜感 染。在一些实施方案中，眼部病症是糖尿病角膜病变。在一些实施方 案中，纳米结构的施用借助于局部施用。
13.在本公开内容的一些实施方案中，rna分子是微rna(mirna)。 在一些实施方案中，mirna是mir-205或mir-146a。
14.在本发明的其他方面提供了阴离子纳米结构。阴离子纳米结构包 含阳离子脂质-rna复合物和模板化脂蛋白颗粒(tlp)的聚集体， 其中tlp包含作为合成hdl的阴离子tlp，所述合成hdl具有惰 性核心、围绕惰性核心的脂质壳和官能化至惰性核心的载脂蛋白，其 中rna分子是微rna(mirna)，并且其中阳离子脂质-核酸复合 物和tlp的聚集体形成阴离子纳米结构聚集体。
15.在一些实施方案中，阳离子脂质-核酸复合物由与阳离子脂质复合 的单链mirna组成。在一些实施方案中，mirna是mir-205或 mir-146a。在一些实施方案中，阳离子脂质-核酸复合物和tlp的聚 集体具有负的ζ电位。在一些实施方案中，阳离子脂质-rna的聚集 体包含阳离子脂质-有义链rna和阳离子脂质-反义链rna的混合物。 在一些实施方案中，rna没有经过化学修饰。在一些实施方案中， rna经过化学修饰。在一些实施方案中，磷脂选自1,2-二油酰基-sn
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甘油-3-磷酸胆碱(dopc)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
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n-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯](pdp-pe)。在一些实施方案中，纳 米结构包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)和mirna的交 替层。
[0016]
在本公开内容的另一个方面提供了药物组合物，其包含如本文所 述的纳米结构中的任一种或本文所公开的纳米结构的任意组合。
[0017]
在一些方面，本公开内容涉及治疗患有眼部炎症的受试者的方法， 其包括：将有效量的根据本公开内容的纳米结构中的任一种的纳米结 构施用于受试者，从而治疗眼部炎症。
[0018]
在一些方面，本公开内容涉及受试者的nfkb信号传导的方法， 其包括：将有效量的根据本公开内容的纳米结构中的任一种的纳米结 构施用于受试者，其中rna是mirna，并且其中mirna是mir-146a。
[0019]
在一些实施方案中，本公开内容的纳米结构用于治疗受试者。在 一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是 人。
[0020]
本文将更详细地描述这些和其他方面和实施方案。提供本公开内 容的一些示例性实施方案的描述仅用于说明目的而非意在限制。本公 开内容还包括另外的组合物和方法。
[0021]
以上概述旨在以非限制性方式说明本文公开的技术的一些实施方 案、优点、特征和用途。从详述、附图、实施例和权利要求书中，本 文公开的技术的其他实施方案、优点、特征和用途将是显而易见的。
[0022]
附图的简要说明
[0023]
以下附图构成本说明书的一部分，并被包括在内以进一步展示本 公开内容一定的方面，通过参考这些附图中的一幅图或多幅图并结合 在本文中呈现的具体实施方案的详述，能够更好地理解这些方面。为 清楚起见，并非每个组件都可以在每幅图中标出。应当理解，附图中 所示的数据决不以任何方式限制本公开内容的范围。在这些附图中：
[0024]
图1a-1b显示合成球形hdl-np(图1a)以及天然hdl和合成 hdl-np的特性比较(图
1b)。
[0025]
图2a-2c显示模板化脂蛋白颗粒(tlp)合成(图2a)和cl: 心磷脂(图2b)和18:2pg(图2c)的结构。
[0026]
图3a-3b显示了清道夫受体b1(sr-b1)作为tlp转运手段的 两种不同示意图(图3a-3b)。
[0027]
图4a-4d显示sr-b1在角膜上皮细胞上表达。人角膜(图4a)、 鼠角膜(图4b)和鼠角膜缘(图4c)的免疫荧光(if)染色显示上 皮细胞和基质中的sr-b1表达(箭头)。如蛋白质印迹所见，人角膜 上皮细胞(hcec)表达sr-b1蛋白(图4d)。
[0028]
图5包括人角膜上皮细胞(hcec)和在细胞的细胞质中积累的 高密度脂蛋白纳米颗粒(hdl-np)的图像。
[0029]
图6a-6f显示了akt减轻伤口愈合途径的示意图(图6a)，通 过图2a的方法合成mir-205 ai np的吸光度结果(图6b)，如蛋白 质印迹分析(图6c)并通过光密度测定法定量(图6d)所见，当用 mir-205-ai颗粒处理时，人角膜上皮细胞中的ship2蛋白表达降低， 如蛋白质印迹分析所见，当用mir-205-ai颗粒处理时，人角膜上皮 细胞中的磷酸-akt蛋白质表达增加(图6e)，并且mir-205 hdl-np 在处理后降低ship2并增加p-akt(图6f)。
[0030]
图7显示了mir-205-hdl-np快速封闭划痕伤口。
[0031]
图8包括显示与对照(纳米颗粒-nc-mir)相比，mir-205-hdl-np 快速封闭划痕伤口的图。
[0032]
图9包括显示mir-146降低nf-kb活性的图。
[0033]
图10包括apotome光学切片。每30分钟将1μm cy-3对照 rna-tlp应用于鼠的眼睛，共持续4小时。第一次应用tlp后24 小时，处死小鼠，切除眼睛，在oct中安装并切片。对载玻片染色： cy3(rna-tlp-红色)、角蛋白12(上皮-绿色)和dapi(细胞核
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蓝色)。
[0034]
图11a-g包括hdl-np(图11a)和cy3-hdl-np(图11b)对完整 的未受伤的角膜处理的荧光显微镜切片；在来自健康鼠的眼睛的角膜 上皮基底(b)、翼(w)、浅层(s)细胞和角质形成细胞(k)中检测到cy3 标记的ai(图11c：未处理；图11d：cy3-al np)；在来自受伤鼠 的眼睛的角膜上皮基底(b)、翼(w)、浅层(s)细胞和角质形成细胞(k) 中检测到cy3标记的ai(图11e：未处理；图11f：cy3-al np)； 和在受伤后的眼睛的结膜中检测到cy3标记的ai(图11g)。
[0035]
图12a-d包括显示hdl-np和mir-205-hdl-np表现出体内生 物活性的图(图12a-12d)。图12a包括在24小时内捕获的此类图 像。图12b包括显示伤口闭合百分比随时间变化的图。麻醉饮食诱导 肥胖(dio)并使用金刚石磨刀在角膜上皮中制造1mm伤口，小鼠 每30分钟接受一次mir-205-ai或无规则-mir-ai的局部应用，持续 2小时，对小鼠进行监测直至受伤后24小时(图12c-12d)。如荧光 素染料所见，与pbs相比，mir-205-ai和nc-mir-ai都增强了dio 小鼠的角膜伤口愈合(图12c)；与饲喂正常饮食(nd)的小鼠相比， dio小鼠抑制了角膜伤口愈合，有或没有nc-mir或缀合到颗粒的 mir-205的ai np在dio小鼠中以相同程度降低伤口愈合(图12d)。
[0036]
图13a-13c显示mir-205-tlp诱导p-akt并降低ship2蛋白表 达并且al np增加角膜上皮细胞中的p-akt、pepha2和dsg3，以及akt信号传导是增强伤口闭合所必需的。用反义链加有义链(双链) 的rna-tlp或两倍量的mir-205反义链(单链)或阴性对照处理 htcepi
即htert永生化人角膜上皮细胞。左边的泳道显示未处理的 (nt)细胞、阴性前体转染对照和mir-205转染对照(图13a)。与 peg-np相比，ai np增加人角膜上皮细胞中的磷酸-akt、磷酸-epha2 和dsg3(图13b)。与被pi3k/akt抑制剂ly294002消除的peg np 相比，用ai np处理的人角膜上皮细胞具有增强的划痕伤口闭合(图 13c)
[0037]
图14a-14e显示rna-tlp穿透受伤的角膜上皮；al np增加角 膜上皮划痕伤口前缘的f-肌动蛋白；并且al np伤口闭合需要 ephrin-a1的抑制和src的激活。在小鼠的角膜上制作了直径约1mm 的角膜划痕伤口。每30分钟将1μm cy3-对照-rna-tlp局部应用于 眼睛，持续4小时。受伤后24小时，切除眼睛，在oct中安装并切 片。对载玻片染色：cy3(rna-tlp-红色)、角蛋白12(上皮-绿色) 和dapi(细胞核-蓝色)(图14a)。用ai np处理的人角膜上皮细 胞在划痕伤口的前缘具有增强的f-肌动蛋白(图14b：peg-np；图 14c：hdl-np)。与被ephrin-a1的过表达(图14d)或src抑制剂 (pp2)(图14e)消除peg np相比，用ai np处理的人角膜上皮 细胞具有增强的划痕伤口闭合。
[0038]
图15显示rna-tlp穿透受伤的皮肤。在小鼠的侧腹上造了一个 穿孔伤。每30分钟将1μm cy3-对照-rna-tlp局部应用于伤口，持 续4小时。受伤后24小时，切除皮肤，在oct(最佳切割温度化合 物)中安装并切片。对载玻片染色：cy3(rna-tlp-红色)、角蛋白 15(基底角质形成细胞-绿色)、角蛋白10(表皮角质形成细胞-白色) 和dapi(细胞核-蓝色)。
[0039]
图16a-16g显示mir-146a作用于nfkb信号通路(图16a)； mir-146a-tlp抑制lps诱导的nf-κb信号传导(图16b-16c)， j774-dual小鼠巨噬细胞用0.5ng/ml lps(o111:b4)预处理1小时， 然后40nm mir-146a-tlp、ctrl-tlp或tlp单独处理，或与lipofectamine一起递送mir-146a或对照mirna 24小时。 quanti-blue测定法(invivogen)用于测定nf-κb seap(分泌型胚 胎碱性磷酸酶)活性；用pbs或peg np处理的眼睛在受伤后7天没 有清除角膜炎症，但是ai np显著减轻了眼睛的炎症(图16d-16e)； 受伤后7天用peg np或ai np处理的眼睛的角膜h&e染色显示， 与peg np处理的眼睛相比，ai np处理的眼睛中炎症的清除增强(图 16f)；并且受伤后3天，用ai np处理的角膜的炎性细胞因子(il1a、 il1b、il6、inos、mmp9和ccl2)显著减少(图16g)。
[0040]
图17包括mir-205-tlp的紫外可见光谱。mir-205-tlp和 nc-tlp具有预期的紫外可见光谱，具有在520nm(aunp)和在260 nm的峰，表明tlp上存在rna。
[0041]
图18包括mir-146a-tlp的紫外可见光谱。mir-146a-tlp和 ctrl-tlp具有这样的紫外可见光谱，具有在520nm(aunp)和在260 nm(rna)的峰，表明tlp上存在rna。
[0042]
发明详述
[0043]
本公开内容提供了使用与纳米结构(例如，高密度脂蛋白 (hdl-np)或模板化脂蛋白颗粒(tlp)结合的rna(例如，微 rna(mirna))治疗(例如，局部)眼前段(例如，角膜、角膜缘 和结膜)的疾病或损伤的组合物或方法。在一些实施方案中，本公开 内容的纳米结构用于眼部疾病的预防性治疗。
[0044]
通过滴眼液向眼睛递送治疗面临许多挑战，包括眼部屏障(例如 泪膜和细胞层)、从眼睛中快速清除以及导致少量药物递送至角膜的 失误。前表面上皮与泪膜一起为外部环境提供了有效的屏障，有助于 维持角膜的透明度和刚性。虽然这种屏障对眼睛的健康至关重要，但 矛盾的是，它能够阻止对抗各种疾病状态(诸如炎症和感染)所必需 的药物递送。瞬目反射进一步使递送变差，瞬目反射除了从眼表去除 碎屑和微生物外，还能够去除
局部施加的药物。微rna(mirna) 是短的(长度约22个核苷酸)、“非编码”或“非信使”rna，它们是rna干扰(rnai)沉默机制的一部分。mirna通过mrna靶向和 翻译抑制来控制基因表达，从而调节生物内稳态。因此，它们有助于 调节正常和疾病情况下的各种生物过程。因此，mirna作为潜在的治 疗剂具有广阔的前景。实现这一目标的一个主要病症是以稳定形式有 效地配制治疗性mirna并将其递送到靶细胞的细胞质中。由于这些 挑战，以前的与mirna相关的眼睛治疗尚未局部提供。
[0045]
高密度脂蛋白(hdl)是天然的体内rna递送媒介物。发现从 人血清中分离的天然高密度脂蛋白(hdl)含有mirna，并且发现 与裸mirna相比，这些hdl结合的mirna具有更高的稳定性。此 外，天然hdl将结合的mirna传递给表达hdl的高亲和力b-1型 清道夫受体(scarb1)受体的细胞。scarb1在角膜上皮细胞上表 达。
[0046]
本文发现，使用球形、功能性、hdl样纳米颗粒(hdl-np)可 以将rna(例如mirna)局部递送至眼睛(优选角膜)，对糖尿病 小鼠角膜的伤口愈合具有积极影响。hdl-np不仅运输内源性mirna (内源性mirna可能因疾病状态而异)，而且还可以将mirna递送 至具有功能基因调控后果(例如，影响表达)的受体细胞。
[0047]
受hdl特征的启发，模板化脂蛋白颗粒(tlp)被开发出来， 在用阳离子脂质配制后，采用rna双链体对的单链和单链互补物进 行自组装。由此产生的rna模板化脂蛋白颗粒(rna-tlp)是阴离 子的，并且在rna组装和功能方面是可调的。数据显示，在角膜上 皮细胞系中，mirna-205(mir-205)-tlp主动靶向和下调mir-205， 靶向ship-2，并增加磷酸化-akt(p-akt)。在体内，将与经cy3荧光 团修饰的非靶向rna序列缀合的tlp局部施用于眼睛，证实cy3标 记的rna在角膜上皮中、特别是在基底细胞和角膜细胞中的穿透， 并在角膜缘上皮和基质中摄取。这是一种模块化方法，通过将rna 的单链互补物自组装成主动靶向阴离子递送媒介物，其在体外有效调 节靶基因表达并在体内穿透角膜上皮，从而将局部rna递送至眼睛。
[0048]
本文考虑的rna模板化脂蛋白颗粒(rna-tlp)是合成的受生 物启发的脂蛋白和阳离子脂质-rna组装体的组合。它们具有可控自 组装的优势和rna-tlp的功能可调性。此外，rna-tlp(如hdl-np) 的模块化性质允许在眼部施用后轻松交换治疗性rna货物、主动细 胞靶向、有效靶基因调控和体内功效。
[0049]
在一些实施方案中，合成rna-tlp的过程包括固体颗粒例如5 纳米(nm)直径的金纳米颗粒(au np)模板与载脂蛋白a-i(apoa-i)、两 种磷脂和胆固醇的混合物的表面官能化。外部磷脂和胆固醇与核酸有 利地结合。在合成过程期间，由于tlp和rna带负电荷，已知复合 rna的阳离子脂质(例如dotap)被添加到rna的在水或磷酸盐 缓冲盐水(pbs)中的混合物中。与例如在pbs中的dotap-rna 混合的tlp变得不可逆地聚集并沉淀。
[0050]
几乎所有为眼部递送rna开发的技术都基于阳离子脂质或阳离 子聚合物。大多数情况下，由于这些媒介物的阳离子性质和合成特性， 它们可能具有剧毒，并且通常不靶向疾病特定部位。本发明的组合物 克服了眼部rna治疗的这些病症中的许多病症，因为纳米结构被这 样配制，使得它们是阴离子并且通过位于细胞表面的特定受体而固有 地靶向。
[0051]
许多rna疗法是围绕特定的疾病靶标而设计的，然而，本文公 开的纳米结构是高度模块化的，因此它们能够被定制以结合可能的任 何一个或多个感兴趣的靶标。
[0052]
现存的技术不容易扩展并且具有未知的生物成分，这可能导致体 内毒性。相比之
下，本文公开的纳米结构已被证明在体内没有固有毒 性，并且被配制为模拟天然rna递送媒介物以避免媒介物相关毒性。
[0053]
纳米结构
[0054]
在一些方面，本公开内容涉及纳米结构，其包含：高密度脂蛋白 纳米颗粒(hdl-np)，其包含核心、载脂蛋白、与核心相连的脂质 壳，其中脂质壳包含磷脂和与磷脂缔合的rna分子。
[0055]
如本文所用，术语“纳米结构”是指能够与核酸组合的高密度脂蛋 白样纳米颗粒(hdl-np)或模板化脂蛋白颗粒(tlp)。本公开内 容的纳米结构被认为与rna分子(例如，mirna)复合。如本文所 用，术语“hdl-np”和“hdl样纳米颗粒”可互换使用。高密度脂蛋白 (hdl)是天然循环纳米颗粒，可携带胆固醇、靶向特定细胞类型， 并在许多疾病过程中发挥重要作用。因此，合成的hdl模拟物已成 为有前途的治疗剂。然而，迄今为止的方法无法再现球形hdl的关 键特征，球形hdl是最丰富的hdl种类，并且具有特别的临床重要 性。如本文所用，术语“缔合”用于指纳米结构中与脂质复合的脂质。 如本文所用，术语“复合”和“结合”可互换使用。
[0056]
在一些方面，本公开内容涉及由模板化脂蛋白颗粒(tlp)组成 的纳米结构，所述模板化脂蛋白颗粒(tlp)包含核心、载脂蛋白、 与核心相连的脂质壳，其中tlp通过阳离子脂质复合到rna分子。 在一些实施方案中，tlp与rna形成阴离子纳米结构聚集体。该纳 米结构包含阳离子脂质-核酸复合物和模板化脂蛋白颗粒(tlp)的聚 集体，其中tlp包含作为合成hdl的阴离子tlp，所述合成hdl 具有惰性核心、围绕惰性核心的脂质壳和官能化至所述惰性核心的载 脂蛋白；并且阳离子脂质-核酸复合物由与阳离子脂质复合的单链或双 链rna组成，并且其中阳离子脂质-核酸复合物和tlp的聚集体具有 负的ζ-电位并形成阴离子纳米结构聚集体。在一些实施方案中，双链 体rna的每条链分别与阳离子脂质缀合。在一些实施方案中，rna 没有经过化学修饰。在其他实施方案中，它经过化学修饰。在一些实 施方案中，惰性核心是金属，例如金。在一些实施方案中，磷脂是1,2
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二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3
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磷酸乙醇胺-n-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯](pdp-pe)。在一些实施 方案中，纳米结构包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)和 rna的交替层。
[0057]
在一些实施方案中，纳米结构包括阳离子脂质。阳离子脂质可以 是，例如，n,n-二油基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、n,n-二硬脂 基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)
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n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)、n-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-n,n,n
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三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺 (dodma)、1,2-二亚油酰基氧基-n,n-二甲氨基丙烷(dlindma)、 1,2-二亚油基氧基-n,n-二甲氨基丙烷(dlendma)、1,2-二亚油酰基 氨基甲酰氧基-3-二甲氨基丙烷(dlin-c-dap)、1,2-二亚油酰基氧基
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3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)、1,2-二亚油酰基氧基-3
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吗啉代丙烷(dlin-ma)、1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷 (dlindap)、1,2-二亚油酰基硫代-3-二甲氨基丙烷(dlin-s-dma)、 1-亚油酰基-2-亚油酰基氧基-3-二甲氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1,2
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二亚油酰基氧基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(dlin-tma.c1)、1,2-二 亚油酰基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(dlin-tap.c1)、1,2-二亚油酰 基氧基-3-(n-甲基哌嗪)丙烷(dlin-mpz)，或3-(n,n-二亚油酰基氨 基)-1,2-丙二醇(dlinap)、3-(n,n-二油基氨基)-1,2-丙二醇(doap)、 1,2-二
亚油酰基氧代-3-(2-n,n-二甲氨基)乙氧基丙烷 (dlin-eg-dma)、1,2-二亚油酰基氧基-n,n-二甲氨基丙烷 (dlindma)、2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环 (dlin-k-dma)或它们的类似物，(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二 ((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢
‑‑
3ah-环戊[d][1,3]二酚-5-胺， (6z,9z,28z,31z)-三十一碳-6,9,28,31-四烯-19-yl-4-(二甲氨基)丁酸酯， 或它们的混合物。
[0058]
除了上述具体描述以外，在约生理ph带有净正电荷的其他阳离 子脂质也可包括在脂质纳米颗粒中。这样的阳离子脂质包括但不限于 n,n-二油基-n,n-二甲基氯化铵(“dodac”)；n-(2,3-二油基氧基)丙 基-n,n-n-三甲基氯化铵(“dotma”)；n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴 化铵(“ddab”)；n-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化 铵(“dotap”)；1,2-二油基氧基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐 (“dotap.cl”)；3.β.-(n
‑‑
(n',n'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇 (“dc-chol”)、n-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-n-2-(精胺甲酰胺基)乙 基)-n,n-二甲基-三氟乙酸铵(“dospa”)、双十八烷基酰胺基甘氨酰 羧基精胺(“dogs”)、1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(“dope”)、1,2-二油酰基-3-二甲基丙烷铵(“dodap”)、n,n-二甲基-2,3-二油基 氧基)丙胺(“dodma”)、n-(1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙-3-基)-n,n-二 甲基-n-羟乙基溴化铵(“dmrie”)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆 碱(“dopc”)。
[0059]
在本公开内容的一些方面，纳米结构与包含以以下的摩尔比与核 酸(例如，rna)混合的阳离子脂质(例如，dotap)：约1:1、约 2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、 约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约16:1、约17:1、约 18:1、约19:1、约20:1、约21:1、约22:1、约23:1、约24:1、约25:1、 约26:1、约27:1、约28:1、约29:1、约30:1、约31:1、约32:1、约 33:1、约34:1、约35:1、约36:1、约37:1、约38:1、约39:1、约40:1、 约41:1、约42:1、约43:1、约44:1、约45:1、约46:1、约47:1、约 48:1、约49:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1或约100:1。 在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，dotap)以10:1、20:1、30:1 或40:1的摩尔比与核酸(例如，rna)混合。
[0060]“两亲脂质”是指任何合适的材料，其中脂质材料的疏水部分朝向 疏水相，而亲水部分朝向水相。此类化合物包括但不限于磷脂、氨基 脂和鞘脂。代表性的磷脂包括鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、 溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油 酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱或二亚油酰基磷脂酰胆碱、 单磷酰脂质a(mpla)或吡喃葡糖苷脂质a(gla)。
[0061]
在一些实施方案中，本公开内容的纳米结构包含载脂蛋白。载脂 蛋白可以是载脂蛋白a(例如apo ai、apo a-ii、apo a-iv和apo a-v)、 载脂蛋白b(例如apo b48和apo b100)、载脂蛋白c(例如apo c-i、 apo c-ii、apo c-iii和apo c-iv)，以及载脂蛋白d、e和h。另外， 本文所述的结构可以包括一种或多种载脂蛋白(例如上述一种)的肽 类似物。当然，其他蛋白质(例如，非载脂蛋白)也可以包含在本文 所述的纳米结构中。在一些实施方案中，本公开内容的纳米结构包含 载脂蛋白a-i(apoa-i)，其是hdl的主要蛋白质成分。本公开内容 的纳米结构能够以高亲和力结合scarb1。本公开内容的纳米结构具 有降低的毒性。在一些实施方案中，载脂蛋白是载脂蛋白a-i。
[0062]
本公开内容的纳米结构用于治疗疾病、感染和损伤。本文考虑的 疾病、感染和损
伤包括但不限于角膜损伤、干眼症、角膜炎、结膜炎、 白内障、青光眼、眼睛炎症、葡萄膜炎和虹膜炎。
[0063]
还可以控制结合到结构上的寡核苷酸的表面密度。可以使用诸如 静电吸附或化学吸附技术(例如，au-sh缀合化学)的技术将诸如 dna、rna或sirna的寡核苷酸与纳米结构核心相连。
[0064]
高密度脂蛋白纳米颗粒(hdl np)核心
[0065]
纳米结构的核心可以是中空的或纳米结构核心。纳米结构的核心 无论是纳米结构核心还是中空核心，都可以具有任何合适的形状和/ 或尺寸。例如，核心可以基本上是球形、非球形、椭圆形、棒状、棱 锥形、立方体状、盘状、线状或不规则形状。在一些实施方案中，核 心包括基本上球形的形状。在一些实施方案中，核心包括基本上非球 形的形状。在一些实施方案中，核心包括基本上椭圆形的形状。在一 些实施方案中，核心包括基本上棒状的形状。在一些实施方案中，核 心包括基本上棱锥形的形状。在一些实施方案中，核心包括基本上立 方体状的形状。在一些实施方案中，核心包括基本上盘状的形状。在 一些实施方案中，核心包括基本上线状的形状。在一些实施方案中， 核心包括基本上不规则的形状。核心(例如，纳米结构核心或中空核 心)可具有例如小于或等于约500nm、小于或等于约500nm的最大横 截面尺寸(或有时，最小横截面尺寸)等于约250nm、小于或等于约 100nm、小于或等于约75nm、小于或等于约50nm、小于或等于约 40nm、小于或等于约35nm、小于或等于约30nm、小于或等于约25nm、 小于或等于约20nm、小于或等于约15nm或小于或等于约5nm。在 一些情况下，核心具有大于约1:1、大于3:1或大于5:1的纵横比。如 本文所用，“纵横比”是指长度与宽度的比值，其中长度和宽度彼此垂 直测量，并且长度是指最长的线性测量尺寸。
[0066]
核心可由无机材料形成。无机材料可以包括例如金属(例如，ag、 au、pt、fe、cr、co、ni、cu、zn和其他过渡金属)、半导体(例 如，硅、硅化合物和合金、硒化镉、硫化镉、砷化铟和磷化铟)或绝 缘体(例如，陶瓷，诸如氧化硅)。在一些实施方案中，核心是金(au)。 无机材料可以任何合适的量存在于核心中，例如至少1重量％(即 1wt％)、5wt％、10wt％、25wt％、50wt％、75wt％、90wt％或99wt％。 在一个实施方案中，核心由100wt％的无机材料形成。在一些情况下， 纳米结构核心可以是量子点、碳纳米管、碳纳米线或碳纳米棒的形式。 在一些情况下，纳米结构核心包含非生物来源的材料或由非生物来源 的材料形成。在一些实施方案中，纳米结构包括或可由一种或多种有 机材料例如合成聚合物和/或天然聚合物形成。合成聚合物的实例包括 不可降解聚合物如聚甲基丙烯酸酯和可降解聚合物如聚乳酸、聚乙醇 酸及其共聚物。天然聚合物的例子包括透明质酸、壳聚糖和胶原蛋白。 在某些实施方案中，结构、纳米结构或纳米颗粒核心不包括聚合材料 (例如，它是非聚合的)。
[0067]
在一些实施方案中，本文公开的结构、纳米结构或纳米颗粒具有 相对于金核心60-250倍摩尔过量的脂质。在一些实施方案中，本文公 开的结构、纳米结构或纳米颗粒具有相对于核心(例如，金核心) 60-200、60-150、60-100、60-75、70-200、70-150、70-100、70-75、 80-250、80-200、80-150、80-100、90-250、90-200、90-150、90-100、 100-250、100-200、100-150、62.5、125、187.5或250倍摩尔过量的 脂质。
[0068]
高密度脂蛋白纳米颗粒(hdl np)壳
[0069]
hdl样纳米颗粒(也称为hdl纳米颗粒)在形状、大小和表面 组成(例如，载脂蛋白
a-i、磷脂)方面模仿天然球形hdl。本文的 纳米结构还可包括蛋白质，例如载脂蛋白(例如，载脂蛋白a-i)。 本文的纳米结构也可以是富含胆固醇的(例如，具有包含胆固醇的结 构)。壳可以具有内表面(也称为内小叶)和外表面(也称为外小叶)， 使得治疗剂和/或载脂蛋白可以被吸附在壳上和/或并入在壳的内表面 和外表面之间。
[0070]
现在描述可用于在本文中描述的这些方法中的纳米结构的实例。 结构、纳米结构或纳米颗粒(例如，合成结构或合成纳米结构)具有 核心和围绕核心的壳。在核心是纳米结构的实施方案中，核心包括一 个表面，一种或多种组分可以任选地与该表面相连。例如，在一些情 况下，核心是被壳围绕的纳米结构，壳包括内表面和外表面。壳可以 至少部分地由一种或多种组分形成，例如多种脂质，它们可以任选地 彼此缔合和/或与核心的表面缔合。例如，组分可以通过共价连接至核 心、物理吸附、化学吸附或通过离子相互作用、疏水和/或亲水相互作 用、静电相互作用、范德华相互作用或其组合与核心相连而与核心缔 合。在一个特定的实施方案中，核心包括金纳米结构并且壳通过金
‑ꢀ
硫醇键与核心相连。
[0071]
许多治疗剂通常与纳米结构的壳相缔合。例如，每个结构可以缔 合至少20种治疗剂。一般而言，每个结构可以缔合至少20-30、20-40、 20-50、25-30、25-40、25-50、30-40、30-50、35-40、35-50、40-45、 40-50、45-50、50-100或30-100种治疗剂。
[0072]
任选地，组分可以彼此交联。例如，壳组分的交联能够允许控制 物质进入壳中或壳外部区域与壳内部区域之间的传输。例如，相对大 量的交联可允许某些小的但不是大的分子进入或穿过壳，而相对低的 交联或没有交联可以允许较大的分子进入或穿过壳。此外，形成壳的 组分可以是单层或多层的形式，这也能够促进或阻碍分子的运输或隔 离。如本文所述，在一个示例性实施方案中，壳包括脂质双层，其被 布置成隔离胆固醇和/或控制胆固醇流出细胞。
[0073]
应该理解的是，围绕核心的壳不需要完全围绕核心，但是这样的 实施方案是可能的并且被考虑在内。例如，壳可围绕核心的表面积的 至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。 在一些情况下，壳基本上围绕核心。在其他情况下，壳完全围绕核心。 在某些情况下，壳的组分可以均匀地分布在核的表面上，而在其他情 况下可以不均匀地分布。例如，在一些情况下，外壳可以包括不包括 任何材料的部分(例如，孔)。如果需要，可将壳设计成允许某些分 子和组分穿透和/或运输进入或离开壳，但可以防止其他分子和组分穿 透和/或运输进入或离开壳。某些分子穿透和/或运输进入和/或穿过壳 的能力可取决于例如形成壳的组分的堆积密度和形成壳的组分的化学 和物理性质。在一些实施方案中，壳可以包括一层材料或多层材料。
[0074]
此外，结构的壳可以具有任何合适的厚度。例如，壳的厚度可以 是至少10埃、至少0.1nm、至少1nm、至少2nm、至少5nm、至少 7nm、至少10nm、至少15nm、至少20nm、至少30nm、至少50nm、 至少100nm或至少200nm(例如，从壳的最内表面到最外表面)。在 一些情况下，壳的厚度小于200nm、小于100nm、小于50nm、小于 30nm、小于20nm、小于15nm、小于10nm、小于7nm、小于5nm、 小于3nm、小于2nm或小于1nm(例如，从壳的最内表面到最外表 面)。这种厚度可以在如本文所述的分子隔离之前或之后确定。
[0075]
本文所述结构的壳可包含任何合适的材料，例如疏水材料、亲水 材料和/或两亲材料。尽管壳可包括一种或多种无机材料，例如上面针 对纳米结构核列出的那些，但在许多实施方案中，壳包括有机材料， 例如脂质或某些聚合物。可以通过包括胆固醇进一步改
变纳米颗粒的 结合亲和力(例如，调节脂质单层或双层的流动性)。
[0076]
在一组实施方案中，本文所述的结构或其一部分(例如结构的壳) 包括一种或多种天然或合成脂质或脂质类似物(即，亲脂性分子)。 一种或多种脂质和/或脂质类似物可以形成结构的单层(例如，脂质单 层)或多层(例如，双层、脂质双层)。在形成多层的一些情况下， 天然或合成脂质或脂质类似物相互交错(例如，在不同层之间)。天 然或合成脂质或脂质类似物的非限制性实例包括脂肪酰基、甘油脂、 甘油磷脂、鞘脂、糖脂和聚酮化合物(源自酮酰基亚基的缩合)，以 及固醇脂质和异戊二烯脂(源自异戊二烯亚基的缩合)。
[0077]
在一些实施方案中，壳包括聚合物。例如，可以使用两亲聚合物。 聚合物可以是二嵌段共聚物、三嵌段共聚物等，例如，其中一个嵌段 是疏水性聚合物而另一个嵌段是亲水性聚合物。例如，聚合物可以是 α-羟基酸(例如乳酸)和聚乙二醇的共聚物。在一些情况下，壳包括 疏水聚合物，例如可以包括某些丙烯酸、酰胺和酰亚胺、碳酸酯、二 烯、酯、醚、碳氟化合物、烯烃、苯乙烯、乙烯基缩醛、乙烯基和偏 二氯乙烯、乙烯基酯、乙烯基醚和酮，以及乙烯基吡啶和乙烯基吡咯 烷酮聚合物。在其他情况下，壳包括亲水性聚合物，例如包括某些丙 烯酸类、胺类、醚类、苯乙烯类、乙烯酸类和乙烯醇类的聚合物。聚 合物可以带电或不带电。如本文所指出的，可以选择壳的特定组分以 赋予结构某些功能。
[0078]
rna
[0079]
人们对开发天然rna递送载体的合成模拟物有着浓厚的兴趣。 特别是，高密度脂蛋白(hdl)很有吸引力，因为它们自然地结合内 源性rna，如微rna(mirna)，稳定单链rna(ssrna)以防止 核酸酶降解，并将它们递送到靶细胞以调节基因表达。hdl介导的 rna递送取决于b-1型清道夫受体(本文也称为scarb1和/或 sr-b1)的靶细胞表达。b i型清道夫受体(sr-bi)是一种在许多细 胞类型和组织(包括眼组织)中发现的完整膜蛋白。它是成熟的高亲 和力受体，例如在其表面具有载脂蛋白a-i(apoa-i)的成熟hdl。 sr-b1促进从高密度脂蛋白中摄取胆固醇酯。此外，sr-b1对脂溶性 维生素的摄取至关重要。除了结合hdl以外，sr-b1还结合各种大 小的阴离子分子和配体。
[0080]
术语“微rna”和“mirna”在本文中可互换使用，是指短(例如， 长度约20至约24个核苷酸)非编码核糖核酸(rna)，其通过影响 mrna的稳定性和翻译而参与多细胞生物中基因表达转录后调控。 mirna由rna聚合酶ii作为加帽和多腺苷酸化初级转录物 (pri-mirna)的一部分转录，初级转录物可以是蛋白质编码或非编 码的。初级转录物被drosha核糖核酸酶iii酶切割，产生一个长约70 个核苷酸的茎环前体mirna(pre-mirna)，其在rnai途径中被进 一步加工。作为该途径的一部分，pre-mirna被细胞质dicer核糖核 酸酶切割以产生成熟的mirna和反义mirna星(mirna*)产物。 成熟的mirna被整合到rna诱导的沉默复合体(risc)中，它通 过与mirna的不完全碱基配对(即部分互补)识别靶mrna，最常 见的是导致靶mrna的翻译抑制或不稳定。最常通过mirna在靶 mrna的3'非翻译区(utr)上的结合观察到这种机制，它可以通过 抑制翻译(例如，通过阻止核糖体进入翻译)或直接降低基因表达导 致转录物的降解。该术语(即，mirna)在本文中可用于任何形式的 主题mirna(例如，前体、初级和/或成熟mirna)。在一些实施方 案中，rna分子是mirna。在一些实施方案中，mirna是mir-146a。 在一些实施方案中，mir-146a具有包含seq id no：1的序列的序列。 在一些实施方案中，mirna是mir-205。在一些实施方案中，mir-205 具有包含seq id no：2的序列的序列。在一些实施方案中，单个纳 米结构具有与其复合的两种不同类型的rna分
子(例如，mirna)， 其中rna分子的类型具有不同的功能(例如，抗炎、血管抑制)。
[0081]
磷脂
[0082]
磷脂是一类包含疏水性脂肪酸链和具有磷酸基团和甘油分子的亲 水性头部的脂质。出于不同的原因，包括但不限于提高生物利用度、 降低毒性和增加跨膜渗透性，磷脂已被广泛用于制备脂质体、乙醇酸 体和其他纳米制剂的局部、口服和肠胃外药物。天然存在的磷脂是脂 肪样的甘油三酯，含有两个长链脂肪酸和一个与碱相连的磷酸基团。 它们存在于所有动物和植物细胞中，尤其是大脑、心脏、肝脏、蛋黄 以及大豆中。天然存在的磷脂中最重要的磷脂是脑磷脂和卵磷脂，其 中胆胺(colamine)或喹啉(quoline)作为碱存在。
[0083]
磷脂的非限制性实例包括，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸硫代乙 醇(dppte)、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、卵磷脂、β,γ-二棕榈酰 基-α-卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、n-(2,3-二(9-(z)-十八 碳烯氧基))-丙-1-基-n,n,n-三甲基氯化铵、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、 溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、脑磷脂、心磷脂、脑苷脂、磷酸二 鲸蜡脂、二油酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基 磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱、 二-硬脂酰基-磷脂酰胆碱、硬脂酰基-棕榈酰基-磷脂酰胆碱、二-棕榈 酰基-磷脂酰乙醇胺、二-硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、二-肉豆蔻酰基-磷 脂酰丝氨酸、二-油基-磷脂酰胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸硫 代乙醇(dppte)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[3-(2
‑ꢀ
吡啶二硫代)丙酸酯](16:0pdp pe)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸 乙醇胺-n-[3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯](18:1pdp pe)，以及它们的组 合或衍生物。
[0084]
药物组合物
[0085]
在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如本文公开的任何纳米 结构和药学上可接受的赋形剂的组合物。如本文所述，“药物组合物
”ꢀ
或“药学上可接受的”组合物包含治疗有效量的一种或多种本文所述的 结构(例如，纳米结构)，与一种或多种药学上可接受的赋形剂(例 如，载体、添加剂和/或稀释剂)一起配制。应当理解的是，本文所述 的任何合适的结构均可用于此类药物组合物，包括结合附图所述的那 些。在一些情况下，药物组合物中的结构具有包含无机材料的纳米结 构核心和基本上围绕并与纳米结构核心相连的壳。
[0086]
在一些实施方案中，将药物组合物配制成液体或凝胶形式：口服 施用，例如，灌洗剂(水溶液或非水溶液或混悬液)，肠胃外施用， 例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，如，例如，无菌溶液或 悬浮液，或缓释制剂；局部应用，例如，作为施加于眼睛的霜剂、软 膏剂或喷雾剂；眼部或透皮。
[0087]
本文所用短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内， 适用于与人和动物的组织接触使用而没有过多毒性、刺激、过敏反应 或其他问题或并发症、与合理的收益/风险比相称的那些结构、材料、 组合物和/或剂型。
[0088]
如本文使用的短语“药学上可接受的载体”是指一种药学上可接受 的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂 或溶剂包封材料，其参与从身体的一个器官或部分携带或运输主题化 合物到身体的另一个器官或部分。在与制剂的其他成分相容并且对患 者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可用作药学上可接受 的载体的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉， 如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、 乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；
滑石；赋形剂， 如可可脂和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄 榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山 梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯、月桂酸乙酯；琼 脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水； 林格氏溶液；乙醇；ph缓冲溶液；聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酐类； 和其他用于药物制剂的无毒相容物质。
[0089]
在一些实施方案中，本发明的药物组合物具有药学上可接受的赋 形剂。考虑的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括：水、缓冲 盐水、盐水、水、乳酸林格氏溶液、细胞培养基、血清、稀释血清、 霜剂、聚合物和水凝胶。
[0090]
润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及 着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和加香剂、防腐剂和抗氧 化剂也可以存在于组合物中。
[0091]
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏 血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶 性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(bha)、丁基 羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属 螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、 磷酸等。
[0092]
本文所述的结构可以口服施用、肠胃外施用、皮下施用和/或静脉 内施用。在某些实施方案中，结构或药物制剂经口施用。在其他实施 方案中，结构或药物制剂静脉内施用。替代的施用途径包括舌下、肌 内和透皮施用。
[0093]
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗 的宿主和特定的施用方式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型 的活性成分的量一般是产生治疗效果的化合物的量。一般而言，该量 将是活性成分的约1％至约99％、约5％至约70％或约10％至约30％。
[0094]
用于施用本文所述结构的液体剂型可包括药学上可接受的乳液、 微乳液、溶液、分散体、悬浮液、糖浆和酏剂。除了本发明的结构外， 液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶 剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲 酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米 油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙 二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。
[0095]
除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化 剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、加香剂和防腐剂。
[0096]
除活性化合物外，悬浮液还可包含悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂 醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、 膨润土、琼脂和黄蓍胶，以及它们的混合物。
[0097]
用于本文所述结构的局部或透皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、 软膏剂、糊剂、泡沫剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂、滴剂和 吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体以及可 能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
[0098]
除了本发明的结构之外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂可以包含 赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维 素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌，或 它们的混合物。本文考虑的眼用制剂包括眼膏剂、滴眼液、粉末、溶 液等。
[0099]
适合肠胃外施用的本文所述的药物组合物包含与以下组合的一种 或多种本发明
结构：一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水 性溶液、分散体、悬浮液或乳液，或可在快要使用前重构为无菌可注 射溶液或分散体的无菌粉末，其可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、 抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。
[0100]
可用于本文所述的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例 包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的 混合物、植物油，如橄榄油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如， 可以通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需的 粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
[0101]
这些组合物还可包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散 剂。通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、 苯酚山梨酸等，可以促进防止微生物对本发明结构的作用。还可能希 望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式 的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实 现。
[0102]
当本文所述的结构作为药物施用于人和动物时，它们可以本身或 作为含有例如约0.1％至约99.5％、约0.5％至约90％等与药学上可接 受的载体组合的结构的药物组合物给予。
[0103]
根据待治疗的病况，施用可以是局部施用(例如，特定区域、生 理系统、组织、器官或细胞类型)或全身施用。例如，组合物可以通 过肠胃外注射、植入、口服、阴道、直肠、口腔、肺、局部、鼻、经 皮、手术施用或其中实现了组合物接近靶标的任何其他施用方法施用。 可与本发明一起使用的肠胃外方式的实例包括静脉内、皮内、皮下、 腔内、肌肉内、腹膜内、硬膜外或鞘内。植入方式的实例包括任何可 植入或可注射的药物递送系统。由于对患者的方便以及施用方案，口 服施用可能对一些治疗有用。
[0104]
不管选择的施用途径如何，本文所述的可以以合适的水合形式使 用的结构和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规 方法配制成药学上可接受的剂型。
[0105]
本文所述的组合物可以按剂量给予，例如以最大量同时避免或最 小化任何潜在的有害副作用。组合物可以有效量单独施用或与其他化 合物组合施用。例如，当治疗癌症时，组合物可包括本文所述的结构 和可用于治疗癌症的其他化合物的混合物。当治疗与异常脂质水平相 关的病况时，组合物可包括本文所述的结构和可用于降低脂质水平的 其他化合物(例如，降胆固醇剂)。
[0106]
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是这样的本发明的纳 米结构或组合物的量，其在施用于患者时提供对所治疗的疾病状态或 病症的治疗或以其他方式提供期望的效果(例如，诱导有效的免疫反 应，改善疾病的症状)。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根 据化合物、疾病状态及其严重性、待治疗患者的年龄等而变化。治疗 有效量可由本领域普通技术人员根据他们的知识和本公开内容常规确 定。
[0107]
方法
[0108]
在优选的实施方案中，本公开内容的纳米结构用于局部治疗。当 前眼部疾病的局部治疗，例如滴眼液、眼药膏和凝胶，仅将其有效载 荷的约5％输送到前眼房，并且不容易进入角膜上皮。本公开内容的 纳米结构(例如，rna-tlp)在体内被角膜上皮中的细胞吸收。在一 些实施方案中，如本文所述的纳米结构和/或组合物被配制用于局部应 用。在一些实施方案中，如本文所述的纳米结构和/或组合物被局部施 加。
[0109]
糖尿病患者的眼部治疗
[0110]
在一些实施方案中，本公开内容的纳米结构可用于治疗糖尿病受 试者的眼部病症或眼部疾病，例如糖尿病角膜病变。糖尿病角膜病变 是糖尿病患者发生的眼部并发症。在一些实施方案中，眼部疾病是糖 尿病角膜病变。在一些实施方案中，眼部疾病是糖尿病视网膜病。在 一些实施方案中，本公开内容的纳米结构和组合物用于治疗炎症。在 一些实施方案中，本公开内容的纳米结构和组合物用于抑制nfkb信 号传导。在一些实施方案中，本公开内容的纳米结构和组合物用于治 疗眼部伤口。在一些实施方案中，伤口包括对角膜上皮的损伤。在一 些实施方案中，伤口包括对角膜上皮周围组织的损伤。
[0111]
在一些实施方案中，本公开内容的纳米结构和组合物用于治疗患 有眼部损伤或眼部感染的受试者。在一些实施方案中，眼部病症、眼 部损伤或眼部感染分别是角膜病症、角膜损伤或角膜感染。
[0112]
糖尿病受试者的眼部疾病和损伤特别难以治疗。在眼表上皮受损 的手术(例如玻璃体切除术、白内障摘除术)之后，糖尿病患者的愈 合过程也非常具有挑战性。角膜上皮伤口修复的过程，除了在糖尿病 受试者中被延长外，使他们更容易受到感染，这可能导致无法修复的 损伤。传统的治疗方法在解决这些问题方面常常是无效的。他们也未 能解决继发于糖尿病的延迟角膜愈合的基本病理学。
[0113]
纳米结构的应用
[0114]
与其他局部眼睛治疗相比，本公开内容的纳米结构表现出在眼睛 中的吸收增加。在本文中，显示了rna-tlp在体内被角膜上皮细胞 吸收。本公开内容的hdl-np和rna-hdl-np(例如， mir-205-hdl-np)是用于治愈眼部伤口(例如，角膜上皮伤口)的 阳性试剂。因此，本文考虑了含有hdl-np或mir-205-hdl-np的 局部治疗(例如，滴眼液、眼药膏和凝胶)。如考虑的那样，局部治 疗对于治疗受伤的角膜(例如，撕裂的角膜上皮)将是有效的。
[0115]
本文还考虑使用与hdl-np复合的具有抗炎特性(例如， mir-146a)的rna分子(例如，mirna)，其可有效治疗或预防由 以下原因引起的炎症(即，眼部炎症)：眼睛的疾病和损伤，优选角 膜上皮(例如，干眼症、角膜炎、其他感染)。一种有效的抗炎rna 复合纳米结构(例如，mir-hdl-np)将起到类固醇的作用，没有类 固醇具有的有害副作用(例如，角膜变薄、诱发青光眼)。
[0116]
还考虑了与hdl-np复合的具有血管抑制特性(例如，mir-184) 的rna(例如，mirna)，其可有效防止角膜血管生成，角膜血管 生成通常在角膜扰动后发生。
[0117]
本公开内容提供了与纳米结构复合的rna(例如，mirna)， 其表现出伤口愈合特性，因此可以用作目前尚没有的对糖尿病角膜病 变(例如，伤口愈合)的治疗。
[0118]
治疗
[0119]
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全减轻、改善、缓解、延 迟发作、抑制其进展、降低其严重性和/或降低特定疾病、病症和/或 病况的一种或多种症状或特征的发生率。例如，“治疗”癌症可以指抑 制肿瘤的存活、生长和/或扩散。治疗可以施用于未表现出疾病、病症 和/或病况迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病况的早期征 兆的受试者以降低发展与疾病、病症和/或病况相关的病理学的风险。 在一些实施方案中，治疗包括向受试者递送本发明的靶向颗粒。
[0120]
受试者
[0121]
如本文所用，“受试者”或“患者”是指任何哺乳动物(例如，人)， 例如，可能易患疾
病或身体病况例如其为如眼部疾病或病症的疾病或 身体病况的哺乳动物。受试者或患者的实例包括人、非人灵长类动物、 牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠 或豚鼠。受试者可以是被诊断患有某种疾病或身体病况或以其他方式 已知患有疾病或身体病况的受试者。在一些实施方案中，受试者可被 诊断为或已知处于发展疾病或身体病况的风险中。在某些实施方案中， 可以基于受试者的已知疾病或身体病况选择受试者进行治疗。在一些 实施方案中，可以基于受试者的疑似疾病或身体病况选择受试者进行 治疗。在一些实施方案中，可以施用组合物以预防疾病或身体病况的 发展。然而，在一些实施方案中，可能怀疑存在但尚未确定存在的疾 病或身体病况，并且可以施用本发明的组合物以诊断或预防疾病或身 体病况的进一步发展。
[0122]
不再赘述，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大限度地利 用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是说明性的，而不 以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本 文引用的所有出版物通过引用并入。
实施例
[0123]
实施例1：合成金纳米颗粒(au np)、模板化脂蛋白颗粒(tlp) 和rna-tlp
[0124]
使用标准操作方案(piella et al.,2016)合成金核心纳米颗粒(aunp)。约3.5nm au种子是由超过柠檬酸钠的量的四氯金酸和痕量单 宁酸合成的，以使au种子成核。进一步添加四氯金酸和过量的柠檬 酸钠会在种子生长方法中产生单分散的5nm au np，得到浓度为70 nm。在玻璃小瓶中将这些5nm au np的水溶液与5倍摩尔过量的纯 化人apoa-i混合。au np/apoa-i混合物在平底振荡器上以60rpm的 速度在室温(rt)下孵育1小时。接下来，将溶解于氯仿(chcl3,1 mm)或二氯甲烷(ch2cl2,1mm)中的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3
‑ꢀ
磷酸乙醇胺-n-[3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯](pdp-pe；avanti polarlipids)以相对于au np 250倍摩尔过量添加到au np/apoa-i溶液中。 将溶液涡旋振荡，然后将1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc； avanti polar lipids)或溶解于chcl3(1mm)或ch2cl2(1mm)的心 磷脂(心脏,牛)(cl；avanti polar lipids)和1,2-二亚油酰基-sn
‑ꢀ
甘油-3-磷酸-(1
’‑
单-甘油)(18:2pg；avanti polar lipids)的1:1的溶液 以相对于au np 250倍摩尔过量添加到au np/apoa-i/pdp-pe溶液中 并将溶液涡旋振荡。接下来，以相对于au np 25倍摩尔过量添加溶 解于chcl3(1mm,sigma aldrich)或ch2cl2的胆固醇。将混合物涡 旋振荡并短暂超声(约2分钟)，使溶液变得不透明和呈粉红色。将 所得混合物逐渐加热至约65℃并持续搅拌以蒸发chcl3或约40℃并 持续搅拌以蒸发ch2cl2并将磷脂转移到颗粒表面上并进入水相中(约 20分钟)。当溶液变回透明红色时，反应完成。将所得tlp在平底 振荡器上以60rpm的速度在室温下孵育过夜，然后通过切向流过滤 (tff；krosflo research iii tff system,spectrum laboratory,型 号900-1613)进行纯化和浓缩。将tlp储存在4℃直至使用。tlp 的浓度是使用紫外可见光谱(agilent 9453)测量的，其中au np在λ
max
＝520nm处具有特征吸收，并且5nm au np的消光系数为9.696
×
10
6 m-1
cm-1
。
[0125]
为了合成示例性rna-tlp，首先将rna和1,2-二油酰基-3-三甲 基铵-丙烷(dotap)混合。将mir-205、mir-146a、antagomir-210 或对照(ctrl)(integrated dna technologies)的单个有义和反义 rna序列重新悬浮在无核酸酶的水中(500μm，终浓度)。然后将 互补对在无核酸酶的水中混合，其浓度能够以每个rna序列以25倍 摩尔过量(2.5μ
m，每个rna序列的终浓度)直接添加到tlp(100 nm)。然后将dotap的乙醇(etoh)溶液以40倍摩尔过量添加到 rna。将dotap和rna的混合物短暂超声并涡旋振荡(
×
3)，然 后rt下孵育15分钟，接着加入100nm的tlp的水溶液。将 dotap-rna混合物添加到tlp后，溶剂混合物为9:1，水:etoh (v/v)。该溶液在rt下在平底振荡器上以60rpm温育过夜。通过离心 (15,870
×
g，50分钟)纯化得到的rna-tlp，并去除大部分含有未 结合起始材料的上清液。将所得沉淀物短暂超声处理回溶液中，并将 该材料作为浓缩的rna-tlp在单管中合并。rna-tlp的浓度按tlp 所述计算。对于rna-tlp，λ
max
＝260nm处的强吸收证实了rna的 存在。对于仅用rna对的一条链合成的颗粒，类似地进行合成过程； 但是，将两倍量的rna添加到tlp(5μm，终浓度)。
[0126]
实施例2：mir-205 hdl-np在hcec中靶向ship2
[0127]
mir-205负调节上皮细胞中的脂质磷酸酶ship2，导致akt信号 传导的激活。ship2限制上皮细胞迁移。通过抑制ship2，mir-205 通过丝切蛋白(cofilin)激活促进上皮迁移。在本文中，单链mir-205 模拟物与hdl-np复合，hcec暴露于mir-205-hdl-np 48小时。 与阴性颗粒相比，50nm的mir-205-hdl-np降低了ship2并增加 了p-akt(图6f)。
[0128]
实施例3：mir-205-hdl-np快速封闭划痕伤口
[0129]
对在0.3mm ca 2中生长至汇合的丝裂霉素处理的角膜上皮细胞 系(htcepi)造成线性划痕伤口。细胞用10nm的对照或mir-205 hdl-np溶液处理，使用nikon biostation进行成像和分析。 mir-205-hdl-np处理的htcepi细胞在6小时内完全封闭伤口，而 对照hdl-np处理的htcepi细胞在18小时内才封闭伤口(图7和8)。
[0130]
实施例4：mir-146a-hdl-np降低nf-κb活性
[0131]
mir-146a在角膜缘上皮细胞(lec)维持中起作用，但在角膜上 皮终末分化中不起作用。它在糖尿病lec中上调并延迟糖尿病角膜缘 和角膜上皮细胞中的细胞迁移和伤口闭合。此外，它被认为是由nf-k
b 调节的促炎信号传导的关键基因介质。小鼠j774.1巨噬细胞在nf-k
b 共有转录反应元件下游具有分泌的碱性磷酸酶(ap)基因。
[0132]
在本文中，mir-146a模拟物与hdl-np复合并且j774.1鼠巨噬 细胞暴露于mir-146a-hdl-np(4.5小时)。添加lps后，通过使用 quant b比色测定法对分泌的ap的细胞培养基进行采样来定量 nf-kb活性。携带mir146a的hdl-np显著降低了lps诱导的分泌 的ap(图9)。
[0133]
实施例5：hdl-np的局部应用能够穿透未受干扰的眼表
[0134]
在本文中，每30分钟将3μl带有cy-3标签的hdl-np(溶于pbs 中1μm)局部应用于完整的未受伤的角膜，持续四小时。处理后二十 四小时，收获眼睛，包埋于oct中，切片并用荧光显微镜观察(图 10和11a-11b)。
[0135]
实施例6：hdl-np和mir-205-hdl-np在体内表现出生物活性 mir-205是角膜上皮伤口愈合的正调节剂，其部分通过akt信号 传导。hdl通过pi3k/akt信号传导促进增殖、迁移和“管”形成，从 而促进内皮细胞愈合。hdl-apoa-i在人主动脉内皮细胞中诱导血管 生成素样4基因，该基因可被akt信号传导抑制剂阻断。由于hdl 和mir-205激活相同的信号传导通路，因此很难通过临床评估检测 mir-205的任何加成作用。
[0136]
在本文中，麻醉饮食诱导肥胖(dio)小鼠，并用旋转金刚石磨 头去除1mm面积的中央角膜上皮。受伤后，小鼠(8)立即每30分 钟局部接受一次1μl mir-205-hdl-np溶液(1μ摩
尔溶于pbs中)或 无规则mir-hdl-np溶液，持续2小时。使用2％荧光素染色剂在临 床上监测愈合程度，并通过使用图像处理软件(imagej v.1.5)测量伤 口大小来评估上皮愈合率。发现hdl-np和mir-205-hdl-np在体 内表现出生物活性。无规则mir-hdl-np和mir-205-hdl-np都显 示出对伤口愈合的积极作用(图12a-12d)。
[0137]
结论
[0138]
合成的、功能性的hdl-np可以将mirna传递到原代人角膜上 皮细胞、巨噬细胞系和角膜缘/角膜的完整组织。无规则mir-hdl-np 和mir-205-hdl-np对糖尿病小鼠角膜上皮的伤口愈合有积极作用。 这些发现为基于正常和患病情况下mirna递送至角膜表面的创新治 疗方案提供了基础。一种此类治疗选择是开发具有两种mirna的“超 级”mirna-hdl-np眼睛治疗(例如滴眼液)，以便同时影响例如血 管生成和炎症的生物过程。
[0139]
示例性序列
[0140]
该表展示了本说明书所公开的一些示例性序列，但这不是限制性 的。本说明书包括与此同时提交的作为ascii格式文本文件的序列表。 序列表和其中包含的所有信息明确并入本文并构成本技术提交时的本 说明书的一部分。
[0141]
表1：示例性序列
[0142][0143]
*除非另有说明，否则核酸序列从5'到3'描述，氨基酸序列从n 端到c端描述。
[0144]
其他实施方案
[0145]
实施方案1.纳米结构，其包含：高密度脂蛋白纳米颗粒 (hdl-np)，所述hdl-np包含核心、载脂蛋白、与核心相连的脂 质壳，其中脂质壳包含磷脂和与磷脂缔合的rna分子。
[0146]
实施方案2.纳米结构，其包含：模板化脂蛋白颗粒(tlp)，所 述tlp包含核心、载脂蛋白、与核心相连的脂质壳，其中脂质壳包含 磷脂和与磷脂缔合的rna分子。
[0147]
实施方案3.实施方案1-2中任一项的纳米结构，其中载脂蛋白是 载脂蛋白a-i。
[0148]
实施方案4.实施方案1-3中任一项的纳米结构，其还包含胆固醇。
[0149]
实施方案5.实施方案1-4中任一项的纳米结构，其中rna分子 是微rna(mirna)。
[0150]
实施方案6.实施方案5的纳米结构，其中mirna是mir-205或 mir-146a。
[0151]
实施方案7.药物组合物，其包含实施方案1-6中任一项的纳米结 构和药学上可接受的赋形剂。
[0152]
实施方案8.治疗患有眼部病症的受试者的方法，其包括：将有效 量的实施方案1-7中任一项的纳米结构施用于受试者，从而治疗眼部 病症。
[0153]
实施方案9.治疗患有眼部损伤或眼部感染的受试者的方法，其包 括：将有效量的实施方案1-7中任一项的纳米结构施用于受试者，从 而治疗眼部损伤或眼部感染。
[0154]
实施方案10.实施方案8-9中任一项的方法，其中眼部病症、眼 部损伤或眼部感染分别是角膜病症、角膜损伤或角膜感染。
[0155]
实施方案11.实施方案8-10中任一项的方法，其中眼部病症是糖 尿病角膜病变。
[0156]
实施方案12.实施方案8-11中任一项的方法，其中施用是局部施 用。
[0157]
实施方案13.实施方案8-12中任一项的方法，其中受试者是哺乳 动物。
[0158]
实施方案14.实施方案8-13中任一项的方法，其中受试者是人。
[0159]
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书 中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代特征替换。 因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等效或相似特 征的通用系列的示例。
[0160]
由以上描述，本领域技术人员可以很容易地确定本发明的本质特 征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行 各种变化和修改以适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权 利要求内。
[0161]
等价物
[0162]
虽然在本文中已经描述和示例了几个本发明的实施方案，但是本 领域普通技术人员将容易地设想用于执行在本文中所描述的功能和/ 或获得在本文中所描述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段 和/或结构，并且这种变化和/或修改中的每一个都被认为在本文描述 的本发明的实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理 解的是，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置旨在示例性并且实 际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明的教导的特定应用。 本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的特 定本发明的实施方案的许多等价物。因此，应当理解的是，前述实施 方案仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求书及其等价物的范 围内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式来实践本发明的实施 方案。本公开内容的本发明的实施方案涉及本文描述的每个单独的特 征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，两个或多个此类特 征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，只要此类特征、 系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则包括在本公开内 容的发明范围。
[0163]
如本文所定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过 引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的普通含义。
[0164]
在本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请都通过引用的方 式并入每个被引用的主题，在某些情况下可以包含整个文件。
[0165]
在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种 (an)”，除非有明确相反指示，否则应理解为“至少一个”。
[0166]
说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结 合的要素中的“一个或两个”，即在某些情况下结合存在而在其他情况 下不结合存在的要素。用“和/或”列出的多个元素应以相同方式解释， 即“一个或多个”元素如此结合。除了由“和/或”子句具体标识的元素之 外，可以任选地存在其他元素，无论与那些具体标识的元素相关或不 相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”之类的开放式语言 结合使用时，对“a和/或b”的引用可以在一个实施方案中仅指a(任 选地包括除b之外的元素)：在另一个实施方案中，仅指b(任选地包 括除a之外的元素)；在又一实施方案中，指a和b两者(任选地 包括其他元素)；等等。
[0167]
如本文在说明书和权利要求书中使用的，“或”应理解为与如上定 义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或
ꢀ“
和/或”应被解释为包含性的，即包括至少一个，但也包括多个元素或 列表中的多个元素，以及(可选)其他未列出的项目。只有明确相反 指示的术语，例如“仅其中之一”或“恰好是其中之一”，或者，当在权 利要求书中使用时，“由
……
组成”，将指恰好包含多个元素或元素列 表中的一个元素。一般而言，当前面有排他性术语，例如“要么”、“其 中之一”、“只有其中之一”或“恰好是其中之一”，如本文使用的术语
ꢀ“
或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即，“一个或另一个，但不是 两者”)。在权利要求书中使用“主要由
……
组成”时，应具有专利法领 域中的普通含义。
[0168]
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个元素 的列表的短语“至少一个”应被理解为意指选自元素列表中任何一个或 多个元素中的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每 个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定 义还允许除了在短语“至少一个”所指的元素列表中具体标识的元素之 外的元素可以任选地存在，无论与那些具体标识的元素相关或不相关。 因此，作为非限制性示例，“a和b中的至少一个”(或等价地，“a 或b中的至少一个”，或等价地“a和/或b中的至少一个”)可以指在 一个实施方案中，至少一个，任选地包括多于一个，a，而不存在b (并且任选地包括除b之外的元素)；在另一个实施方案中，至少一 个，任选地包括多于一个，b，而不存在a(并且任选地包括除a之 外的元素)；在又一实施方案中，至少一个，任选地包括多于一个， a，和至少一个，任选地包括多于一个，b(和任选地包括其他元素)； 等等。
[0169]
还应该理解的是，除非有明确相反指示，否则在本文要求保护的 包括超过一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不 一定限于本文所述的方法的步骤或动作的顺序。