一种利用细菌发酵废甘油生产细菌纤维素的方法与流程

1.本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用细菌发酵废甘油生产细菌纤维素的方法。


背景技术：

2.在全球气候变暖、环境恶化、重要能源紧缺的大背景下，包含植物油、动物油、脂肪酸甲酯或乙酯在内的生物柴油因具有环保、易燃性，原料来源广泛、可再生等特性近年来被广泛利用，是典型的“绿色能源”。目前，大力发展生物柴油对经济可持续发展、平衡发展、清洁能源替代、控制大气污染等方面具有重要的战略意义。然而据统计，在生物柴油的生产过程中约有10％的废甘油产生，易对环境造成严重污染，因此解决好废甘油的合理利用问题可进一步助推绿色经济发展。
3.细菌纤维素(bacterial cellulose,bc)属于微生物胞外多糖的一种，具有不溶于水、酸和碱等溶液的高化学稳定性，且化学纯度高于普通植物纤维素，具有后者不具备的纳米网状结构、强吸水力、高纤维素纯度、高亲水性、高结晶度、高抗张强度、高生物相容性和易生物降解等优良特性，已在美国、加拿大与日本的食品、电子、医疗、美容、制药等行业中体现出巨大的应用市场和潜力。


技术实现要素：

4.本发明利用工业副产物废甘油作为细菌纤维素发酵的唯一碳源，在保证产量的同时不改变细菌纤维素的良好材料学特性，解决了工业废物回收利用难、易对环境造成危害的难题，且将其转化为一种绿色能源，推动新材料的可持续开发利用。
5.本发明的目的之一是提供一种利用工业副产物废甘油为原料发酵生产细菌纤维素的方法，从而降低生产成本。
6.本发明的目的之二是提供一种工业废弃副产物的可持续利用方法，从而降低后续化学处理成本，利用生物代谢“变废为宝”。
7.本发明提供了一种利用细菌发酵废甘油生产细菌纤维素的方法，以产细菌纤维素的驹形杆菌为研究菌株、工业副产物废甘油为发酵唯一碳源，利用所述方法所生产的细菌纤维素产量高且材料学性质稳定。
8.本发明提供了一种利用细菌发酵废甘油生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
9.(1)发酵种子液的培养：取装有产细菌纤维素细菌甘油管接入hs液体培养基中，25℃-35℃振荡培养16-24h，然后将所述产细菌纤维素细菌菌液在hs平板培养基上连续划线，25℃-35℃倒置培养3-5天，刮取菌苔接入hs液体培养基中，25℃-35℃静置培养24-30h；
10.(2)发酵种子液的预处理：取步骤(1)中静置培养的种子液，使用无菌脱脂棉进行过滤并收集；
11.(3)细菌纤维素的发酵培养：将步骤(2)收集的发酵种子液按体积百分比6-10％接种入ae发酵培养基或o发酵培养基中进行发酵培养；
10％接种入ae发酵培养基或o发酵培养基中进行静态或动态发酵，静态发酵培养条件为：25℃-35℃静置发酵4天，动态发酵培养条件为：25℃-35℃，100
–
200r/min振荡发酵4天；
27.(4)细菌纤维素的提取及纯化：将步骤(3)发酵所得的细菌纤维素收集并纯化，测得细菌纤维素产生菌株的纤维素单位产量。
28.本发明还提出了由上述方法制备得到的细菌纤维素。
29.本发明还提出了所述细菌纤维素在环境污染治理、工业生产如含细菌纤维素发酵类食品生产、含细菌纤维素污染物吸附剂生产、细菌纤维素纸质或纺织品生产等中的应用。
30.其中，所述菌株生产的细菌纤维素呈现透明凝胶状、均匀分散悬浮在培养基中。区别于现有细菌纤维素特征，本发明所述菌株培养产生的纤维素结晶度为40％-60％，低于普通方法培养所产生的纤维素结晶度，能更好地应用于需要材料透明度较高、熔点较低等与低结晶度相关的应用场景。
31.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种将工业副产物废甘油利用微生物发酵代谢转化为新型纳米材料细菌纤维素的方法。其中，产细菌纤维素微生物可有效代谢工业副产物中有毒有害物质，并对菌株生长代谢的影响小，在满足工业化生产细菌纤维素需求的前提下，实现环保、可持续的工业绿色发展。
附图说明
32.图1是两种发酵培养基利用工业废甘油为唯一碳源在动态条件下发酵细菌纤维素的产量及活菌数，其中，a使用ae培养基，碳源替换为分析纯甘油(g)和两种工业废甘油(wg1、wg2)作为单一碳源发酵细菌纤维素产量，b为在ae培养基中碳源替换为不同甘油对菌体生长的影响，c使用o培养基，碳源替换为分析纯甘油(g)和两种工业废甘油(wg1、wg2)作为单一碳源发酵细菌纤维素产量，d为在o培养基中碳源替换为不同甘油对菌体生长的影响。
33.图2是利用o发酵培养基以工业废甘油为唯一碳源在静态和动态条件下发酵的细菌纤维素形态，其中，a为使用o培养基，碳源替换为分析纯甘油(g)静态培养所得的细菌纤维素，b为使用o培养基，碳源替换为工业废甘油1(wg1)静态培养所得的细菌纤维素，c为使用o培养基，碳源替换为工业废甘油2(wg2)静态培养所得的细菌纤维素，d为使用o培养基，碳源替换为分析纯甘油(g)动态培养所得的细菌纤维素，e为使用o培养基，碳源替换为工业废甘油1(wg1)动态培养所得的细菌纤维素，f为使用o培养基，碳源替换为工业废甘油2(wg2)动态培养所得的细菌纤维素。
34.图3是两种发酵培养基利用工业废甘油为唯一碳源在静态和动态条件下发酵的细菌纤维素的傅里叶红外光谱检测分析，其中，a为使用ae培养基，以蔗糖、废甘油、分析纯甘油为唯一碳源在静态和动态条件下发酵的细菌纤维素，b为使用ae培养基和o培养基，以蔗糖、废甘油、分析纯甘油为唯一碳源在动态条件下发酵的细菌纤维素。
35.图4是两种发酵培养基利用工业废甘油为唯一碳源在静态和动态条件下发酵的细菌纤维素的x射线衍射分析，其中，a为使用ae培养基和o培养基，以蔗糖、废甘油、分析纯甘油为唯一碳源在静态条件下发酵的细菌纤维素，b为使用ae培养基和o培养基，以蔗糖、废甘油、分析纯甘油为唯一碳源在动态条件下发酵的细菌纤维素。
具体实施方式
36.下面的实施例和附图对本发明作详细说明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。
37.实施例1：利用工业废甘油作为唯一碳源发酵细菌纤维素
38.(1)细菌纤维素的发酵培养：取-80℃保存的装有产细菌纤维素菌株甘油管全部接入hs液体培养基中，30℃振荡培养22h，连续划线，30℃倒置培养3天，刮取菌苔接入hs液体培养基中，30℃静置培养36h。使用无菌脱脂棉对静置培养的菌液进行过滤并收集。所得的菌株种子液按8％接种入ae发酵培养基或o发酵培养基中，30℃静置发酵或振荡发酵培养4天并定时取样，用无菌梯度稀释发酵液，固体培养基点板计活菌数。其中ae发酵培养基中的唯一碳源替换为分析纯甘油(g)，或，山东油脂厂工业废甘油(wg1)，或，山东化工厂工业废甘油(wg2)，o发酵培养基中碳源组成情况同上。
39.(2)细菌纤维素提取与纯化：取全部发酵液，高速离心去除培养基，蒸馏水水洗离心3次，用0.1m naoh加入纤维素沉淀中，搅拌混匀，100℃水浴1h破裂菌体，离心后取1％乙酸加入纤维素沉淀中中和碱液，高速离心弃上清，细菌纤维素沉淀水洗3次直至ph呈中性，60℃热风烘干并称重，测得细菌纤维素产生菌株的纤维素单位产量。
40.图1a、b为动态发酵条件下，使用本方法用ae培养基并以工业废甘油为唯一发酵碳源细菌产细菌纤维素的产量及发酵过程中活菌数变化情况。图1c、d为动态发酵条件下，使用本方法用o培养基并以工业废甘油为唯一发酵碳源细菌产细菌纤维素的产量及发酵过程中活菌数变化情况。使用本发明方法利用工业废甘油产细菌纤维素均能降低工业废弃物中的有害成分对微生物生长的毒性，保持细菌在发酵过程中活菌数最高维持在109，与对照无毒性的分析纯甘油无显著差异。细菌纤维素产量利用工业废甘油发酵可维持在高水平，特别是使用wg2，在ae培养基中纤维素产量为5.48g/l，在o培养基中纤维素产量为6.03g/l，与对照无显著差异。
41.图2为本发明以工业废甘油为唯一碳源通过微生物所产的细菌纤维素形态。其中a、b、c图为利用分析纯甘油、废甘油wg1、废甘油wg2静态发酵所产的细菌纤维素，其中d、e、f为利用分析纯甘油、废甘油wg1、废甘油wg2动态发酵所产的细菌纤维素。可见利用本发明方法以工业废甘油为唯一碳源所产的细菌纤维素不会改变发酵形态。
42.实施例2：利用工业废甘油作为唯一碳源发酵细菌纤维素的材料学性质检测
43.依据本发明实施例1中细菌纤维素的发酵培养及提取与纯化方法，获得纯净的细菌纤维素，冷冻干燥后使用高速研磨机将其粉碎为直径小于0.22μm的粉末。
44.(1)红外光谱检测分析：为检测工业废甘油在不同发酵条件下所产细菌纤维素的官能团组成的影响，本发明对不同发酵条件下的16种细菌纤维素样品进行了红外光谱扫描。使用红外光谱扫描仪对细菌纤维素样品进行波长为4000-500cm-1
的扫描。比对峰位置确定样品分子结构及化学键组成，分析结果如图3所示，其中3a图为在静态发酵条件下，利用蔗糖、分析纯甘油、工业废甘油wg1及工业废甘油wg2所产细菌纤维素的红外扫描分析结果，3b图为在动态发酵条件下，利用蔗糖、分析纯甘油、工业废甘油wg1及工业废甘油wg2所产细菌纤维素的红外扫描分析结果。各样品的红外吸收峰为细菌纤维素典型的红外吸收图谱结构且无明显区别，3444cm-1
为o-h的伸缩振动吸收峰；2918cm-1
和1500～1200cm-1
为c-h的伸缩振动吸收峰；1561cm-1为c＝o的伸缩振动吸收峰；1058cm-1
、1111cm-1
和1162cm-1
处的吸收
峰则由c-o-c伸缩振动产生，说明利用本发明以工业废甘油为唯一碳源并不会改变所产细菌纤维素的化学结构。
45.(2)x-ray检测分析：为检测工业废甘油在不同发酵条件下所产细菌纤维素的结晶程度的影响，本发明对不同发酵条件下的16种细菌纤维素样品进行了x-射线衍射检测。细菌纤维素样品使用x-射线衍射仪检测，衍射角2θ的扫描范围为5
°
至40
°
，每0.02
°
进行一次扫描，扫描速度为10
°
/min。比对峰位置及峰值高低确定晶面类型及结晶度，从而反映细菌纤维素样品的材料微观结构，分析结果如图4、表1所示，其中4a图为在静态发酵条件下，利用蔗糖、分析纯甘油、工业废甘油wg1及工业废甘油wg2所产细菌纤维素的结晶度分析结果，4b图为在动态发酵条件下，利用蔗糖、分析纯甘油、工业废甘油wg1及工业废甘油wg2所产细菌纤维素的结晶度分析结果。使用不同工业废甘油在不同发酵条件下所产细菌纤维素的x射线衍射检测结果均存在四个衍射峰，分别为两个加强峰14.2
°
(晶型101)、22.7
°
(晶型002)和两个衍射峰16.9(晶型)和34.2
°
(晶型040)，是ⅰα和ⅰβ的特征晶型峰，属于典型的ⅰ型细菌纤维素，表明利用不同废甘油对菌株产生的细菌纤维素晶型结构不会产生改变。细菌纤维素结晶度计算结果如表1所示。在两种培养基中，使用分析纯甘油和工业废甘油作为唯一碳源对静态或动态发酵所产的细菌纤维素结晶度没有差别，都显著低于使用普通蔗糖作为唯一发酵碳源的细菌纤维素结晶度，可作为一种良好的材料学性质。
46.表1不同工业废甘油对所产细菌纤维素结晶度分析
[0047][0048]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。