一种公子小丑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白及其表达和应用的制作方法

一种公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白及其表达和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术制药工业中基因工程领域，特别是一种公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白及其表达和应用。


背景技术：

2.近年来，有关抗生素在医药，食品加工，畜牧渔业等领域中过度使用或误用，导致细菌耐药性和药物残留等问题日益突出，迫切需要寻找新型抗菌药物替代现有抗生素。其中抗菌肽具有高抗菌活性、广抗菌谱和低毒性等优点，使得抗菌肽的研发及应用研究成为国内外医用药物和饲料科学的研究热点。迄今为止，国内外研究报道已有80余种抗菌肽在鱼类中被分离鉴定，其中nk-lysin是鞘脂激活蛋白样蛋白(saposin-like proteins，salip)家族的成员，首次在猪毒性淋巴细胞中发现，研究表明nk-lysin是由白细胞介素2激活细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和自然杀伤(nk)细胞产生效应蛋白(抗菌肽)，具有广谱抗菌活性。
3.研究表明nk-lysin结构非常保守，具有典型的鞘脂激活蛋白b结构域与六个半胱氨酸，而这六个半胱氨酸形成三个分子内二硫键结构，这种结构有利于nk-lysin附着在细胞膜上形成孔，破坏微生物的脂质双层膜。在卵形鲳鲹(trachinotus ovatus)，尼罗罗非鱼(oreochromis niloticus)，大黄鱼(larimichthys crocea)，大菱鲆(scophthalmus maximus)等研究表明，nk-lysin对细菌、真菌，病毒和寄生虫等具有抑制作用。
4.公子小丑鱼(amphiprion ocellaris)广泛分布于西太平洋印度尼西亚、泰国、菲律宾、新加坡及澳大利亚西北部，常生存在珊瑚礁区域，与海葵伴生，适合水族饲养与观赏。目前在我国南方进行中小规模示范养殖，亩产高达10万尾，每年创造产值50-300万元。然而，随着公子小丑鱼养殖产业兴起，再加上养殖环境日益恶化，公子小丑鱼养殖病害频发，常引起较高死亡率，严重影响公子小丑鱼产业的可持续发展。传统养殖过程中多采用抗生素进行治疗，但长期使用抗生素不但污染养殖环境，同时还会导致病原体产生抗药性。因此，开发一种安全、高效的抗生素替代物尤为重要。
5.因此，将公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin蛋白作为这一种水产养殖病害预防和治疗药物或添加剂进行开发，将产生很高的经济效益，但采用人工合成或直接从鱼体提取等传统方法生产抗菌肽nk-lysin蛋白，制作成本较高、工艺复杂且获取量少的缺点，无法满足市场需求，因此提高nk-lysin蛋白产量是一个急需解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白及其表达和应用。
7.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
8.首先，本发明提供了一种公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白，所述公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白的序列如seq id no.2所示。
9.其次，本发明还提供了一种公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白的制备方法，以公子小丑鱼组织cdna为模板进行pcr扩增，扩增出公子小丑鱼nk-lysin基因orf序列，公子小丑鱼nk-lysin基因orf序列如seq id no.1所示；再以公子小丑鱼nk-lysin基因orf序列为模板，克隆出公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白序列。
10.再者，本发明还提供了一种公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白的重组毕赤酵母gs115菌株。所述公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白的重组毕赤酵母gs115菌株的制备方法，包括以下步骤：
11.1)构建公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白的表达重组载体；
12.2)制备毕赤酵母gs115菌株感受态细胞；
13.3)将公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母gs115菌株感受态细胞，筛选高拷贝转化子的公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母gs115菌株。
14.另外，本发明还提供了一种制备公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白的方法，利用公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白的重组毕赤酵母gs115菌株经过摇瓶发酵和甲醇诱导表达及纯化，获得高纯度公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白。
15.最后，本发明提供了公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白在制备水产养殖病害预防和治疗药物或添加剂或日化用品添加剂中的应用。
16.与现有技术相比，本发明编码了公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin基因的orf获得公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白，并利用公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白构建能够大量表达公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白的重组毕赤酵母gs115菌株，获得的公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白纯化后能够制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。
附图说明
17.图1为公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin基因orf及其编码成熟肽序列pcr扩增电泳图。
18.图2为重组载体ppic9k/nk-lysin酶切电泳图。
19.图3为重组毕赤酵母gs115菌株表型鉴定pcr电泳图。
20.图4为公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白表达与纯化sds-page凝胶电泳图。
具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
22.首先，对以下实施例所需试剂及其配置方法进行如下说明：
23.(1)氨苄青霉素(amp

)储存液：用超纯水配制终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素溶液，经0.22μm滤膜过滤，分装成1ml/管，-20℃保存备用。
24.(2)lb液体培养基：称取酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、nacl 10g，溶于1000ml ddh2o，高温高压灭菌，4℃保存。
25.(3)amp

/lb液体培养基：在1000ml的lb液体培养基中加入1ml的amp

储存液，使其
biotech,shanghai)重悬菌体，然后4℃、5000rpm离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体。最后加入200μl冰预冷的无菌山梨醇溶液振荡混匀，分装成100μl/管，-80℃冰冻保存。
51.3)将公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母gs115菌株感受态细胞，筛选高拷贝转化子的公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母gs115菌株：
52.将-80℃保存的毕赤酵母gs115菌株接种到液体ypd培养基(sangon biotech,shanghai)中进行活化；将ppic9k/nk-lysin重组质粒用salⅰ(takara bio)酶切线性化，胶回收目的片段；将上述制备的液体分别加入到预冷0.2cm的电转杯(bio-rad)中，混匀后置于冰上10min，然后在电转仪(bio-rad)中进行电击(电击条件：1500v，5ms)，立即取1mol/l山梨醇500μl加入到电转杯中，吸取200μl涂布在md平板上30℃培养3-5d。设定对照组1：空载体ppic9k电转后，同样操作涂到md平板上；对照组2：吸取制备的毕赤酵母gs115菌株感受态细胞200μl涂布到md平板上。
53.通过设置g418(life sciences)浓度梯度1、2、3、4、5mg/ml筛选重组毕赤酵母ppic9k/nk-lysin-gs115菌株阳性高拷贝转化子。用灭菌牙签挑取md平板上长出的单菌落递进接种到含有不同浓度g418的ypd平板上，置于30℃培养2-3d，挑取能在5mg/ml的g418-ypd平板上长出来的单菌落扩大培养，用酵母基因组dna快速抽提试剂盒(tiangen biotech；beijing)提取基因组dna，利用ppic9k质粒通用引物进行pcr扩增(表1)，鉴定mut (methanol utilization plus)或muts(methanol utilization slow)表型。重组毕赤酵母ppic9k/nk-lysin-gs115菌株pcr扩增电泳结果如图3所示，图3中：泳道1-10：mut 型的重组毕赤酵母ppic9k/nk-lysin-gs115菌株。
54.选取表型为mut 单克隆接种于25ml bmgy液体培养基中，置于30℃、250rpm振荡培养至od600值达到2～6；4℃、5000rpm离心5min，弃上清，重悬菌体转移至1l锥形瓶，加入0.5％～1.0％甲醇，盖上两层灭菌纱布，30℃、250rpm诱导表达96h(诱导每24h添加一次甲醇)，公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白将分泌至培养液中，后续即可对公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白进行纯化。
55.真核重组抗菌肽nk-lysin蛋白具有his标签，选用his-bind填料能够特异性结合his标签。通过改变ph及离子强度可洗脱结合于his-bind上的抗菌肽真核重组蛋白，从而达到纯化效果。具体纯化方法如下：
56.1.塞子堵紧纯化柱底部，加入1ml ni-nat his-bind resin，静置待填料自然沉降，填充柱子，形成柱体。
57.2.取下塞子，使液体自然流出，滤完保护液，按如下顺序洗柱：5ml ddh2o洗柱2次；2ml 1
×
离子缓冲液洗柱3次；5ml 1
×
结合缓冲液洗柱1次。
58.3.将pbs溶解的蛋白轻轻上柱，重复3次，并收集过柱液。
59.4.用4ml不同浓度1
×
咪唑(20、40、60、80、100、250mm)洗柱1次，收集每次过柱液。
60.5.加入4ml 1
×
剥离液洗脱蛋白，收集过柱液。
61.6.将收集的过柱液进行sds-page检测，确定蛋白纯化效果。
62.7.通过检测得到条带单一且大小正确的过柱液加入透析袋(规格8000-14000da)中，透析夹夹紧，放入冷冻的1
×
pbs溶液中进行透析。每隔3h更换透析液，共换3次。
63.8.透析完成后，向透析袋表面加入适量peg 2000进行浓缩，浓缩到一定体积后，收
集蛋白溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
64.9.用nanadrop 2000微量分光光度计测量浓缩蛋白浓度，随后将蛋白溶液分装于1.5ml离心管，转移至-80℃冰箱待用。小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白表达与纯化sds-page电泳结果如图4所示，图4中：泳道1：上清表达的onnk-lysin蛋白；泳道2：纯化后的onnk-lysin蛋白；m泳道：180-10kda蛋白marker。
65.实施例3
66.为了验证公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白的抗菌性能，检测公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白最小抑菌浓度，具体检测过程如下：选取4株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、无乳链球菌、海豚链球菌)和12株革兰氏阴性菌(迟缓爱德华氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、肺炎克雷伯氏菌、伤寒沙门氏菌、嗜水气单胞菌、宋内志贺氏菌、铜绿假单胞菌、豚鼠气单胞菌、普通变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、奇异变形杆菌)，分别吸取新鲜活化的菌液，用lb液体培养基稀释至1
×
106cfu/ml，依次吸取100μl菌液加入96孔板第1～6孔，然后依次加入100μl浓度为500、250、125、62.5、32.15、15.63μg/ml的小丑鱼抗菌肽nk-lysin重组蛋白，使得每孔抗菌肽nk-lysin重组蛋白的终浓度依次为250、125、62.5、31.25、15.63、7.81μg/ml；阳性对照组加入等体积终浓度为200μg/ml卡那霉素溶液，阴性对照加入等体积的无菌pbs溶液；置于37℃培养24h，酶标仪测定各孔od600吸光值，结果如表2所示。
67.表2
[0068][0069]
由表2可知，表示公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白对部分革兰氏阳性和革兰氏阴性菌具有显著的抑菌效果，根据表2的检测结果可以确定本发明的公子小丑鱼抗菌肽nk-lysin成熟肽重组蛋白能够用于制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。
[0070]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。