一种中性粒细胞缺失小鼠模型构建方法与流程

sgrna scaffold-pt，所述重组模板dna的核苷酸序列如seq id no:3所示；其中针对gfi1基因的打靶位点序列为：guide 1：gtactgacagggatagggcc ggg，如seq id no:4所示；guide2：ccaggtttagctcacctgtg tgg，如seq id no:5所示；
15.4)获得r26-sggfi1基因敲入founder小鼠：将cas9 mrna、rosa26-sgrna1/2和重组模板dna混合，然后通过显微注射操作系统将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕icr小鼠雌鼠输卵管，获得founder小鼠；
16.5)对founder小鼠进行基因型检测，筛选出基因组中sggfi1序列插入而且插入位点正确的小鼠个体，获得基因敲入小鼠模型r26-sggfi1。
17.进一步优选的，步骤1)中，rosa26-sgrna1的核苷酸序列为：5
‘‑
ctccagtctttctagaagat ggg-3’，如seq id no:1所示；rosa26-sgrna2的核苷酸序列为：5
‘‑
cgcccatcttctagaaagac tgg-3’，如seq id no:2所示。
18.步骤2)中，通过体外转录试剂盒t7 quick high yield rna synthesis kit(neb，e2050s)获得rosa26-sgrna1/2；使用t7 ultra kit(ambion,am1345)试剂盒，体外转录获得cas9mrna。
19.步骤3)中，以合成的dna为模板，通过体外转录和逆转录，获取单链dna即为重组模板，其中逆转录使用引物序列为：gtaagcagtaatcaataccatg(seq id no:8)。
20.优选的，步骤5)采用以下步骤：
21.a.将获得的founder小鼠抽提基因组dna；
22.b.以获取的基因组dna为模板，使用特异性引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出在小鼠rosa26位点正确插入了sgrna串联表达单元的小鼠；
23.c.将sgrna串联表达单元插入而且插入位点正确的小鼠挑选出来，进行测序验证，挑选出插入目标序列正确的个体，即为r26-sggfi1基因敲入小鼠。
24.进一步优选的，步骤b中，先进行第一pcr扩增，初步筛选目标sgrna串联表达单元序列在基因组中插入的小鼠，然后分别使用引物针对5
‘
同源臂、3’同源臂和sgrna串联表达单元部分进行第二pcr扩增，筛选出sgrna串联表达单元序列插入而且插入位点正确的小鼠。
25.更优选的，第一pcr扩增所使用的引物为引物527、引物528和引物680，核苷酸序列分别如seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11所示。pcr反应体系如下：3条引物各0.2μl，2
×
taq master mix 5μl，基因组dna 1μl，补充h2o至总体积10μl；pcr反应程序如下：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃40sec，35个循环；72℃10min。
26.更优选的，针对5’同源臂的引物为引物529和引物718，核苷酸序列分别如seq id no:14和seq id no:15所示；针对3’同源臂的引物为引物681和引物727，核苷酸序列分别如seq id no:12和seq id no:13所示；针对sgrna串联表达单元部分的引物为引物679和引物682，核苷酸序列分别如seq id no:16和seq id no:17所示。pcr体系如下：引物各0.2μl，2
×
taq master mix 5μl，基因组dna 1μl，补充h2o至总体积10μl；pcr反应程序如下：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃70sec，35个循环；72℃10min。
27.优选的，使用毛细管电泳，对中性粒细胞缺失的小鼠模型不同组织和器官的gfi1打靶位点进行切割检测，其中用于pcr扩增的特异性引物序列为：f-tgaaggagcggcacatttct，如seq id no:6所示；r-gcacagctgttgacatagagga，如seq id no:7
所示。
28.使用流式细胞术，对cas9:sggfi1小鼠外周血和骨髓中的中性粒细胞进行检测，发现其中性粒细胞已经完全缺失，表明中性粒细胞缺失的小鼠模型构建成功。
附图说明
29.图1为r26-sggfi1基因敲入小鼠构建策略；
30.图2为r26-sggfi1基因敲入小鼠测序结果；
31.图3为cas9:sggfi1小鼠不同组织器官(a、鼠尾；b、外周血；c、骨髓；d、肝脏；e、脑)中gfi1基因打靶位点切割检测结果；
32.图4为cas9:sggfi1小鼠外周血(a)和骨髓(b)中中性粒细胞流式细胞术检测结果。
具体实施方式
33.本发明提供了一种中性粒细胞被完全剔除的小鼠模型构建方法，首次通过crispr/cas9基因组编辑技术将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgrna串联表达单元(u6-guide1-sgrna scaffold-pt-u6-guide2-sgrna scaffold-pt)定点插入小鼠rosa26位点，获得了一种全新的r26-sggfi1基因敲入小鼠模型，将r26-sggfi1基因敲入小鼠与表达cas9的小鼠(r26-cas9)进行杂交，对f1代小鼠不同组织器官使用毛细管电泳进行检测，可以发现gfi1打靶位点均发生了切割；进一步使用流式细胞术对f1代小鼠外周血细胞和骨髓细胞进行检测，结果表明中性粒细胞均被完全清除。此外，在繁育过程中，r26-sggfi1基因敲入小鼠与r26-cas9基因敲入小鼠均可以纯合子的方式进行保种和繁育，只需要使用这2个家系纯合子小鼠进行交配，f1代所有小鼠无需进行基因型鉴定，全部均为中性粒细胞缺失小鼠，极大简化了小鼠繁育流程，也可以同时大批量获得阳性小鼠进行后续实验。
34.具体地，对本发明r26-sggfi1基因敲入小鼠模型的构建思路进行说明。
35.1.小鼠rosa26位点的选择。
36.制作传统转基因小鼠时，外源基因在基因组中的插入是随机的，存在如下缺点：第一是外源基因插入拷贝有时无法确定，导致后代会出现分离，造成转基因表达不稳定；第二是外源基因在基因组中插入的位置是随机的，这有可能破坏内源基因的表达，也有可能导致外源基因无法表达。小鼠rosa26位点位于小鼠6号染色体，是一个非编码基因，外源基因极易通过同源重组定点插入此位点，而且插入此位点的基因具有非常高效的表达，在rosa26位点插入外源基因，不会影响内源基因的表达和功能发挥，因而选择rosa26位点作为外源基因插入的安全位点。
37.2.制作sggfi1基因敲入小鼠(rosa26
u6-sgrna-gfi1
，简写为r26-sggfi1)。
38.将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgrna串联表达单元序列(u6-guide1-sgrna scaffold-pt-u6-guide2-sgrna scaffold-pt)插入小鼠rosa26位点后，在u6启动子的驱动下，会启动转录，生成sgrna，而且由于小鼠rosa26位点的特殊性，所以r26-sggfi1小鼠所有组织均会表达sgrna。
39.3.购买能表达cas9的小鼠：r26-cas9。
40.能表达cas9的小鼠购买于美国jax实验室(stock no:026179)，其最初由张锋实验室制作成功，并有相关文献表明此小鼠在所有组织器官中均可以正常表达cas9蛋白，而且
此小鼠的免疫表型与野生型小鼠完全相同(crispr-cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling[j].cell,2014.)。
[0041]
4.将r26-sggfi1小鼠与r26-cas9小鼠交配后会特异性敲除小鼠gfi1基因。
[0042]
根据crispr/cas9基因组编辑系统的原理，当有sgrna和cas9蛋白同时存在时，2者会形成复合体，其中sgrna会将cas9蛋白引导向打靶位点，然后cas9蛋白会在打靶位点形成dna双链的断裂，机体启动自我修复机制，将断裂dna双链进行修复，过程中会产生缺失或是插入，最终完成基因打靶。所以本发明制作了能表达sgrna(针对小鼠gfi1基因特异性打靶)的基因敲入小鼠：r26-sggfi1，然后将其与表达cas9的小鼠交配，后代小鼠就会同时表达sgrna和cas9蛋白，此小鼠体内就含有了完整的crispr/cas9基因组编辑系统，从而实现对小鼠gfi1基因的特异性打靶。
[0043]
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。未特别指明的，实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照sambrook等编著的分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw.molecular cloning:a laboratory manual.2001)，或者产品制造厂商提供的说明书等。
[0044]
实施例1r26-sggfi1基因敲入小鼠模型的构建
[0045]
该实施例提供了对小鼠rosa26位点进行基因编辑获得特异性打靶小鼠gfi1基因的sgrna串联表达单元(u6-guide1-sgrna scaffold-pt-u6-guide2-sgrna scaffold-pt)定点插入(knock-in，ki)小鼠模型的方法，具体包括如下步骤：
[0046]
(1)确定打靶序列：为了将特异性打靶小鼠gfi1基因的sgrna串联表达单元(u6-guide1-sgrna scaffold-pt-u6-guide2-sgrna scaffold-pt)定点插入小鼠rosa26位点，所以针对小鼠rosa26位点设计打靶序列。参考前人已发表文献，将小鼠rosa26位点intron1-2中约1000碱基长度的基因组dna序列粘贴进入在线设计网站crispor(http://crispor.tefor.net/)，根据输出结果中特异性得分高低，最终挑选2条sgrna，序列分别为：
[0047]
rosa26-sgrna1：5
‘‑
ctccagtctttctagaagat ggg-3’(seq id no:1)
[0048]
rosa26-sgrna2：5
‘‑
cgcccatcttctagaaagac tgg-3’(seq id no:2)
[0049]
(2)通过体外转录获得cas9 mrna和rosa26-sgrna1/2：通过体外转录试剂盒t7 quick high yield rna synthesis kit(neb，e2050s)获得rosa26-sgrna1/2。使用t7 ultra kit(ambion,am1345)试剂盒，体外转录获得cas9 mrna。详细操作步骤参考试剂盒说明书。
[0050]
(3)合成重组模板dna：设计重组模板dna序列，包含以下元件：5’和3’同源臂、特异性打靶小鼠gfi1基因的sgrna串联表达单元序列(u6-guide1-sgrna scaffold-pt-u6-guide2-sgrna scaffold-pt)，如图1所示。重组模板dna的核苷酸序列如seq id no:3所示，其中，5’端起第1-1000位为5’同源臂序列；5’端起第1001-1015位为cmv启动子增强子序列；5’端起第1016-1019位为载体构件引入的golden gate克隆时的接头序列；5’端起第1020-1754位为特异性打靶小鼠gfi1基因的sgrna串联表达单元序列；5’端起第1755-1760位为载体构件引入的golden gate克隆时的接头序列；5’端起第1761-1766位为载体构件引入的酶切位点(nhei)序列；5’端起第1767-2715位为3’同源臂序列。由金斯瑞生物科技股份有限公司合成提供。然后以合成的dna为模板，通过体外转录获得mrna，最后以此mrna作为模板通
过逆转录，获取单链dna即为重组模板，其中逆转录使用引物序列为：gtaagcagtaatcaataccatg(seq id no:8)。
[0051]
在特异性rosa26-sgrna1/2的指导下，cas9会在小鼠rosa26打靶位点切割dna双链，当有模板dna存在时，机体会发生同源重组修复(homology directed repair，hdr)，从而将外源dna序列(u6-guide1-sgrna scaffold-pt-u6-guide2-sgrna scaffold-pt)精确插入目标位点，实现基因敲入(knock-in，ki)(图1)。
[0052]
(4)获得r26-sggfi1基因敲入founder小鼠：将cas9 mrna、rosa26-sgrna1/2和重组模板dna混合(rosa26-sgrna1、rosa26-sgrna2、cas9 mrna、重组模板dna的终浓度分别为20、20、20、5ng/μl)，然后通过显微注射操作系统(eppendorf)将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕icr小鼠雌鼠输卵管，20天以后即可获得founder小鼠。
[0053]
(5)r26-sggfi1基因敲入小鼠测序验证：
[0054]
a.获取步骤(4)中的founder小鼠基因组dna，步骤如下：
[0055]
分别剪取小鼠约5毫米鼠尾组织，将其置于500μl组织裂解液中，56℃震荡充分裂解2小时，10000rpm离心5min，吸取上清液350μl，加入2倍体积无水乙醇可以看见白色絮状沉淀，10000rpm离心15min，弃上清保留管底沉淀，加入500μl 75％乙醇，10000rpm离心5min，弃上清，将管底沉淀晾干，加入100μl去离子水，充分溶解，即为基因组dna溶液。
[0056]
b.以获取的基因组dna为模板，使用特异性引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出在小鼠rosa26位点正确插入了sgrna串联表达单元的小鼠；
[0057]
该步骤涉及的特异性引物核苷酸序列如下：
[0058]
527:taagggagctgcagtggagta(seq id no:9)
[0059]
528:cccgacaaaaccgaaaatctgt(seq id no:10)
[0060]
680：ccctatccctgtcagtacggt(seq id no:11)
[0061]
681：aaaggacgaaacaccgcca(seq id no:12)
[0062]
727：gccagtccaagagaaagcact(seq id no:13)
[0063]
529：gtggagccgttctgtgagac(seq id no:14)
[0064]
718：gctctaaaacggccctatccc(seq id no:15)
[0065]
679：gagttctctgctgcctcctg(seq id no:16)
[0066]
682：acctgttcaattcccctgcag(seq id no:17)
[0067]
首先使用引物527 528 680进行扩增，pcr反应体系如下：3条引物各0.2μl，2
×
taq master mix(vazyme p112-01)5μl，基因组dna 1μl，补充h2o至总体积10μl；pcr反应程序如下：95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃40sec，35个循环；72℃10min；将pcr产物进行凝胶电泳检测，若只有470bp的一条扩增条带，表明sgrna串联表达单元序列在基因组中插入，而且是ki纯合子；若只有308bp的一条扩增条带，表明sgrna串联表达单元序列没有在基因组中插入，是野生纯合子；若同时有308 470bp的2条扩增条带，表明sgrna串联表达单元序列有在基因组中插入，但是是杂合子。
[0068]
将ki纯合子或是杂合子挑选出来，分别使用引物529 718(针对5’同源臂)、681 727(针对3’同源臂)和679 682(针对sgrna串联表达单元部分)进行扩增，pcr体系如下：引物各0.2μl，2
×
taq master mix(vazyme p112-01)5μl，基因组dna 1μl，补充h2o至总体积
cells)，cd5-cd19-cd11b

ly6g

为中性粒细胞(neutrophils)；结果表明，对照小鼠b6、仅表达sgrna的r26-sggfi1基因敲入小鼠和仅表达cas9的r26-cas9基因敲入小鼠外周血中，中性粒细胞占比均为40％左右，而在同时表达sgrna和cas9的cas9:sggfi1小鼠外周血中，中性粒细胞已经完全缺失(图4a)，表明中性粒细胞缺失小鼠遗传模型构建成功。
[0080]
(2)骨髓中中性粒细胞检测
[0081]
分别获取野生型b6小鼠、仅表达sgrna的r26-sggfi1基因敲入小鼠、仅表达cas9的r26-cas9基因敲入小鼠的骨髓细胞作为对照组，获取同时表达sgrna和cas9的cas9:sggfi1小鼠的骨髓细胞作为实验组，利用特异性抗体对骨髓细胞进行标记，然后利用流式细胞术对骨髓细胞中中性粒细胞的百分比进行检测，步骤如下：
[0082]
使用二氧化碳安乐死的方法处死小鼠，取出小鼠股骨和胫骨，用液体培养基将其中的骨髓冲洗取出，使用移液器轻轻吹打直至骨髓细胞完全分散，加入1000μl facs buffer清洗细胞，4℃，300g，离心5min，弃去上清，加入3000μl 1
×
rbc红细胞裂解液(00-4300-54，ebioscience)，室温孵育3分钟，然后加入5ml含有2mm edta的facs buffer，混匀，300g离心5分钟，然后去掉上清，保留底部细胞沉淀，最后加入1000μl facs buffer重悬细胞即获得骨髓细胞单细胞悬液，取1million骨髓细胞，加入100μl抗体混合物(抗体包括：anti-cd45 apc-efluor780，anti-cd11b super bright 600，anti-cd19 pe和anti-ly6g alexa fluor 700)，充分混匀，置于冰上避光孵育30min；然后加入1000μl facs buffer清洗细胞，4℃，300g，离心5min，弃去上清，加入500μl facs buffer(含有sytox blue)重悬细胞。通过流式细胞仪bd facscanto
tm
(bd,usa)采集数据，并进一步通过flowjo 10.0软件完成数据分析。
[0083]
结果如图4所示，其中cd45

cd19-cd11b

ly6g

为中性粒细胞(neutrophils)；结果表明，对照小鼠b6、仅表达sgrna的r26-sggfi1基因敲入小鼠和仅表达cas9的r26-cas9基因敲入小鼠骨髓细胞中，中性粒细胞占比均为70％左右，而在同时表达sgrna和cas9的cas9:sggfi1小鼠骨髓细胞中，中性粒细胞已经完全缺失(图4b)，表明中性粒细胞缺失小鼠遗传模型构建成功。