包含蜂毒提取物作为活性成分的用于预防或治疗神经炎症紊乱的组合物的制作方法

1.本发明涉及用于预防或治疗神经炎症紊乱(neuroinflammatory disorder)的组合物，所述组合物包含蜂毒(bee venom)提取物作为活性成分。


背景技术：

2.中枢神经系统(cns)中的慢性炎症与多种病理生理过程密切相关，包括代谢并发症和神经退行性疾病。在慢性炎症条件下，在诸如下丘脑和海马体的区域中检测到活化的小胶质细胞，活化的小胶质细胞衍生的炎症介质会导致神经损伤，影响代谢紊乱和神经退行性疾病。因此，抑制小胶质细胞活性被认为是保护中枢神经系统(如下丘脑和/或海马体)中的异常慢性炎症反应的重要策略。
3.阿尔茨海默病(alzheimer's disease，ad)是导致痴呆的最常见的神经退行性疾病，其主要症状包括记忆力衰退、语言缺陷以及对时间和地点的混淆。尽管阿尔茨海默病的病因和机制尚未明确阐明，但已在患者的大脑中观察到老年斑和神经原纤维缠结，并且已发现神经原纤维缠结是由神经元细胞死亡、突触丧失以及毒性蛋白如β-淀粉样蛋白(aβ)和app-c蛋白(抗淀粉样前体蛋白)对tau蛋白的变性和过度磷酸化而形成的。
4.β-淀粉样蛋白(aβ)是阿尔茨海默病患者的大脑中发现的淀粉样蛋白斑块的主要成分，是一种由36至43个氨基酸组成的肽，并已知由淀粉样前体蛋白(app)制成。淀粉样前体蛋白被β-分泌酶和γ-分泌酶降解，并且已有研究通过靶向降解酶来降低β-淀粉样蛋白的浓度。然而，靶向β-淀粉样蛋白生成机制的治疗物质对阿尔茨海默病的治疗效果并不显著。
5.此外，主动和被动免疫治疗在动物实验中显示出治疗效果后，在对阿尔茨海默病患者的临床研究中，在阿尔茨海默病的动物模型中通过所使用的抗原aβ42对主动免疫进行诱导的情况下，aβ斑块减少，并且morris水迷宫实验示出记忆改善。然而，在使用合成aβ肽an1792/qs-21对阿尔茨海默病患者进行的2期临床试验中，6％的患者出现脑膜炎，因此临床试验中断。最近的一项临床试验也减少了aβ斑块，但没有改善进行性神经元退化。
6.帕金森病(parkinson's disease，pd)是与阿尔茨海默病一起出现在老年期的代表性神经退行性紊乱之一，并且已知65岁以上人群中有1％患有该病，且该疾病的比例随着年龄的增长而增加。帕金森病是一种运动障碍，典型症状包括静止时震颤、僵硬、运动迟缓解姿势不稳。此外，帕金森病的特征是小胶质细胞增生、星形胶质细胞增生、多巴胺能神经元进行性退化、多巴胺能神经元中存在路易氏小体(lewy body)以及黑质致密部中α-突触核蛋白的积累。
7.尽管帕金森病的确切病因尚不清楚，但据了解，神经毒素(例如杀虫剂)引起的环境因素、遗传因素、线粒体功能障碍和衰老都与其有关。特别是，据报道，活化的小胶质细胞和神经炎症在这些神经退行性紊乱的发病机制中起着重要作用。
8.目前，尽管有许多缓解帕金森病的症状的药物(例如左旋多巴制剂、多巴胺受体激
动剂、抗胆碱能药物和咪多吡(eldepryl))，但这些药物仅在控制症状方面、而不是在根治性治疗方面发挥作用。目前尚未报道能够阻止疾病进展的药物。
9.此外，由于这些药物需要持续进行给予，长期服用这些药物有很高的导致副作用的风险，从而弱化身心。例如，抗胆碱能药物可能导致自主神经系统或精神功能异常，因此对老年患者持续给药是有限制的。在左旋多巴制剂的情况下，随着长期使用，效果逐渐减弱，并出现副作用，如身体扭曲或手脚反常移动。此外，还进行了使用高频的神经刺激治疗，即高频破坏或脑深部刺激治疗等外科治疗方法，但也存在一些问题，需要进行侵入性手术，且耗费大量成本。
10.因此，为了预防或治疗阿尔茨海默病、帕金森病和中风等疾病，迫切需要开发更有效的新型治疗剂。


技术实现要素：

11.技术问题
12.本发明的一个目的是提供用于从根本上预防或治疗神经炎症紊乱的药物组合物。
13.本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗神经炎症紊乱的组合物的皮下给予方法。
14.本发明的另一个目的是提供用于预防或改善神经炎症紊乱的功能性食品组合物。
15.技术手段
16.为了实现上述目的，本发明所述的用于预防或治疗神经炎症紊乱的药物组合物可包含蜂毒提取物作为活性成分，所述蜂毒提取物具有50％至85％的磷脂酶a2(pla2)含量。
17.本发明所述的用于皮下给予以预防或治疗神经炎症紊乱的药物组合物可包含蜂毒提取物作为活性成分，所述蜂毒提取物具有50％至85％的磷脂酶a2(pla2)含量。
18.本发明所述的用于预防或治疗神经炎症紊乱的药物组合物可包括下述药物组合物，所述药物组合物包含蜂毒提取物(该提取物具有50％至85％的pla2含量)作为活性成分；以及选自stat3抑制剂和nf-κb抑制剂的一种或多种抑制剂。
19.本发明所述的药物组合物可进行皮下给予以预防或治疗神经炎症紊乱。
20.本发明所述的用于预防或治疗神经炎症紊乱的功能性食品组合物可包含蜂毒提取物作为活性成分，所述蜂毒提取物具有50％至85％的磷脂酶a2(pla2)含量。
21.此外，本发明所述的用于预防或改善神经炎症紊乱的功能性食品组合物是下述功能性食品组合物，所述功能性食品组合物包含蜂毒提取物(该提取物具有50％至85％的pla2含量)作为活性成分；以及选自stat3抑制剂和nf-κb抑制剂的一种或多种抑制剂。
22.有益效果
23.本发明所述的药物组合物或功能性食品组合物包含蜂毒提取物(该提取物具有50％至85％的磷脂酶a2(pla2)含量)作为活性成分，从而改善了由神经毒性导致的运动功能减退，并通过减少th1和th17的极化和增加th阳性多巴胺能神经元而具有神经保护作用。此外，它通过激活调节性t细胞来调节神经炎症反应和降低促炎细胞因子的表达，从而产生更好的神经炎症缓解作用。
24.此外，本发明所述的药物组合物可进行皮下给予或与stat3抑制剂或nf-κb抑制剂组合进行给予，以进一步增强神经炎症疾病的预防或治疗效果，从而更有效地预防或治疗
神经炎症紊乱。
附图说明
25.图1示出了动物实验一览表，其中在小鼠腹腔内注射mptp(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐，20mg/kg)后6天各自皮下注射0.5mg/kg sigma pla2、粗蜂毒、含有pla2 31％(pla2 31％)的蜂毒提取物、含有pla2 53％(pla2 53％)的蜂毒提取物和含有pla2 78％(pla2 78％)的蜂毒提取物，用于根据pla2(磷脂酶a2)含量评价疗效。
26.图2示出了通过爬杆测试测量行为实验的图，该图表明了蜂毒提取物的pla2含量对注射mptp的小鼠完全朝下转向所需的时间值(t-转向，左侧)和小鼠到达底部所需的总时间值(t-la，右侧)的影响。误差条表示平均值
±
sem，*p《0.05、**p《0.01和***p《0.001，表明与注射mptp的小鼠的黑质(sn)存在显著差异。
27.图3示出了在注射mptp的小鼠中，蜂毒提取物中的pla2含量对调节性t细胞(treg)分化的影响。通过流式细胞术测量表达cd4、cd25和foxp3的细胞在脾细胞中的treg分化。误差条表示平均值
±
sem，*p《0.05表明与注射mptp的小鼠存在显著差异，显著性通过学生t检验(student’s t-test)来确定。
28.图4示出了蜂毒提取物中pla2含量对注射mptp的小鼠中th1/17细胞分化的影响。通过流式细胞术测量(a)表达th1(cd4 ifn-γ )的细胞和(b)表达th17(cd4 il-17a )的细胞在脾细胞中的th1/17细胞分化。误差条表示平均值
±
sem，*p《0.05、**p《0.01表明与注射mptp的小鼠存在差异显著。
29.图5示出了为了从使用含有不同pla2含量的蜂毒提取物处理组的黑质(sn)组织样品中识别酪氨酸羟化酶(th)而进行的免疫组织化学染色。用th对脑组织进行染色，以对多巴胺能神经细胞进行损伤分析，并使用半定量量表对sn中的th阳性神经元数量进行量化。对所有随机选择的组织学图像进行评分，数据表示三个独立实验并以平均值
±
sem表示，比例尺为5.0μm。**p《0.01、***p《0.001表明与mptp组存在显著差异。
30.图6示出了在小胶质细胞中蜂毒提取物对lps诱导的淀粉样蛋白生成和神经炎症的影响。图6a示出了bvpla2(pla2)处理对淀粉样前体蛋白(app)、β-分泌酶1(bace1)和β-淀粉样蛋白(aβ)的蛋白质印迹(western blot)分析结果。图6b示出了bvpla2处理的β-分泌酶活性分析结果图。图6c示出了bvpla2处理的inos、cox-2和iba-1的蛋白质印迹分析结果。图6d示出了nf-κb亚基的蛋白质印迹分析结果。图6e示出了bvpla2处理的促炎细胞因子的qrt-pcr分析结果。
31.图7示出了对蜂毒提取物和nf-κb抑制剂(bay 11-7802)协同作用的鉴定。图7a示出了inos和cox-2对炎症蛋白的影响，图7b示出了对nf-κb信号通路相关因子的影响，图7c示出了对促炎细胞因子的影响。
32.图8示出了体内实验的示意过程。
33.图9示出了蜂毒提取物在lps诱导小鼠中对记忆改善的影响。图9a和图9b示出了morris水迷宫实验结果图，图9c示出了探索测试结果图，图9d示出了被动回避实验结果图。
34.图10示出了蜂毒提取物在lps诱导小鼠脑组织中对淀粉样变性减少的影响。图10a示出了bvpla2处理的β-淀粉样蛋白生成的变化图，图10b示出了bvpla2处理的β-分泌酶活性的分析结果图，图10c示出了bvpla2处理的app、bace1和β-淀粉样蛋白(aβ)的蛋白质印迹
分析结果。
35.图11示出了蜂毒提取物在lps诱导小鼠大脑内对神经炎症的影响。图11a示出了gfap和iba-1的反应细胞的数量变化，图11b示出了inos和cox-2的反应细胞的数量变化。
36.图12示出了蜂毒提取物在lps诱导小鼠脑组织中对炎症反应和促炎细胞因子的影响。图12a示出了bvpla2处理的inos、cox-2、gfap和iba-1的蛋白质印迹分析结果，图12b示出了bvpla2处理的nf-κb亚基等的蛋白质印迹分析结果，图12c示出了表明bvpla2处理的促炎细胞因子表达水平的变化。
37.图13示出了蜂毒提取物在lps诱导小鼠脑组织中对调节性t细胞(treg)的影响。图13a和图13b示出了作为treg标志物的foxp3的免疫组织化学结果，图13c示出了foxp3的qrt-pcr表达水平。
38.图14示出了根据蜂毒提取物给予途径对lps诱导小鼠记忆改善的影响。图14a至图14d示出了根据给予途径进行的行为实验结果，图14e示出了根据给予途径的淀粉样变性变化的对照。
39.图15示出了蜂毒提取物在tg2576小鼠中对遗传诱导记忆障碍的影响。图15a示意性地示出了给予bvpla2的实验程序，图15b至图15d示出了bvpla2处理的行为实验结果。每个值表示10只小鼠的平均值
±
sem，*p《0.05表明与对照组存在显著差异。
40.图16示出了蜂毒提取物对β-淀粉样蛋白(aβ)积累以及与aβ产生相关的因素的抑制作用。图16a示出了硫磺素s染色的结果，图16b示出了app和bace1的蛋白质印迹分析结果，图16c和图16d示出了通过elisa评价aβ
1-42
和aβ
1-40
水平的结果，图16e示出了β-分泌酶活性的分析结果。每个值表示10只小鼠的平均值
±
sem，且**p《0.01表明与对照组存在显著差异。图16f示出了通过elisa评价bv-2小胶质细胞中aβ
1-42
水平的结果，图16g示出了bv-2细胞中β-分泌酶活性的分析结果，每个值表示3只小鼠的平均值
±
sem。图16h示出了bv-2细胞中app和bace1的蛋白质印迹结果，##p《0.05、###p《0.001表明与对照组存在显著差异，且*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001表明与lps组存在显著差异。
41.图17示出了蜂毒提取物在tg2576小鼠中对遗传诱导神经炎症的抑制作用。图17a示出了海马体中gfap、iba-1、inos和cox-2的免疫染色结果，图17b示出了免疫染色阳性细胞数量的量化，图17c示出了inos、cox-2、gfap和iba-1的蛋白质印迹结果，图17d示出了通过qrt-pcr评价它们的表达水平的结果。每个值表示10只小鼠的平均值
±
sem，*p《0.05、**p《0.01表明与对照组存在显著差异。
42.图18示出了蜂毒提取物在bv-2细胞中对lps诱导神经炎症的抑制作用。图18a示出了细胞活力分析结果，图18b示出了一氧化氮分析，图18c示出了inos、cox-2和iba-1蛋白质印迹结果，图18d示出了通过qrt-pcr评价促炎细胞因子和抗炎细胞因子的结果。每个值表示三个不同实验的平均值
±
sem。#p《0.05、###p《0.001表明与对照组存在显著差异，且*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001表明与lps组存在显著差异。
43.图19示出了蜂毒提取物对stat3激活的抑制作用。图19a示出了在tg2576小鼠大脑中与stat3和丝裂原活化蛋白激酶(mapk)信号通路相关的因子的水平的蛋白质印迹结果，*p《0.05、**p《0.01表明与对照组存在显著差异。图19b示出了bv-2细胞中的蛋白质印迹结果，图19c示出了荧光素酶活性分析结果，每个值表示三个不同实验的平均值
±
sem。图19d示出了stat3水平的蛋白质印迹分析结果。
44.图20示出了stat3的连结域(linker domain(ld))和蜂毒提取物之间的直接结合。图20a示出了bvpla2和stat3对接模型的放大图像，其中紫色部分表示bvpla2，且绿色部分表示stat3。图20b示出了几种类型的stat3重组蛋白的域结构的示意图，图20c示出了下拉分析(pull-down analysis)结果，图20d示出了lps诱导的stat3荧光素酶活性分析结果，图20e示出了在经几种stat3突变形式转染的bv-2细胞中通过qrt-pcr来评价促炎细胞因子(tnf-α、il-1β和il-6)的mrna表达水平的结果。每个值表示三个不同实验的平均值
±
sem。##p《0.01、###p《0.001表明与对照组存在显著差异，且*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001表明与lps处理的野生型组存在显著差异。
45.图21示出了蜂毒提取物和stat3抑制剂在bv-2细胞中的协同作用。图21a示出了通过elisa评价bv-2细胞中aβ
1-42
水平的结果，图21b示出了bv-2细胞中的β-分泌酶活性分析结果，图21c示出了bv-2细胞中的app和bace1的蛋白质印迹分析结果，图21d示出了bv-2细胞中的inos和cox-2的蛋白质印迹分析结果。图21e示出了在用bvpla2或stattic处理的bv-2细胞中通过qrt-pcr来评价促炎细胞因子(tnf-α、il-1β和il-6)的mrna表达水平。每个值表示三个不同实验的平均值
±
sem。###p《0.001表明与对照组存在显著差异，且*p《0.05表明与bvpla2处理组存在显著差异。
具体实施方式
46.下文将详细描述本发明。
47.本发明人通过在纯化自原始蜂毒的、含有不同浓度磷脂酶a2(pla2)的蜂毒提取物中确定了含有特定浓度pla2的蜂毒提取物在帕金森病和阿尔茨海默病动物模型中改善治疗效果，从而完成了本发明。
48.如本文所使用的，术语“预防”指通过给予本发明所述的药物组合物或功能性食品组合物来抑制或延迟神经炎症紊乱发作、或抑制或延迟紊乱的至少一种症状发作的任何作用。其还包括治疗处于紊乱缓解期的受试者以预防或阻止复发。
49.如本文所使用的，术语“治疗”是指通过给予本发明所述的药物组合物来改善或有益地改变(例如，缓解、减少或消除)神经炎症紊乱或紊乱的至少一种症状的任何作用。
50.如本文所使用的，术语“改善”是指通过摄入本发明所述的功能性食品组合物来改善或有益地改变(例如，缓解、减少或消除)神经炎症性紊乱或紊乱的至少一种症状的任何作用。
51.如本文所使用的，术语“药物组合物”是指为特定目的而给予的组合物，所述组合物是为了预防或治疗神经炎症紊乱或紊乱的至少一种症状而进行给予，以用于本发明的目的。
52.如本文所使用的，术语“功能性食品”包括根据《保健功能性食品法》(health functional food act)第6727号法案，使用对人体有用的原料或成分而制造和加工的食品，并且指经加工以有效地表现出身体调节功能的、具有高医疗和保健效果的食品，例如，出于本发明的目的，除了营养供应之外，所述身体调节功能为神经炎症紊乱的预防、生物防御、免疫和恢复。
53.如本文所使用的，术语“提取物”是指通过提取天然产物的成分而获得的物质，无论提取方法、提取溶剂、提取成分或提取物的形式如何。它可以包括通过不同方法通过加工
或处理天然产物来提取天然产物的成分后获得的任何材料。
54.本发明提供了用于预防或治疗神经炎症紊乱的药物组合物，所述药物组合物包含蜂毒提取物作为活性成分。
55.如本文所使用的，“蜂毒(bv)”是蜜蜂(西方蜜蜂(apis mellifera))腹部产生的酸性和碱性分泌物的混合物，并具有无色、苦味的液体形式。它包括蜂毒肽(melittin)、蜂毒明肽(apamin)、肥大细胞脱颗粒(mcd)肽和磷脂酶a2(pla2)酶作为主要成分，还包括其它微量成分。其不仅限于从蜜蜂身上获得。
56.蜂毒提取物可为下述蜂毒提取物，所述蜂毒提取物具有50％至85％的磷脂酶a2(pla2)含量，优选蜂毒提取物具有70％至80％的pla2含量，更优选78％的pla2含量。
57.蜂毒提取物可根据本领域常用的方法从蜂毒中提取制备，并可购买和使用商业上可获得的蜂毒提取物。然而，本发明不限于此。
58.蜂毒提取物可改善由神经毒性导致的运动功能减退，并可通过减少th1和th17极化和增加th阳性多巴胺能神经元而具有神经保护作用。蜂毒提取物可通过降低促炎细胞因子的表达和激活调节性t细胞来控制神经炎症反应，从而具有缓解神经炎症的作用。此外，蜂毒提取物降低β-分泌酶(beta-分泌酶)的活性，从而抑制β-淀粉样蛋白(aβ)的积累。
59.根据本发明的一个实施方式，在给予具有31％、53％或78％的pla2含量的蜂毒提取物的帕金森病动物模型中观察到改善运动功能的效果、神经保护的效果等，特别是，经确定，含有78％pla2的蜂毒提取物表现出最好效果。更多详细内容将在后文的以下实施方式中进行描述。
60.本发明提供了用于预防或治疗神经炎症性紊乱的皮下给予的药物组合物，所述药物组合物包含蜂毒提取物作为活性成分。
61.蜂毒提取物可为下述蜂毒提取物，所述蜂毒提取物具有50％至85％的磷脂酶a2(pla2)含量，优选蜂毒提取物具有70％至80％的pla2含量，更优选78％的pla2含量。
62.蜂毒提取物可通过皮下途径进行给予，且可以以3.75mg/kg以上且小于7.5mg/kg的量进行皮下给予。
63.本发明提供了用于预防或治疗神经炎症紊乱的药物组合物，所述药物组合物包含上述作为活性成分的蜂毒提取物以及选自stat3抑制剂和nf-κb抑制剂中的一种或多种抑制剂。
64.当药物组合物与抑制stat3活性或nf-κb活性的抑制剂组合使用时，蜂毒提取物的神经炎症缓解作用和淀粉样蛋白积累抑制作用可进一步提高。
65.stat3抑制剂可选自stattic、sta-21、s31-201、s31-m2001、s31-1757、姜黄素-脯氨酸、隐丹参酮、hic 1、pd153035、tg101209、pp2、槐属二氢黄酮g(sophoraflavanone g)等；nf-κb抑制剂可选自bay 11-7802、pdtc、mg-132、mg-115、mln-4924、jsh-23、pge2、ly 294002等，但不限于此。
66.在本发明所述的药物组合物中，神经炎症疾病可以是选自于由阿尔茨海默病、血管性痴呆、额颞痴呆、酒精性痴呆、帕金森病和中风组成的组的疾病，但不限于此。
67.如本文所使用的，术语“神经炎症紊乱”指由胶质细胞介导的中枢神经系统中的炎性紊乱，并且可以优选地表示“脑神经炎症紊乱”，并且可以包括在神经炎症影响下发生的神经退行性疾病(退行性脑紊乱)、炎性脑紊乱、代谢并发症等。
68.本发明所述的药物组合物可根据医药领域中的常规方法制备。药物组合物可根据组成与适当的药学上可接受的载体组合，并且如有必要，可通过进一步包括赋形剂、稀释剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、粘合剂、崩解剂、溶剂等来制备。如本文所使用的，术语“药学上可接受”是指组合物对暴露于该组合物的细胞或人类无毒。适当的载体等不会抑制本发明所述的蜂毒提取物的活性和性质，并且可根据给予方式和组成进行不同选择。
69.本发明所述的药物组合物可应用于任何制剂中，更具体而言，其可根据常规方法配制为口服制剂或非口服制剂，例如外部制剂、栓剂和无菌注射溶液。优选地，其可配制为注射剂以用于腹腔内或皮下给予。
70.在口服制剂中，固体制剂可以是片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等的形式，并且可以通过与至少一种或多种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、纤维素和明胶)混合来制备。除了简单赋形剂外，还可包含润滑剂，如硬脂酸镁和滑石。此外，除了上述物质之外，胶囊制剂还可包含液体载体，如脂肪油。
71.在口服制剂中，液体制剂包括混悬剂、溶液、乳剂、糖浆剂等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡外，还可包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。
72.非口服制剂可包括无菌水溶液、非水溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。非水溶剂和混悬剂可包含丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射酯(如油酸乙酯)。作为栓剂的基质，可使用witepsol、聚乙二醇(macrosol)、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。可使用本领域已知的任何合适试剂，而不限于此。
73.此外，本发明所述的药物组合物可进一步添加钙、维生素d3等以增强治疗效果。
74.在本发明所述的药物组合物中，可以以药学上有效的量给予药物组合物。如本文所使用的，术语“药学上有效的量”指足以以适用于医疗的合理收益/风险比来治疗疾病且不会造成副作用的量。
75.根据患者的预期用途、年龄、性别、体重和健康状况、疾病类型、严重程度、药物活性、药物敏感性、给予方法、给予时间、给予途径和排泄率、治疗持续时间、联合或同时使用的药物以及医学领域已知的其它因素，来不同地确定药物组合物的有效剂量水平。例如，尽管不是恒定的，但通常可每天一次至几次给予0.001mg/kg至100mg/kg，优选0.01mg/kg至10mg/kg。上述剂量不以任何方式限制本发明的范围。
76.可向能够发展出神经炎症疾病的任何动物给予本发明所述的药物组合物，并且所述动物可包括，例如，不仅是人类和灵长类动物，还有牲畜，例如牛、猪、马和狗。
77.本发明所述的药物组合物可以根据组成通过适当的给予途径进行给予，并且可以通过各种途径(口服或非口服)进行给予，只要其能够到达靶组织。可通过常规给予方法进行给予，该给予方法包括但不特别限于，例如口服、直肠或静脉注射、肌肉、皮肤施用、呼吸吸入或宫内硬膜外或脑室内注射。
78.优选地，可通过皮下途径进行给予，在这种情况下，可以以3.75mg/kg以上且小于7.5mg/kg的量给予蜂毒提取物。
79.本发明所述的药物组合物可单独使用或与手术或其它药物治疗组合使用，以预防或治疗神经炎症紊乱。
80.本发明提供了对药物组合物进行皮下给予以预防或治疗神经炎症紊乱的方法。
81.本发明所述的一个实施方式，当通过腹腔内途径或皮下途径给予蜂毒提取物时，
确定了当通过皮下途径给予时神经炎症紊乱(例如帕金森病或阿尔茨海默病)的治疗效果更高。更多详细内容将在后文的以下实施方式中描述。
82.本发明提供了用于预防或治疗神经炎症紊乱的功能性食品组合物，所述功能性食品组合物包含蜂毒提取物作为活性成分。
83.蜂毒提取物可为下述蜂毒提取物，所述蜂毒提取物具有50％至85％的磷脂酶a2(pla2)含量，优选蜂毒提取物具有70％至80％的pla2含量，更优选78％的pla2含量。
84.本发明提供了用于预防或治疗神经炎症紊乱的功能性食品组合物，所述功能性食品组合物包括上述功能性食品组合物和选自stat3抑制剂和nf-κb抑制剂的一种或多种抑制剂。
85.相应的特征可替代上述部分。
86.对于本发明所述的功能性食品组合物，功能性食品可制备为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂或饮品，用于预防或治疗神经炎症紊乱的目的。功能性食品可被摄取的形式不受到限定，其可以与药物组合物相同的方式配制，并用作功能性食品或添加到各种食品中。
87.对于本发明所述的功能性食品组合物，功能性食品可以包括传统意义上的所有食品。例如，它可以是饮品和各种饮料、水果及其加工食品(罐装水果、果酱等)、鱼、肉及其加工食品(火腿、培根等)、面包和面条、饼干和零食以及乳制品(黄油、奶酪等)，并且可以包括传统意义上的所有功能性食品。其也可以包括用作动物饲料的食品。
88.可通过进一步包含药学上可接受的食品添加剂和本领域常用的其它合适辅助成分，来制备本发明所述的功能性食品组合物。除非另有规定，可根据食品和药品管理局批准的食品添加剂法规的一般规则和一般测试方法中的标准和准则，对其是否适合作为食品添加剂进行判断。《食品添加剂法典》所列项目包括例如：化合物，例如酮、甘氨酸、柠檬酸钙、烟酸和肉桂酸；天然添加剂，例如柿黄色素、甘草提取物、结晶纤维素、高色素和瓜尔豆胶；混合制剂，例如l-谷氨酸钠制剂、面条中添加的碱剂、防腐剂制剂和焦油染料制剂等。
89.其它辅助成分可进一步包括例如调味剂、天然碳水化合物、甜味剂、维生素、电解质、着色剂、果胶酸、海藻酸、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和碳化剂。具体而言，作为天然碳水化合物，可使用单糖(例如葡萄糖和果糖)、双糖(例如麦芽糖和蔗糖)、多糖(例如糊精和环糊精)以及糖醇(例如木糖醇、山梨醇和赤藓糖醇)；作为甜味剂，可使用天然甜味剂，如taumatine和甜叶菊提取物或合成甜味剂(例如糖精和阿斯巴甜)。
90.例如，片剂形式的功能性食品可通过常规方法制成颗粒，所述常规方法是将作为本发明活性成分的蜂毒提取物与赋形剂、粘合剂、崩解剂和其它添加剂混合成混合物，然后使用润滑剂等进行压缩成型。或者，混合物可直接压缩成型。此外，如有必要，片剂形式的功能性食品可含有风味增强剂等。
91.在胶囊形式的功能性食品中，硬胶囊可以通过在普通硬胶囊中填充蜂毒提取物与添加剂(如赋形剂)的混合物来制备。软胶囊可以通过在胶囊基质(如明胶)中填充蜂毒提取物与添加剂(如赋形剂)的混合物来制备。如有必要，软胶囊可以含有增塑剂，例如甘油或山梨醇、着色剂、防腐剂等。
92.可通过使用已知方法对蜂毒提取物与赋形剂、粘合剂、崩解剂等的混合物进行模
制成型，来制备丸剂形式的功能性食品。如有必要，可在其表面涂覆蔗糖或其它涂层剂，或在其表面涂覆淀粉或滑石粉等材料。
93.颗粒形式的功能性食品可通过常规已知方法以蜂毒提取物和赋形剂、粘合剂、崩解剂等的混合物的颗粒形式制备，并且如有必要，可含有调味剂或风味增强剂。
94.本发明所述的功能性食品中所含的蜂毒提取物的有效剂量可根据使用目的(例如预防或改善神经炎症紊乱)进行适当调整。
95.所述功能性食品组合物的优势在于，在长期给予普通药物期间不会出现副作用，这是因为它使用食品作为原料，具有极好的便携性，并且可以作为预防或改善神经炎症紊乱的佐剂来摄取。
96.具体实施方式
97.以下，为了帮助理解本发明，将详细描述实施方式。然而，以下实施方式仅仅是对本发明进行说明，本发明的范围不限于以下实施方式。提供本发明的实施方式，以向本领域的普通技术人员更充分地解释本发明。
98.《实施例1》在啮齿动物中基于蜂毒提取物的pla2含量进行单剂量毒性评价
99.1.毒性评价方法：[c57bl/6nwt pla2]
[0100]-动物模型：野生型，7周龄，雄性c57bl/6n小鼠(购自daehanbiolink)
[0101]-药物类型：含有100％的pla2(100％pla2)的蜂毒提取物、含有80％的pla2(80％pla2)的蜂毒提取物、含有50％的pla2(50％pla2)的蜂毒提取物、含有30％的pla2(30％pla2)的蜂毒提取物
[0102]-给予途径：皮下注射(sc)
[0103]-剂量：15mg/kg、7.5mg/kg、3.75mg/kg一次/天
[0104]-观察期和观察项目：给予后3天内每天观察死亡情况
[0105]-组：共65只动物，以下每组5只
[0106]
a.对照(生理盐水，wt)h.50％pla2(15mg/kg)
[0107]
b.100％pla2(15mg/kg)i.50％pla2(7.5mg/kg)
[0108]
c.100％pla2(7.5mg/kg)j.50％pla2(3.75mg/kg)
[0109]
d.100％pla2(3.75mg/kg)k.30％pla2(15mg/kg)
[0110]
e.80％pla2(15mg/kg)l.30％pla2(7.5mg/kg)
[0111]
f.80％pla2(7.5mg/kg)m.30％pla2(3.75mg/kg)
[0112]
g.80％pla2(3.75mg/kg)
[0113]
2.评价结果
[0114]
下表1示出了根据本发明的实施例1的毒性评价结果。
[0115]
参考表1，确定含有pla230％的蜂毒提取物和含有pla250％的蜂毒提取物的近似致死剂量(ald)为15mg/kg，含有pla280％的蜂毒提取物的近似致死剂量为7.5mg/kg，含有pla2100％的蜂毒提取物的近似致死剂量为约3.75mg/kg。
[0116]
[表1]
[0117][0118]
《实施例2》在帕金森病(pd)动物模型中基于蜂毒提取物中的pla2含量评价治疗效果
[0119]
在该实施例中，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐(mptp)诱导的帕金森病动物模型中根据蜂毒提取物中的pla2含量，进行测试以评价疗效。
[0120]
1.测试物质
[0121]
1)测试物质
[0122]-名称：粗蜂毒(加糖蜂毒提取物)/含有pla2 31％的蜂毒提取物(pla2 31％)/含有pla2 53％的蜂毒提取物(pla2 53％)/含有pla2 78％的蜂毒提取物(pla2 78％)
[0123]-外观：白色粉末
[0124]-量：15mg/11.1mg/10.3mg/19.9mg
[0125]-储存条件：冷冻(-20℃)
[0126]-来源：inist st co.，ltd。
[0127]
2)对照材料
[0128]-名称：蜂毒磷脂酶a2(sigma pla2，sigma代号#：p9279)
[0129]-外观：冻干粉
[0130]-量：1mg
[0131]-储存条件：冷冻(-20℃)
[0132]-来源：sigma(sigma，圣路易斯，mo，usa)
[0133]
3)诱导物质
[0134]-名称：mptp(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐)
[0135]-外观：白色粉末
[0136]-量：100mg
[0137]-储存条件：室温
[0138]-来源：sigma(sigma，圣路易斯，mo，usa)
[0139]
2.材料和方法
[0140]
1)测试系统
[0141]
在进行实验时，小鼠体积小，易于操作，便于在动物实验中使用，即使使用它也能获得足够的组织结果和实验结果。使用7周龄雄性c57bl/6j小鼠进行测试，该小鼠由daehan biolink(227，duckho-ro，samsung-myeon，eumsung-gun，chungcheonbuk-do，韩国)提供。这种小鼠广泛用于肿瘤学、免疫学和毒理学研究。
[0142]-收购日期：2018年03月02日
[0143]-收购时的性别、动物数量和体重范围：43只雄性，20-25g
[0144]-开始给予时的重量范围：20-25g
[0145]-使用的动物数量：43只雄性
[0146]
2)繁殖环境
[0147]
(1)环境条件和繁殖方法
[0148]
在spf(无特定病原体(specific pathogen free))环境下培养，调节温度22
±
1℃，相对湿度55
±
15％，通风次数10-20次/小时，照明时间12小时(早上7点开灯-晚上7点熄灯)，照度150-300lux。所有实验均按照kyunghee大学动物实验伦理委员会(animal experimental ethics committee of kyunghee university，khuasp(se)-17-149)的批准进行。
[0149]
(2)饲料和水
[0150]
用于实验动物的固体饲料由orient bio提供，并由小鼠自由摄入，在用微过滤器对水和污水进行消毒之后，使用水瓶自由地摄取水。
[0151]
3)测试组组成和剂量设置
[0152]
(1)测试组组成
[0153]-对照组
[0154]-mptp组(非处理组)
[0155]-sigma pla2组(0.5mg/kg)
[0156]-粗蜂毒组(0.5mg/kg)
[0157]-pla2 31％组(含有31％的pla2的蜂毒提取物，0.5mg/kg)
[0158]-pla2 53％组(含有53％的pla2的蜂毒提取物，0.5mg/kg)
[0159]-pla2 78％组(含有78％的pla2的蜂毒提取物，0.5mg/kg)
[0160]
(2)剂量设置
[0161]
mptp组通过腹腔内(ip)途径注射4次，一天4次，间隔2小时，20mg/kg。
[0162]
sigma pla2组、粗蜂毒组、pla2 31％组、pla2 53％组和pla2 78％组皮下注射(sc)，一天1次，共6天，0.5mg/kg。
[0163]
(3)分组
[0164]
按照以下对动物进行分组。注射mptp后，第二天早上对动物进行行为测试(爬杆测
试)。根据结果，将动物随机分配到各组，以便根据结果尽可能均匀地分配，并满足测试组组成表中规定的数量。
[0165]
(4)识别
[0166]
用油性笔在尾部标记，以识别个体身份。每个鼠笼上都附有一张个体识别卡，具有测试编号、负责测试的主管姓名、负责测试的管理者姓名以及紧急联系信息。
[0167]
(5)给予物质的制备
[0168]
将100mg mptp溶解于1
×
游离碱盐水缓冲液中，以制备成2.5mg/ml的浓度。浓度值是以每只小鼠20mg/kg的剂量经腹腔内(ip)给予200μl时计算得出的值。
[0169]
还将sigma pla2、粗蜂毒、含有31％的pla2的蜂毒提取物(pla231％)、含有53％的pla2的蜂毒提取物(pla2 53％)和含有78％的pla2的蜂毒提取物(pla2 78％)添加到1
×
游离碱盐水缓冲液中。将它们溶解在缓冲液中，并制备成1mg/ml的浓度，稀释至0.5mg/kg的给予浓度，并通过皮下(sc)途径给予至实验动物。
[0170]
4)测试方法
[0171]
(1)动物测试
[0172]
在用mptp诱导帕金森病的情况下，以2小时间隔向小鼠隔腹腔内给予mptp-hcl(生理盐水中20mg/kg游离碱)4次。最后一次mptp注射12小时后，向接受mptp的小鼠皮下注射sigma pla2、粗蜂毒、pla2 31％、pla2 53％和pla2 78％(各0.5mg/kg)6天(图1)。部分小鼠仅注射载体(vehicle)作为对照组。mptp注射后各组小鼠死亡率均低于约0-30％。各组之间没有显著差异。
[0173]
(2)通过爬杆测试测量行为实验
[0174]
将小鼠置于纱布包裹的木杆(长50cm，直径0.8cm)的顶部，小鼠面部朝上(小鼠可以向下移动到杆底部)，对小鼠完全朝下转向所需的时间(t-转向)以及小鼠到达底部所需的总时间(移动活动时间，t-la)分别进行记录，并将时间限制设置为30秒。每只小鼠测试5次，并计算出三个最佳测量值的平均值。将小鼠跳跃或在底部滑动排除在外。
[0175]
(3)th1、th17和treg群的流式细胞术分析
[0176]
使用荧光素异硫氰酸酯(fitc)缀合的抗小鼠cd4、藻红蛋白(pe)缀合的抗小鼠cd25、alexa fluor 647抗小鼠/大鼠foxp3、pe缀合的抗小鼠ifn-γ和percp-青色素5.5(percp-cyanine 5.5)缀合的抗小鼠/大鼠il-17a抗体，对辅助t细胞亚群进行流式细胞术分析。
[0177]
为了对调节性t细胞(treg)进行染色，收集浓度为2
×
106细胞/ml的脾细胞，用pbs缓冲液洗涤两次，然后用稀释在染色缓冲液中的fitc缀合的抗cd4和pe标记的抗cd25抗体，在4℃的黑暗中染色30分钟。然后，用pbs洗涤细胞两次，并在4℃的黑暗中在固定/透化缓冲液中固定1小时。随后，用pbs洗涤细胞两次，并在4℃的黑暗中用alexa fluor647抗foxp3抗体染色过夜。洗涤后，将细胞固定在1％多聚甲醛中，并在4℃的黑暗中储存以用于后续检测。
[0178]
对于细胞内细胞因子染色，用50ng/ml佛波醇肉豆蔻乙酸酯(phorbol myristate acetate，pma)和1,000ng/ml离子霉素对浓度为2
×
106细胞/ml的脾细胞进行刺激。刺激1小时后，加入golgistop，细胞培养4小时。收集培养的细胞，用pbs洗涤两次，然后用稀释在染色缓冲液中的fitc标记的抗cd4抗体，在4℃的黑暗中染色30分钟。在用pbs洗涤后，在室温
下在黑暗中，将细胞在i.c固定缓冲液中固定30分钟。用pbs洗涤后，用pe缀合的抗ifn-γ和percp-青色素5.5缀合的抗il-17a抗体，在4℃的黑暗中对细胞进行染色过夜。用pbs洗涤后，将细胞固定在1％多聚甲醛中，并在4℃的黑暗中储存。然后进行检测。用facs calibur流式细胞仪分析样品，然后使用flowjo软件以图形和表格格式生成数据。
[0179]
(4)组织处理和免疫组织化学(ihc)
[0180]
用异氟烷(isoflurane)(forane溶液；choongwae pharmaceutical，首尔，韩国)麻醉小鼠，在心脏末端注射pbs以进行灌注，然后用溶解在0.1m磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛进行灌注，以用于固定。
[0181]
将固定的小鼠的大脑解剖，在4℃下用4％多聚甲醛固定两天，然后转移到30％蔗糖溶液中，并在4℃下储存，直至其下沉(subside)。用oct化合物固定组织，并使用滑动切片机在低温恒温器中连续切割成30μm厚的冠状切片。收集所有的六个连续组织并进行免疫组织化学染色。
[0182]
作为一级抗体，连接酪氨酸羟化酶(th；1:1000)。用pbs洗涤后，将生物素化二级抗体连接到组织上，并用亲和素-生物素复合物试剂盒(vectastain abc试剂盒)处理该组织。然后，用溶解在0.1m磷酸盐缓冲液中的0.05％二氨基联苯胺-hcl(dab)和0.003％过氧化氢作为反应材料对组织进行着色。然后，用载玻片和盖玻片固定有色组织，并用光学显微镜进行分析。
[0183]
(5)体视学细胞计数
[0184]
在olympus计算机辅助定型工具箱(computer-assisted stereotype toolbox，cast)系统版本2.1.4中，使用光学分馏器方法(optical fractionator method)，对大脑黑质(sn)区域中th阳性多巴胺能神经元的总数进行客观立体评价(objective stereoscopic assessment)。
[0185]
对于细胞计数，使用从致密部尖端到网状部尾部尖端的整个sn区域(前后方向，自前囟-2.06mm至-4.16mm)。使用100
×
的放大率(油物镜)进行实际计算。根据光学分馏器方程计算细胞总数。对每个样品的所有组织进行了300多个点的分析。
[0186]
(6)统计分析
[0187]
为了分析所有实验结果的显著差异，在graphpad prism软件(版本5，ca，usa)中对平均值进行方差分析。在多重比较分析中，根据单向方差分析和newman-kelus检验，在p值小于0.05的情况下，确定在统计学上表现出显著差异。在一次比较中，如果根据双尾学生t检验，在p值小于0.05的情况下，确定在统计学上表现出显著差异。所有实验均以盲法进行，并在相同条件下独立重复。
[0188]
3.结果
[0189]
1)基于蜂毒提取物中pla2含量来测定对mptp诱导的神经毒性运动功能的影响
[0190]
为了基于蜂毒提取物中pla2的含量来评价对于mptp诱导的神经毒性的影响，向小鼠给予mptp，并向小鼠皮下给予sigma pla2、粗蜂毒、pla2 31％(含有31％pla2的蜂毒提取物)、pla2 53％(含有53％pla2的蜂毒提取物)、pla2 78％(含有78％pla2的蜂毒提取物)或生理盐水，从最后一次mptp注射后12小时起，一天一次，持续6天。
[0191]
帕金森病(pd)小鼠模型中通常使用各种行为测试，包括自主活动测试、旋转测试、前掌调节步骤和爬杆测试。在该实施例中，通过mptp诱导的小鼠模型中的爬杆测试，对蜂毒
提取物对pd相关运动紊乱的神经保护作用进行评价。
[0192]
作为结果，如图2所示，与其它对照组相比，仅给予mptp的组显著延长了t-转向和t-la的时间。然而，与sigma pla2给予组类似，pla2 31％、pla2 53％、pla2 78％组的t-转向和t-la时间明显缩短，并且证明这些组具有改善效果。特别是，pla2 78％给予组显示出最大效果。另一方面，mptp组和粗蜂毒组之间的t-转向时间和t-la时间没有显著差异。
[0193]
2)基于蜂毒提取物中pla2含量来测定对mptp诱导pd小鼠中treg细胞群的影响
[0194]
在先前的研究中，与对照相比，pd患者的treg细胞比例降低，并且从pd患者中观察到抑制效应t细胞功能的能力降低。因此，通过流式细胞术分析评价了bvpla2成分含量对treg细胞比例的影响。
[0195]
作为结果，如图3所示，在对照组和mptp组之间的cd4 cd25 foxp3 treg细胞群中未发现显著差异。然而，已确定，与对照组相比，sigma pla2和pla2 78％给予组中treg细胞群增加大于70％，并且pla2 31％和pla2 53％给予组中treg细胞群略有增加。另一方面，在粗蜂毒给予组中，treg细胞群没有显著差异。
[0196]
3)基于蜂毒提取物中pla2含量来测定对mptp诱导pd小鼠中th1和th17细胞计数的影响
[0197]
接着，基于蜂毒提取物中pla2的含量来测定对辅助t细胞表型的影响。用ifn-γ和il-17a的表达代替th1和th17细胞，并通过流式细胞术观察这些细胞的分布。
[0198]
作为结果，如图4所示，mptp组中th1群增加，且th1/th2平衡向th1移动，表明th1型反应得到改善。还确定mptp组中的th17细胞增加。另一方面，与mptp组相比，sigma pla2和pla2 78％给予组的极化th1和th17细胞的ifn-γ和il-17a表达降低。
[0199]
4)基于蜂毒提取物中pla2含量来测定对sn多巴胺能神经元的mptp神经毒性的影响
[0200]
为了评价蜂毒提取物中pla2含量对多巴胺能神经元的保护作用，测量了th(酪氨酸羟化酶)阳性神经元的数量。
[0201]
作为结果，如图5所示，与对照组相比，mptp组显示th阳性神经元数量减少了3倍。用mptp和蜂毒提取物处理后，作为对th免疫染色纹状体中存活的多巴胺能神经元进行分析的结果，确定了sigma pla2和pla2 78％的皮下给予组中sn中的存活th阳性神经元的数量增加。此外还确定了，在pla2 31％和pla2 53％给予组中，th阳性神经元的数量适度增加。另一方面，对于粗蜂毒给予组，sn中的多巴胺能神经元显著减少。
[0202]
4.结论
[0203]
在该实施例中，在帕金森病(pd)动物模型中基于蜂毒提取物中的pla2含量对最大疗效进行了研究。在先前的研究结果中，确定了用于预防pd病理短暂发展的蜂毒提取物的最佳给予途径是皮下(sc)，并且在皮下注射蜂毒提取物的情况下，通过调节mptp诱导的pd小鼠模型中的神经炎症反应来保护多巴胺能神经元。
[0204]
根据该实施例确认了改善pd病理方面的蜂毒提取物中pla2成分的最佳含量，在用含有pla2 78％的药物进行处理的情况下，经确认，mptp毒性模型表现出最佳的神经保护作用，包括以与sigma pla2相似的水平改善运动功能，减少th1和th17极化，并增加th阳性多巴胺能神经元。
[0205]
因此，在mptp诱导的pd小鼠模型中，与含有pla2 31％或pla2 53％的蜂毒提取物
的药物相比，包含含有pla2 78％(pla2 78％)的蜂毒提取物的药物似乎是最有效的，是预防神经损伤的最佳pla2组分含量，pla2 78％药物的皮下给予途径被认为在pd患者的治疗中具有潜在的应用价值。
[0206]
《实施例3》基于蜂毒提取物中pla2成分的含量评价对阿尔茨海默病(ad)动物模型的治疗效果
[0207]
1.实验方法
[0208]
1)材料
[0209]
bvpla2(含有75％-85％pla2的蜂毒提取物)由inistst co.，ltd(gyeonggi-do，大韩民国)提供。将其溶解在磷酸盐缓冲盐水(pbs；最终浓度1mg/ml)中，并在-20℃下储存，直至使用。
[0210]
lps购自sigma(血清型0111:b4；sigma，圣路易斯，mo，usa)。将lps(最终浓度1mg/ml)溶解于pbs中，并将其等分保存在-20℃下直至使用。
[0211]
aβ
1-42
购自(大鼠，布里斯托尔，英国)，且aβ
1-42
(最终浓度200μm)溶解于0.1％的氨中，并在-70℃下储存。
[0212]
2)水迷宫测试
[0213]
根据记忆测试常用的方法进行水迷宫实验。迷宫实验通过smart-cs(panlab，巴塞罗那，西班牙)项目和设备进行。将一个圆形塑料池(高度：35cm，直径：100cm)装满用脱脂牛奶制成的不透明的水，保持在22-25℃。逃生平台(高度：14.5cm，直径：4.5cm)浸没在水位以下1-1.5cm处。测试在两个旋转起始位置的单个平台上进行。测试后，小鼠在平台上停留120秒，然后送回到它们的笼子里。用连接到smart-ld程序(panlab，巴塞罗那，西班牙)的池中心上方的摄像机监测每只小鼠的逃避潜伏期和逃避距离。
[0214]
3)探索测试
[0215]
为了测试记忆保留，在水迷宫实验后24小时进行探索测试。将平台从水迷宫实验中使用的池中移除，并让小鼠自由游泳。使用smart-ld程序(panlab，巴塞罗那，西班牙)监测并记录每只小鼠的游泳模式60秒。通过在目标象限区域花费的时间，来计算保留的空间记忆。
[0216]
4)被动回避表现测试
[0217]
被动回避实验通常被认为是测试记忆的简单实验。被动回避反应是使用“避暗(step-through)”装置(med associates inc.，佛蒙特州，美国)确定的，该装置分为明亮隔间和黑暗隔间(分别为20.3
×
15.9
×
21.3cm)，通过小闸门彼此相邻，所述小闸门具有间隔8mm的3.175mm不锈钢棒网格底部。
[0218]
第一天，将小鼠置于远离黑暗隔间的明亮隔间中进行训练试验。当小鼠完全移动到黑暗隔间中时，会产生电击(0.45ma，持续3秒)。之后，将小鼠送回它们的笼子。训练测试后一天，将小鼠置于明亮隔间中，测量进入黑暗隔间的停留时间(定义为“停留时间”)。记录小鼠进入黑暗隔间所需的时间，并通过逐步停留时间进行描述。记忆测试设定了三分钟的截止期限。
[0219]
5)脑组织的收集和保存
[0220]
在行为实验后，通过co2吸入在麻醉下向小鼠灌注含有肝素的pbs。在颅骨立即从大脑中取出后，仅分离海马体区域并在-80℃下储存，直到进行生化分析。
[0221]
6)硫磺素s染色
[0222]
在转移到30％蔗糖溶液中后，使用恒冷箱切片机(leica cm 1850；leica microsystems，首尔，韩国)将大脑切成20μm的切片。用蒸馏水洗涤5分钟后，将脑切片转移到涂有明胶的载玻片上，并在含有1％硫磺素s的50％乙醇(sigma，圣路易斯，mo，usa)中放置8min。然后，用蒸馏水洗涤脑切片，然后在50％、70％、90％和100％的各级乙醇中脱水2min。然后用封固剂(fluoromount
tm aqueous mounting medium；sigma，圣路易斯，usa)对切片进行固定。用荧光显微镜(axio observer a1；carl zeiss，奥博科亨，德国)(
×
50和
×
200)观察硫磺素s染色。
[0223]
7)β-分泌酶活性分析
[0224]
使用商业上可获得的β-分泌酶活性分析试剂盒(abcam，inc.，剑桥，ma，usa)测定小鼠大脑中的β-分泌酶活性。使用β-分泌酶提取缓冲液从脑组织提取可溶性膜，在冰上培养1小时，并在4℃下以5000
×
g离心10分钟以收集上清液。
[0225]
向每个孔(96孔板)中添加共计50μl的样品(100μg总蛋白)或空白(50μl的β-分泌酶提取缓冲液)，然后将50μl的2
×
反应缓冲液和2μl的β-分泌酶底物在37℃的暗室中孵育1小时。使用荧光光谱仪(gemini em；molecular devices，ca，usa)分别在335nm和495nm的激发和发射波长下读取荧光。
[0226]
8)β-淀粉样蛋白(aβ)的测量
[0227]
通过含有蛋白酶抑制剂的蛋白质提取缓冲液，获得脑组织的裂解物。分别使用特异性小鼠β-淀粉样肽1-42酶联免疫吸附分析(elisa)试剂盒(csb-e10787m；cusabio，休斯顿，usa)和小鼠β-淀粉样肽1-40elisa试剂盒(csb-e08300m；cusabio，休斯顿，usa)，对aβ
1-42
和aβ
1-40
水平进行测量。
[0228]
使用蛋白质提取缓冲液(pro-prep；intron biotechnology，kyungki-do，韩国)从脑组织中提取蛋白质，在冰上培养1小时，并在4℃下以13,000
×
g离心15分钟。简单地说，将100μl样品添加到预涂板中，并在37℃下培养2h。去除未结合的原料后，将对aβ特异的生物素缀合抗体添加到孔中。洗涤后，将亲和素缀合的辣根过氧化物酶(hrp)添加到孔中。洗涤去除未结合的亲和素酶试剂后，向孔中添加底物溶液，并按照初始步骤中结合的aβ的量成比例显影。停止彩色显影并测量颜色强度。
[0229]
9)免疫组织化学染色
[0230]
在转移至30％蔗糖溶液中后，使用恒冷箱切片机(leica cm 1850；leica microsystems，首尔，韩国)将大脑切成20μm的切片。在pbs(ph7.4)中各洗涤两次10min后，将样品与含有3％过氧化氢和1％triton-x(triton-x)的pbs孵育30min，以回收抗原和阻断内源性过氧化物酶，并额外用pbs洗涤两次各10分钟。
[0231]
将脑切片在3％牛血清白蛋白(bsa)溶液中封闭1小时，然后与神经胶质纤维酸性蛋白(gfap；1:300；santa cruz biotechnology，inc.，圣克鲁斯，ca，usa)、诱导型一氧化氮合酶(inos；1:300；abcam，inc.，剑桥，ma，usa)、离子钙结合衔接分子1(iba-1；1:300；abcam，inc.，剑桥，ma，usa)和环氧合酶2(cox-2；1:300，novus biologicals，inc.，co，usa)一起孵育，在4℃下过夜。
[0232]
在用一级抗体孵育后，用pbs洗涤脑切片三次，每次10分钟。洗涤后，在室温下将脑切片与生物素化山羊抗兔、山羊抗鼠或驴抗山羊igg辣根过氧化物酶(hrp)二级抗体(1:
500；santa cruz biotechnology，inc.，圣克鲁斯，ca，usa)一起孵育1-2小时。将脑切片用pbs洗涤三次，每次10min，并通过色原体二氨基联苯胺(vector laboratories，伯林盖姆，ca，usa)反应观察至多10min，以进行可视化。
[0233]
最后，将脑切片在乙醇中脱水，从二甲苯中移出，固定在permount(fisher scientific，hampton，nh，usa)上，并通过光学显微镜(microscope axio imager.a2；carl zeiss，oberkochen，德国；
×
50以及
×
200)进行评价。
[0234]
10)蛋白质印迹分析
[0235]
为了检测靶蛋白，使用了针对inos、iba-1、gfap、app的特异性抗体以及bace1(1:1000；abcam，inc.，剑桥，uk)，cox-2(1:1000；novus biologicals，inc.，co，usa)，c-jun n-末端激酶(jnk)，细胞外信号调节激酶(erk)1/2、p-p38和p38(1:000；cell signaling technology，inc.，ma，usa)，p-stat3、stat3、p-erk1/2、p-jnk和β-肌动蛋白(1:200；santa cruz biotechnology inc.，圣克鲁斯，ca，usa)。
[0236]
用相应的缀合的二级抗体对印迹进行孵育，所述二级抗体例如获得自santa cruz biotechnology inc.(圣克鲁斯，ca，usa)的抗鼠、抗兔和抗山羊。用增强的化学发光蛋白质印迹检测系统，对免疫反应蛋白进行检测。
[0237]
11)细胞因子水平测量
[0238]
通过定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)，对促炎细胞因子和抗炎细胞因子水平进行测量。使用riboex(geneall biotechnology，首尔，韩国)从海马体组织提取总rna，并使用高容量cdna逆转录试剂盒(thermo scientific，沃尔瑟姆，ma，usa)来合成cdna。
[0239]
在7500实时pcr系统(applied biosystems，福斯特城，ca，usa)上对定制引物进行qrt-pcr，并使用hipi实时pcr sybr green master mix(elpis biotech，大田，韩国)将β-肌动蛋白用作内部对照。
[0240]
循环条件由以下步骤组成：94℃下3分钟的初始变性步骤、94℃下30秒的变性步骤、60℃下30秒的退火步骤和72℃下1分钟的延伸步骤，持续直至40个循环。将获得的靶基因表达值标准化为β-肌动蛋白，并量化对照样品中的表达。
[0241]
用下表2中的引物进行每个样品。
[0242]
[表2]
[0243][0244]
12)bv-2小胶质细胞培养
[0245]
培养小胶质细胞bv-2，同时用lps(1μg/ml)或aβ
1-42
(2.5μm)和溶解在pbs中的不同浓度的bvpla2(0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml)进行处理。24小时后收集细胞，测量细胞活力、一氧化氮浓度和促炎细胞因子水平。
[0246]
13)细胞活力分析
[0247]
将bv-2细胞置于96孔板中，然后用bvpla2(0-1μg/ml)处理24小时。治疗后，通过mtt溶液[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物](sigma aldrich，圣路易斯，mo)测定细胞活力。将含有1/10体积细胞培养基的mtt溶液添加到每个孔中，并在移除前将混合物在co2孵育箱中孵育2小时。从细胞中移除混合物后，将二甲基亚砜(dmso)添加到相同体积的培养基中。然后，在570nm波长下用微孔板吸光度读取器读取每个孔的吸光度。
[0248]
14)一氧化氮分析
[0249]
使bv-2细胞在96孔板中生长，然后在不存在或存在不同浓度bvpla2(0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml)的情况下，在存在或不存在lps(1μg/ml)下培养24小时。通过一氧化氮检测试剂盒(no检测试剂盒，intron biotechnology，kyungki-do，韩国)分析上清液中的亚硝酸盐浓度。通过微孔板吸光度读数器测量520nm处的吸光度，并使用一系列已知浓度的亚硝酸钠作为标准。
[0250]
15)下拉分析
[0251]
将bvpla2与环氧活化的琼脂糖凝胶4b缀合(ge healthcare korea，首尔，韩国)。
[0252]
简单而言，将1mg bvpla2溶解在1ml偶联缓冲液(0.1m nahco3和0.5m nacl，ph 11.0)中。使0.1g环氧活化的琼脂糖凝胶4b珠溶胀，并在烧结玻璃过滤器上用1mm hcl洗涤，然后用偶联缓冲液洗涤。将环氧活化的琼脂糖凝胶4b珠添加到含有bvpla2的偶联缓冲液中，并在4℃下旋转过夜。在不存在bvpla2的情况下，如上制备对照未缀合的琼脂糖凝胶4b珠。
[0253]
清洗后，在室温下用封闭缓冲液(0.1m tris-hcl，ph 8.0)封闭未被占据的结合位点3小时。用3个循环的置换ph洗涤缓冲液(缓冲液1:0.1m醋酸盐和0.5m nacl，ph 4.0；缓冲液2:0.1m tris-hcl和0.5m nacl，ph8.0)洗涤bvpla2缀合的琼脂糖凝胶4b。然后，用结合缓冲液(0.05m tris-hcl和0.15m nacl，ph 7.5)对bvpla2缀合珠进行平衡。
[0254]
为了证明bvpla2和stat3的结合，通过用stat3dna转染使stat3蛋白过度表达。根据制造商的方案，在opti-mem中使用3000(invitrogen，沃尔瑟姆，ma，usa)，用stat3dna(六孔板，700ng/每孔)转染bv-2细胞。将bv-2细胞裂解物(1mg蛋白质)与bvpla2缀合的琼脂糖凝胶4b或未缀合的琼脂糖凝胶4b混合，并在4℃下培养过夜。之后，用tbst对珠洗涤三次。
[0255]
用十二烷基硫酸钠(sds)上样缓冲液对结合蛋白进行洗脱，使用sds/聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后用针对stat3的抗体进行免疫印迹(1:200，santa cruz biotechnology，达拉斯，tx.，usa)。
[0256]
16)荧光素酶分析
[0257]
将bv-2细胞置于12孔板(8
×
104细胞/孔)中，并根据制造商说明书(invitrogen，卡尔斯巴德，ca，usa)，在opti-mem中使用lipofectamine 3000用stat3-luc(stratagene，la jolla，ca，usa)质粒进行瞬时转染24小时。经转染的细胞分别用1μg/ml lps和0.01μg/ml、0.1μg/ml和1μg/ml bvpla2处理24小时。根据制造商说明书(winglow，bad wildbad，德国)，使用dual-reporter assay system试剂盒(promega，madison，wi，usa)和光度计对荧光素酶活性进行测量。
[0258]
17)对接实验
[0259]
使用stat3的bvpla2的对接研究使用autodock vina进行(trott和olson，2010)。从protein data bank检索stat3[pdb:3cwg]和bvpla2[pdb:1poc]的三维结构，并使用autodock工具进一步制备。网格框以stat3单体为中心，并调整网格框的大小以包括整个单体。对接实验在16、24、32、40和60的不同默认穷举值(exhaustiveness value)下进行。使用discovery studio visualizer 2.0生成最佳结合模型的分子图形。
[0260]
18)统计分析
[0261]
使用graphpad prism软件(版本4.03；graphpad software，inc.，圣地亚哥，ca，usa)分析数据。数据以平均值
±
sem表示。所有数据差异均通过单向方差分析(anova)进行评价。当p值在学生t检验中显示统计显著性时，通过dunnett's检验评价差异。认为p值《0.05在统计学上是显著的。
[0262]
2.蜂毒提取物的体外作用
[0263]
1)bvpla2对神经炎症和淀粉样蛋白生成的作用的测定
[0264]
通过蛋白质印迹测定了由bvpla2处理引起的小胶质细胞(bv-2细胞)中的淀粉样
前体蛋白(app)、β-分泌酶1(bace1)、β-淀粉样蛋白(aβ)的表达水平变化。作为结果，如图6a所示，细胞中app、bace1和β-淀粉样蛋白(aβ)的水平因lps处理而升高，而在用bvpla2处理后，其水平以浓度依赖性方式降低。
[0265]
由于β-淀粉样蛋白是由活化的β-分泌酶产生的，因此进行了β-分泌酶活性分析。作为结果，如图6b所示，发现在用bvpla2处理后，lps增加的β-分泌酶活性以浓度依赖性方式降低。
[0266]
通过蛋白质印迹对炎症蛋白如inos、cox-2和iba-1(活化的小胶质细胞的标志物)的水平进行测定。作为结果，如图6c所示，在用lps处理后，inos、cox-2和iba-1的表达水平增加，并且在用bvpla2处理后，inos、cox-2和iba-1的表达水平以浓度依赖性方式降低。
[0267]
为了确定bvpla2是否影响nf-κb转位的抑制，通过蛋白质印迹测定了bv-2细胞细胞核中nf-κb亚基的水平。作为结果，如图6d所示，经lps处理后，p65和p50在细胞核中的表达水平均增加，但它们的表达水平在经bvpla2处理后以浓度依赖性方式降低。
[0268]
此外，进行qrt-pcr以确定bvpla2是否对促进炎症反应的促炎细胞因子的减少有影响。作为结果，如图6e所示，促炎细胞因子中广泛分布于神经元中的tnf-α、il-1β和il-6水平因lps处理而迅速升高，而在经bvpla2处理后，tnf-α、il-1β和il-6水平以浓度依赖性方式降低。
[0269]
基于此，可以证实bvpla2通过降低β-分泌酶活性以及app和bace1的细胞内水平，对小胶质细胞中的β-淀粉样蛋白积累具有抑制作用，并且通过降低细胞内inos和cox-2水平以及降低促炎细胞因子的表达水平，还具有缓解神经炎症的作用。
[0270]
2)蜂毒提取物对神经炎症的协同作用测定
[0271]
为了确定蜂毒提取物和nf-κb抑制剂对神经炎症的协同作用，通过用lps(1μg/ml)和bvpla2(100ng/ml)处理bv-2细胞进行了蛋白质印迹和qrt-pcr。
[0272]
首先，如图7a所示，作为通过蛋白质印迹所测量的与神经炎症相关的inos和cox-2水平的结果，在用bvpla2和bay 11-7802(nf-κb抑制剂)单独处理细胞的情况下，inos和cox-2均降低，在同时用bvpla2和nf-κb抑制剂bay 11-7802处理细胞的情况下，inos和cox-2的水平进一步降低。
[0273]
如图7b所示，作为对与nf-κb信号通路相关的p-iκbα的细胞内水平以及细胞核中p65和p50水平的蛋白质印迹测量的结果，在用bvpla2和nf-κb抑制剂(bay 11-7802)单独处理细胞的情况下，lps处理引起的p-iκbα、p65和p50的增加均得到缓解，在同时用bvpla2和nf-κb抑制剂(bay 11-7802)处理细胞的情况下，p-iκbα、p65和p50的水平进一步降低。
[0274]
为了研究bvpla2和nf-κb抑制剂对bv-2细胞中lps处理引起的促炎细胞因子tnf-α、il-1β和il-6增加的影响，通过qrt-pcr测量细胞内表达量。作为结果，如图7c所示，在单独使用bvpla2和nf-κb抑制剂(bay 11-7802)处理细胞的情况下，可以确定，由于lps降低，tnf-α、il-1β和il-6的表达水平增加，并且在同时用这两种抑制剂处理细胞的情况下，可以确定，促炎细胞因子的表达水平比单独处理的细胞的表达水平进一步降低，并降至对照组的水平。
[0275]
因此，可以确认，当与nf-κb抑制剂(bay 11-7802)组合时，bvpla2对小胶质细胞(bv-2细胞)中的神经炎症缓解作用更强。
[0276]
3.蜂毒提取物对阿尔茨海默病-lps诱导小鼠神经炎症动物模型的影响
[0277]
1)蜂毒提取物的记忆缓解作用的测定
[0278]
该实施例中的阿尔茨海默病动物模型是通过注射lps来诱发神经源性炎症的小鼠，其记忆丧失和β-淀粉样蛋白积累与阿尔茨海默病患者相似。
[0279]
为了研究bvpla2是否能有效治疗阿尔茨海默病，以每周250μg/kg的剂量通过腹腔内注射lps来诱导阿尔茨海默病，并且通过每周腹腔内注射3次来给予bvpla2(图8)。每次注射均以2小时以上的固定时间间隔进行给予而不同时进行给予，伴随lps和bvpla2的给予，在诱导和给予期间进行行为实验，以测量记忆衰退的程度(阿尔茨海默病的典型症状)。
[0280]
morris水迷宫实验是一种经常用于评价学习能力和空间记忆能力的行为实验，每天进行两次，持续6天。作为结果，如图9a和图9b所示，对照组在第6天移动352.61cm以平均24.64秒找到平台，而lps组移动502.79cm以平均37秒找到平台。另一方面，发现2mg/kg bvpla2给予组移动229.97cm以平均26.14秒找到平台。
[0281]
换言之，由于lps组比对照组花费更长的时间找到平台(更长的逃避潜伏期)并移动更长的距离(更长的逃避距离)，可以确定学习能力和空间记忆能力降低。另一方面，由于bvpla2给予组以浓度依赖性方式降低了逃避潜伏期和逃避距离，可以确定给予bvpla2缓解了lps处理引起的小鼠学习能力和空间记忆能力的下降。
[0282]
完成morris水迷宫后的第二天，进行探索测试以评价记忆保持能力。如图9c所示，作为结果，对照组在60秒内在目标上停留平均为24.83％，而lps组在同一时间内在目标上停留平均为17.79％，停留时间缩短。另一方面，在bvpla2 0.02mg/kg、0.2mg/kg和2mg/kg给予组中，平均停留时间分别为23.44％、25.33％和27.29％，表明与lps组相比，停留时间增加。
[0283]
作为最后一个行为实验，进行了被动回避测试，以测试受试者的记忆时长。如图9d所示，作为结果，在训练试验中，所有组从明亮隔间移动到黑暗隔间所需的时间没有差异，但第二天测试时，对照组平均停留69.63秒，lps组平均停留18.45秒。另一方面，对于0.2mg/kg和2mg/kg bvpla2给予组，在明亮隔间中的平均停留时间分别为46.92秒和67.59秒，表明与lps组相比，停留时间显著增加。
[0284]
因此，根据阿尔茨海默病动物模型的行为实验结果，可以确定bvpla2缓解了学习能力、空间记忆能力、记忆保持能力和记忆方面的衰退，这些是阿尔茨海默病典型症状。
[0285]
2)蜂毒提取物的淀粉样变性减少作用的测定
[0286]
为了确认蜂毒提取物是否对淀粉样变性有影响，通过elisa测量了小鼠脑组织中β-淀粉样蛋白(aβ)的产生。如图10a所示，作为结果，lps组的β-淀粉样蛋白积累平均约为对照组的1.6倍，而bvpla2给予组显示β-淀粉样蛋白的积累呈浓度依赖性下降。
[0287]
由于β-淀粉样蛋白(aβ)是由降解淀粉样前体蛋白(app)的β-分泌酶产生的，因此进行了β-分泌酶活性分析，以测量β-分泌酶的活性。如图10b所示，作为结果，与对照组相比，lps组的β-分泌酶活性增加，并且由于bvpla2处理，β-分泌酶活性以浓度依赖性方式降低。
[0288]
此外，作为通过蛋白质印迹测定bvpla2处理引起的小鼠脑组织中app、bace1和β-淀粉样蛋白(aβ)水平的变化结果，如图10c所示，lps组的app、bace1和aβ水平迅速升高，而bvpla2给予组的app、bace1和aβ水平呈浓度依赖性降低。
[0289]
基于此，可以确认bvpla2降低了影响β-淀粉样蛋白积累的β-分泌酶的活性，从而
降低了app、bace1和aβ的水平，缓解了阿尔茨海默病症状。
[0290]
3)蜂毒提取物的神经炎症作用的测定
[0291]
为了确定蜂毒提取物对lps诱导的阿尔茨海默病小鼠脑组织中神经炎症变化的影响，通过免疫组织化学方法，对炎症蛋白的表达水平以及星形胶质细胞和小胶质细胞的活性进行研究。
[0292]
作为结果，如图11a所示，发现lps组中gfap反应性细胞和iba-1反应性细胞的数量相比对照组增加，这表明星形胶质细胞和小胶质细胞的激活导致神经退行性紊乱的发展。另一方面，在bvpla2给予组中，gfap反应细胞和iba-1反应细胞的数量以浓度依赖性方式减少，表明bvpla2抑制神经退行性紊乱(如阿尔茨海默病)的发作。
[0293]
此外，如图11b所示，与对照组相比，lps组中的inos反应细胞和cox-2反应细胞数量增加，表明脑组织因lps而发炎。另一方面，经bvpla2处理的小鼠脑组织中的inos反应细胞和cox-2反应细胞以浓度依赖性方式减少，表明bvpla2有助于缓解神经炎症反应。
[0294]
4)测定蜂毒提取物对神经炎症变化的影响
[0295]
为了研究蜂毒提取物对lps诱导的阿尔茨海默病小鼠脑组织中神经炎症变化的影响，通过蛋白质印迹测定了炎症蛋白的表达水平以及星形胶质细胞和小胶质细胞的活性。
[0296]
作为结果，如图12a所示，与对照组相比，lps组中的inos和cox-2的表达水平显著增加，表明脑组织因lps而发炎。另一方面，发现bvpla2处理的小鼠脑组织中inos和cox-2的表达水平以浓度依赖性方式降低，表明bvpla2有助于缓解神经炎症反应。
[0297]
此外，与对照组相比，lps组中gfap(星形胶质细胞激活标志物)和iba-1(小胶质细胞激活标志物)的表达增加，表明星形胶质细胞和小胶质细胞的激活导致神经退行性疾病的发展。另一方面，在bvpla2给予组中，gfap和iba-1的表达降低，表明bvpla2抑制神经退行性紊乱(如阿尔茨海默病)的发作。
[0298]
为了确定bvpla2是否影响小鼠脑组织中的nf-κb转位抑制，通过蛋白质印迹测定了海马体细胞核中nf-κb亚基p50和p65的水平以及细胞溶质中p-iκbα的水平。
[0299]
作为结果，如图12b所示，lps组中细胞核中的p65和p50水平均升高，而在给予bvpla2的情况下，这些水平以浓度依赖性方式降低。同样，在p-iκbα的情况下，lps组中的水平升高，而在给予bvpla2的情况下，该水平以浓度依赖性方式降低。
[0300]
为了研究bvpla2是否影响促进小鼠脑组织炎症反应的促炎细胞因子表达水平的降低，通过elisa对tnf-α、il-1β和il-6的表达水平进行测量和比较。
[0301]
作为结果，如图12c所示，发现与对照组相比，lps组中tnf-α、il-1β和il-6的表达水平迅速增加，并且在用bvpla2处理的情况下，所有tnf-α、il-1β和il-6的水平均以浓度依赖性方式显著降低。
[0302]
综合这些结果，可以确定给予bvpla2有助于缓解lps诱导的阿尔茨海默病小鼠模型中的神经炎症。
[0303]
5)测定蜂毒提取物对treg(调节性t细胞)的作用
[0304]
为了检测蜂毒提取物对可抑制lps诱导的阿尔茨海默病小鼠脑组织中炎症反应的调节性t细胞的影响，通过免疫组织化学、qrt-pcr和蛋白质印迹对treg标志物foxp3的水平进行测定。
[0305]
作为结果，如图13a和图13b所示，与对照组相比，lps组中的foxp3反应细胞数量减
少，表明lps引起的炎症发生。此外，发现bvpla2处理的小鼠脑组织中foxp3反应性细胞的数量以浓度依赖性方式增加，表明bvpla2通过激活treg有助于缓解神经炎症。
[0306]
作为通过qrt-pcr研究bvpla2是否对小鼠脑组织中的foxp3表达有影响的结果，如图13c所示，相对于对照组，lps组中的foxp3表达水平降低，并且发现bvpla2处理后，foxp3的表达水平以浓度依赖性方式恢复到对照组的水平。
[0307]
作为通过蛋白质印迹确定小鼠脑组织中foxp3水平是否发生变化的结果，如图13d所示，发现在用bvpla2处理后，foxp3的表达水平以浓度依赖性方式增加。
[0308]
基于此，可以确定bvpla2激活了调节性t细胞，从而缓解了阿尔茨海默病引起的神经炎症症状。
[0309]
6)基于蜂毒提取物的给予途径来比较记忆丧失的减轻效果和β-淀粉样蛋白(aβ)积累的抑制效果
[0310]
基于蜂毒提取物的给予途径，为了比较记忆丧失的减轻效果和β-淀粉样蛋白积累的抑制效果，以每天250μg/kg的剂量通过腹腔内注射lps一周来诱发阿尔茨海默病，并以每天0.2mg/kg的剂量通过每周3次腹腔内注射或皮下注射来给予bvpla2(图8)。每次注射均以2小时以上的固定时间间隔进行给予且不同时进行给予，伴随lps和bvpla2的给予，在诱导和给予期间进行行为实验，以测量记忆衰退的程度(阿尔茨海默病的典型症状)。
[0311]
作为进行经常用于评价学习能力和空间记忆能力的行为实验的morris水迷宫(每天两次，持续6天)的结果，如图14a和图14b所示，在第6天，对照组通过移动352.61cm以平均24.64秒找到平台。然而lps组通过移动502.79cm以平均37秒找到平台。另一方面，在bvpla20.2mg/kg腹腔内给予组中，其移动了404.9cm以平均28.94秒找到平台，而皮下注射给予组移动了319.6cm以平均22.08秒找到平台。
[0312]
因此，可以确定当通过皮下注射给予bvpla2(0.2mg/kg)时，小鼠学习能力和空间记忆能力下降的缓解效果大于通过腹腔内注射给予时的效果。
[0313]
作为在morris水迷宫完成后的第二天进行探索测试以评价记忆保持能力的结果，如图14c所示，对照组在60秒内在目标上停留平均为24.83％，但lps组通过在同一时间段内在目标上停留平均17.79％，从而缩短了停留时间。另一方面，bvpla2 0.2mg/kg的腹腔内注射给予组的平均停留时间为25.33％，皮下注射给予组的平均停留时间为26.22％。因此，确定与腹腔内注射给予组相比，皮下注射给予组的停留时间延长。
[0314]
作为用于测试受试者的记忆时长的被动回避实验的结果，作为最后一次行为实验，如图14d所示，在所有组的训练试验中，小鼠从明亮隔间移动到黑暗隔间花费的时间没有差异。然而，第二天测试时，对照组平均停留69.63秒，且lps组平均停留18.45秒。另一方面，bvpla20.2mg/kg腹腔内注射给予组平均停留46.92秒，皮下注射给予组平均停留38.03秒。因此，确定腹腔内注射给予组在明亮隔间中的停留时间更长。
[0315]
因此，考虑到阿尔茨海默病动物模型中的上述行为实验结果，与相同剂量的腹腔内注射给予相比，确定皮下注射给予时bvpla2可在缓解阿尔茨海默病的典型症状(如学习能力、空间记忆能力、记忆保持能力和记忆能力的衰退)方面具有更大的效果。
[0316]
此外，为了确定bvpla2给予方法的差异是否表现出对淀粉样变性的影响的差异，通过elisa对小鼠脑组织中β-淀粉样蛋白的生成进行了测量。作为结果，如图14e所示，确定lps组的β-淀粉样蛋白水平相较于对照组显著增加，而当用bvpla2处理时则降低。
[0317]
特别是，皮下注射组的β-淀粉样蛋白水平低于腹腔内注射组的β-淀粉样蛋白水平，并且确定当通过皮下注射给予bvpla2时，所述水平降低至与对照组相似的水平。
[0318]
4.蜂毒提取物对阿尔茨海默病-tg2576小鼠动物模型的影响
[0319]
1)实验动物的选择和处理
[0320]
该实施例中使用的阿尔茨海默病动物模型是诱导痴呆的转基因tg2576小鼠(swapp；在患有早发家族性阿尔茨海默病的swedish家族中发现的具有双突变(k670n/m671l)的小鼠)，其广泛用作阿尔茨海默病小鼠模型，并且显示出β-淀粉样蛋白(aβ)的年龄依赖性增加和淀粉样斑块的产生。tg2576小鼠大脑中的淀粉样蛋白积累的特征在于，突触素蛋白表达减少，以及参与神经突触形成、细胞骨架形成和新陈代谢的蛋白质的基因表达减少。
[0321]
在aβ输注模型中，将aβ输注泵注入小鼠大脑的一个半球，使大脑中的aβ浓度保持在300pmol，持续14天，以诱导神经退行性变和大脑功能损伤，同时伴有学习和记忆损伤。这可由tg2576替代，因为tg2576表达人类app 695(swapp)基因，并导致大脑中淀粉样蛋白积累。然而aβ输注模型只是因aβ诱导的神经毒性而导致大脑功能受损，而tg2576小鼠是因基因的复杂机制而导致大脑功能受损，因此更适合阿尔茨海默病治疗的发展。
[0322]
此外，swapp/ps2小鼠包含与tg2576小鼠模型相同的swapp基因，其为表达突变ps2基因并在遗传上导致淀粉样蛋白积累的模型，并被用作阿尔茨海默病的小鼠模型。由于因先天性淀粉样蛋白积累而表现出阿尔茨海默氏痴呆症症状，可将其用tg2576进行替代，在该实施例中，选择tg2576小鼠作为阿尔茨海默病动物模型。
[0323]
按照食品和药物安全部的人道动物保护和使用指南(humane animal care and use guidelines)，对12个月龄的tg2576小鼠进行管理和处理。具有人app695(携带swedish双突变(happ；huapp695；k670n/m671l))的tg2576小鼠购自taconic farms(日耳曼敦，ny，usa)，并将该品系保存在韩国忠北国立大学的动物实验室中。将tg2576小鼠随机分为两组：对照组和bvpla2(1mg/kg)处理组，每组10只小鼠。
[0324]
每周腹腔内注射bvpla2两次，持续4周。或者，向对照小鼠给予相同剂量的载体。使用水迷宫、探索和被动回避实验，对行为实验的学习和记忆能力进行评价。在行为实验后通过co2窒息处死小鼠。
[0325]
2)测定蜂毒提取物对tg2576小鼠遗传性记忆障碍的缓解作用
[0326]
tg2576小鼠(该实施例中使用的ad(阿尔茨海默病)小鼠模型)过度表达人app并伴有在sweden家族性ad中发现的突变。tg2576小鼠在6个月大时快速产生aβ，然后在9到12个月大时开始产生aβ斑块。在13个月时，aβ斑块水平迅速升高，且小鼠表现出ad症状，如认知能力受损。
[0327]
为了确定蜂毒提取物在tg2576 ad小鼠模型中的记忆改善效果，通过腹腔内注射每周两次向小鼠给予bvpla2(1mg/kg)，持续4周(图15a)。给予四周后，连续进行morris水迷宫、探索和被动回避实验，以评价学习能力和空间记忆能力。测量逃避潜伏期和距离，以确定bvpla2对记忆改善的影响。
[0328]
作为结果，如图15b和图15c所示，对照组在第6天的平均逃避潜伏期和游泳距离分别为约29.71
±
4.189秒和346.1
±
71.43cm。另一方面，bvpla2给予组的平均逃避潜伏期和距离分别为19.36
±
2.790秒和186.8
±
28.48cm，与对照组相比显著降低。
[0329]
完成morris水迷宫的第二天，进行探索测试以评价记忆保持能力。作为结果，如图15d所示，与对照组(12.31
±
3.355％)相比，bvpla2给予组(30.54
±
4.992％)在目标象限的平均停留时间显著增加。
[0330]
如图15e所示，作为在探索测试后2天进行的被动回避实验的结果，对照组在明亮隔间内的平均避暗停留时间显示为36.17
±
8.310秒，bvpla2给予组的时间显示为107.5
±
20.90秒，其与对照组相比显著增加。
[0331]
3)蜂毒提取物的aβ积累抑制作用的测定
[0332]
ad最著名的原因是aβ积累。因此，进行硫磺素s染色以确定蜂毒提取物对tg2576小鼠大脑中遗传诱导的aβ积累的影响。硫磺素s染色主要用于对aβ斑块中发现的aβ中富含β折叠的结构进行染色。作为结果，如图16a所示，发现与对照组相比，bvpla2给予组中aβ斑块的积累显著减少。
[0333]
使用tg2576小鼠大脑的蛋白质印迹分析，对参与aβ产生的app和bace1水平进行。作为结果，如图16b所示，发现与对照组相比，bvpla2给予组中app和bace1的表达水平降低。
[0334]
进行elisa，以定量测量tg2576小鼠脑内aβ
1-42
水平和aβ
1-40
水平。作为结果，如图16c所示，对照组大脑中的aβ
1-42
水平为3039
±
116.8pg/mg蛋白，并且bvpla2给予组的aβ
1-42
水平为2236
±
244.9pg/mg蛋白。此外，如图16d所示，对照组大脑中的aβ
1-40
水平为2182
±
168.6pg/mg，并且bvpla2给予组的aβ
1-40
水平为1593
±
53.25pg/mg。比较两组之间的淀粉样蛋白水平，发现给予bvpla2显著降低了tg2576小鼠大脑中的aβ水平。
[0335]
为了确定bvpla2如何减少淀粉样蛋白的生成，分析了大脑中的β-分泌酶活性。作为结果，如图16e所示，确定通过给予bvpla2，β-分泌酶活性显著降低。
[0336]
通过mtt分析，测定了bvpla2对bv-2细胞中细胞活力的影响(图18a)。由于与对照组相比，用bvpla2(0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml)处理的组未在细胞活力方面显示出显著变化，因此确定bvpla2在bv-2细胞中在至多1μg/ml下是无毒的。
[0337]
为了研究bvpla2对体外淀粉样蛋白生成的影响，用lps和不同浓度的bvpla2(0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml)处理bv-2细胞24小时。通过elisa测定bv-2细胞中的aβ
1-42
水平。
[0338]
作为结果，如图16f所示，对照组中的aβ
1-42
水平为144.9
±
3.587pg/mg，在lps组中，该水平显著增加至356.5
±
6.030pg/mg。然而，对于bvpla2 1μg/ml处理组，bvpla2处理组显示浓度依赖性下降至273.7
±
23.33pg/mg。
[0339]
参考图16g，与对照组相比，lps组的β-分泌酶活性也显著增加，但发现通过bvpla2处理，该活性以浓度依赖性方式降低。
[0340]
通过蛋白质印迹分析，对app和bace1的表达水平进行测量。作为结果，如图16h所示，与对照组相比，app和bace1的表达在lps组中显著增加，而在bvpla2处理组中该表达被降低。
[0341]
4)测定蜂毒提取物对tg2576小鼠大脑神经炎症的影响
[0342]
ad的另一个标志是星形胶质细胞和小胶质细胞的激活(即，神经炎症)。进行免疫组织化学和蛋白质印迹，以研究小鼠大脑中与神经炎症相关的蛋白的表达水平。
[0343]
作为结果，如图17a和图17b所示，与对照组相比，给予bvpla2的小鼠中gfap和iba-1(分别是反应性星形胶质细胞和活化小胶质细胞的标志物)的数量减少，并且在bvpla2组中炎症蛋白inos和cox-2的数量也减少。
[0344]
此外，如图17c所示，给予bvpla2的tg2576小鼠的大脑中的inos和cox-2的表达水平降低，bvpla2给予组的大脑中的gfap和iba-1的表达水平也显著降低。
[0345]
促炎细胞因子的产生众所周知是炎症发展的标志，抗炎细胞因子的产生表明炎症减少。因此，进行qrt-pcr以确定促炎和抗炎细胞因子的产生水平。
[0346]
作为结果，如图17d所示，与对照组相比，bvpla2给予组的大脑中的促炎细胞因子(如tnf-α、il-1β和il-6)的mrna水平降低。另一方面，与对照组相比，bvpla2给予组的抗炎细胞因子(如il-4和tgf-β)的mrna水平显著增加。然而，bvpla2给予组小鼠的大脑中的抗炎细胞因子il-10的表达水平降低。
[0347]
5)测定蜂毒提取物对bv-2小胶质细胞中的神经炎症的影响
[0348]
通过一氧化氮浓度以及炎症相关的蛋白、促炎和抗炎细胞因子的表达水平，研究了bvpla2在小胶质细胞中的抗炎作用。
[0349]
一氧化氮(no)由活化的巨噬细胞分泌，进行一氧化氮分析，以确定由于bvpla2处理而在bv-2细胞中产生的神经炎症的缓解程度。作为结果，如图18b所示，与lps组相比，bvpla2处理组的一氧化氮浓度显著降低至14.92
±
2.154％。
[0350]
参考图18c，与lps组相比，bvpla2处理组中的inos、cox-2和iba-1的表达以浓度依赖性方式显著降低。参考图18d，促炎细胞因子(如tnf-α、il-1β和il-6)的表达水平在lps组中显著升高，在bvpla2处理组中以浓度依赖性方式降低；而抗炎细胞因子(如il-4和tgf-β)的表达水平在lps组中显著降低，但在bvpla2处理组中以浓度依赖性方式恢复。
[0351]
尽管未在图中示出，但进行了蛋白质印迹分析和qrt-pcr，以确定bvpla2是否对aβ诱导的神经炎症具有抑制作用。作为结果，与aβ处理组相比，bvpla2处理组中的inos、cox-2和p-stat3的表达水平以浓度依赖性方式显著降低。促炎细胞因子(tnf-α、il-1β和il-6)的水平通过aβ处理显著升高，在bvpla2处理组中以浓度依赖性方式降低。基于此，可以确定bvpla2对bv-2细胞中的lps或aβ诱导的炎症反应具有抑制作用。
[0352]
6)通过结合bvpla2和stat3测定蜂毒提取物对stat3激活的抑制作用
[0353]
为了研究bvpla2的抗神经炎症作用涉及哪些信号通路，在tg2576小鼠大脑中，使用蛋白质印迹测定了与stat3和丝裂原活化蛋白激酶(mapk)信号通路相关因子的水平，这些因子与炎症高度相关。
[0354]
作为结果，如图19a所示，bvpla2给予组的p-stat3水平显著降低，且只有mapk信号中的p-erk水平显著降低。
[0355]
由此可见，bvpla2与stat3信号通路密切相关。因此，通过用bvpla2(0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml)处理lps(1μg/ml)激活的bv-2细胞来评价p-stat3的水平。
[0356]
参考图19b，蛋白质印迹分析示出，与对照组相比，lps处理显著增加了p-stat3的水平，但bvpla2处理以浓度依赖性方式降低了p-stat3的水平。特别是，当使用1μg/ml bvpla2处理时，p-stat3水平降低至与对照组相似的水平。
[0357]
为了确定bvpla2对stat3启动子转录活性的影响，进行了荧光素酶活性分析。作为结果，如图19c所示，确定bvpla2在bv-2细胞中以浓度依赖性方式降低stat3荧光素酶活性。
[0358]
为了确定bvpla2的作用是否与stat3结合有关，在bvpla2和stat3之间进行了下拉分析和对接实验。将来自过表达stat3的bv-2细胞的全细胞裂解物与琼脂糖凝胶4b珠和bvpla2缀合的琼脂糖凝胶4b珠一起孵育，然后用抗stat3抗体通过免疫印迹法进行检测。
[0359]
作为结果，如图19d所示，bvpla2缀合琼脂糖凝胶4b珠中的stat3蛋白水平更高，表明bvpla2可直接结合stat3。
[0360]
7)蜂毒提取物直接与stat3的连接域(ld)结合
[0361]
为了识别bvpla2与stat3结合的结合位点，在bvpla2和stat3之间进行了计算分子对接建模。作为结果，如图20a所示，发现bvpla2直接结合stat3的几种氨基酸，特别是stat3的连接域(ld)(由thr500、asp502、gln503、glu506、ser509、trp510、ser513、lys517、arg518、leu520和lle522组成的结合口袋的内部)。
[0362]
为了确定stat3的哪个域与bvpla2相互作用，使用几种突变形式的stat3进行下拉分析、荧光素酶活性分析和qrt-pcr，如野生型、dna结合域(dbd)-null和ld-null(图20b)。
[0363]
为了确定bvpla2与stat3的ld之间的相互作用，使用bvpla2缀合的琼脂糖凝胶4b珠和经野生型(wt)-stat3、dbd-null stat3和ld-null stat3转染的细胞裂解物进行下拉分析。作为结果，如图20c所示，bvpla2缀合的琼脂糖凝胶4b珠下拉wt-stat3和dbd-null stat3，但未下拉ld-null stat3。
[0364]
参考图20d，在用wt-stat3、dbd-null stat3或ld-null stat3转染的所有bv-2细胞中，通过lps处理，stat3的荧光素酶活性显著增加，除了ld-null stat3载体外，bvpla2降低了wt-stat载体或dbd-null stat3载体的bv-2细胞中的stat3荧光素酶活性。
[0365]
为了确定bvpla2在经wt-stat3、dbd-null stat3或ld-null stat3转染的bv-2细胞中的抗炎作用是否不同，进行了qrt-pcr。作为结果，如图20e所示，在经wt-stat3或dbd-null stat3转染的bv-2细胞中，bvpla2降低了tnf-α、il-1β和il-6的水平。然而，在经ld-null stat3转染的bv-2细胞中，bvpla2处理几乎不影响细胞因子水平。基于此，确定bvpla2可通过与stat3的ld结合来抑制stat3的激活。
[0366]
8)测定蜂毒提取物和stat3抑制剂对淀粉样蛋白生成和神经炎症的协同作用
[0367]
在bv-2细胞中测试了stat3抑制剂(stattic)和蜂毒提取物对淀粉样蛋白生成和神经炎症的抑制作用。为了确定bvpla2和stattic在体外对淀粉样蛋白生成和神经炎症的协同作用，用lps(1μg/ml)、stattic(1μm)或bvpla2(1μg/ml)处理bv-2小胶质细胞24h。
[0368]
通过elisa测量bv-2细胞的aβ
1-42
水平。参考图21a，发现stattic处理组的aβ水平为264.2
±
4.384pg/mg，bvpla2处理组为273.7
±
23.33pg/mg。在stattic和bvpla2两者的联合处理组中，这些水平显著降低至199.4
±
20.39pg/mg蛋白。
[0369]
参考图21b，与对照组相比，直接作用于aβ生成的β-分泌酶活性通过lps处理得到显著增加，通过stattic或bvpla2处理得到降低，通过stattic和bvpla2联合处理得到显著降低。
[0370]
此外，如图21c所示，通过蛋白质印迹确定，bv-2细胞中通过lps处理而增加的aβ和bace1的表达水平通过bvpla2处理得到降低，但在进行联合处理时得到更显著的降低。
[0371]
为了研究stattic和bvpla2的组合对神经炎症的作用，评价了bv-2细胞中炎症蛋白和促炎细胞因子的水平。作为结果，如图21d所示，通过lps处理增加的炎症蛋白(如inos和cox-2)的细胞内水平通过bvpla2或stattic降低，并且当bvpla2或stattic一起使用时，它们得到进一步降低。
[0372]
此外，如图21e所示，通过lps处理而增加的tnf-α、il-1β和il-6的表达水平通过bvpla2或stattic处理得到降低，并且与stattic或bvpla2单独处理时相比，用二者同时处
理时，tnf-α、il-1β和il-6的水平得到更显著的降低。
[0373]
尽管本发明的实施方式和实施例已在上文中详细描述，但对于本领域的普通技术人员而言，显然这些具体描述仅为优选实施方式，本发明的范围不受其限制。换言之，本发明的实质性范围由所附权利要求及其等同物定义。