一种用于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药纳米材料技术领域，具体涉及一种用于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子及其制备方法和应用，所述介孔二氧化硅前药纳米粒子具有ph响应性，可以联合近红外染料分子实现光热治疗和阿霉素化疗作用。


背景技术：

2.在目前可用的各种癌症治疗方法中，传统的化学疗法是通过口服或静脉注射抗癌药物，经过血液循环系统到达肿瘤部位以杀死癌细胞。尽管化学疗法并不是最佳的治疗选择，但对于大多数患者仍然是最常见的选择。但是单纯的化学治疗在临床应用中有一定的局限性，比如抗癌药物往往都具有较强的细胞毒性并且缺乏对癌细胞的特异性识别能力，造成严重的毒副作用；癌细胞对药物的摄入效率低，需要重复给药，容易诱发机体的耐药性。因此，许多抗癌药物递送体系被研究开发，其中介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)具有比表面积和内孔容积大、孔径尺寸可调、结构高度有序、表面富含活性羟基基团易于修饰，以及具有良好的生物相容性、成本低廉等优点，特别适合用作药物递送材料。除了开发具有控制释放效果的纳米载体之外，将化学疗法与其他治疗方法联合应用，也是提高肿瘤治疗效果的有效途径之一。
3.近年来，光热治疗(ptt)是利用近红外光照射诱导局部组织加热到高热的状态(＞42℃)，从而导致肿瘤细胞死亡，ptt作为一种肿瘤辅助治疗手段越来越受到关注。光热治疗和化疗结合的多模式治疗一般是通过光热分子产生光热效应，当温度升高时化疗药物产生协同作用，从而有效杀死肿瘤细胞。相比于单一的化疗，多模式治疗具有更好的抗肿瘤活性。zhang等[acs biomater.sci.eng.4(2018)2424
–
2434]设计并制备了脂质体包覆的聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺
‑
丙烯酰胺)(p(nipam
‑
co
‑
aam))纳米凝胶，该凝胶可以有效地包封nir染料吲哚菁绿(icg)和阿霉素(dox)，在近红外光辐射下载药体系温度升高产生相变触发dox的释放，实现了光热
‑
化疗的协同作用。但是，这种方法dox的释放仅由nir辐射所带来的热效应触发，在温度升高不明显时，有可能导致载药颗粒不完全释放dox，从而减弱光热治疗和化疗的协同作用。
[0004]
专利申请cn106727274a公布了一种核壳结构的聚吡咯/介孔二氧化硅/石墨烯量子点纳米复合材料的制备方法，该复合材料具有优良的光热转换性能，在近红外光照射下将光转化成热，控制被封装的介孔二氧化硅孔道打开。但是该材料所产生的热量不足以获得可以造成细胞伤害的高温。专利cn109793710a公布了一种以plga纳米粒子为载体，在内部包裹化疗、光热及免疫治疗药物，表面连接靶向分子的多功能纳米粒子。但是，药物与材料之间非共价键结合，作用力较弱，容易发生药物突释的情况。


技术实现要素：

[0005]
为了克服上述现有技术中的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种一种用
于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子的制备方法。
[0006]
本发明另一目的在于提供上述方法制备得到的介孔二氧化硅前药纳米粒子。本发明纳米粒子在酸性环境中连接药物和载体颗粒的可逆共价键断裂，从而实现药物的控制释放；包载在介孔孔道中的小分子有机染料具有良好的光热转换性能，可以使局部温度升高，从而实现光热治疗和化疗的协同作用。
[0007]
本发明再一目的在于提供上述于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子在制备药物控制释放领域、光热/化疗协同作用材料领域中的应用。
[0008]
本发明的目的通过下述方案实现：
[0009]
一种用于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
(1)将有序介孔二氧化硅纳米粒子与硅烷偶联剂反应得到表面氨基化的介孔二氧化硅(msn
‑
nh2)；
[0011]
(2)将所得表面氨基化的介孔二氧化硅与酰溴混合进行酰化反应得到二氧化硅引发剂(msn
‑
br)；将其与含有羟基嵌段的聚合物混合，并进行表面聚合反应，得到修饰含羟基聚合物的介孔二氧化硅(msn
‑
polymer)；
[0012]
(3)通过顺式乌头酸酐和阿霉素(dox)进行缩合反应，得到小分子前药，命名为ca
‑
dox；再通过酯化反应将小分子前药锚定在修饰含羟基聚合物的介孔二氧化硅表面；产物命名为msn
‑
cis
‑
dox；
[0013]
(4)将所得msn
‑
cis
‑
dox与吲哚菁绿(icg)混合分散，得到用于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子(msn
‑
cis
‑
dox/icg)。
[0014]
优选的，所述一种用于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
(1)将有序介孔二氧化硅纳米粒子和硅烷偶联剂、有机溶剂混合，反应完成后，干燥得到msn
‑
nh2。
[0016]
(2)将步骤(1)得到的msn
‑
nh2分散于有机溶剂中，冰浴条件下加入缚酸剂和酰溴，并进行酰胺化反应，反应完成后过滤洗涤干燥之后得到msn
‑
br；
[0017]
(3)将步骤(2)得到的msn
‑
br和甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(pegma)、甲基丙烯酸
‑
羟基乙酯(hema)、六甲基三亚乙基四胺、溴化铜与溶剂混合，搅拌后加入抗坏血酸，反应完成后所得产物经过离心、洗涤和真空干燥，得到msn
‑
polymer；
[0018]
(4)将药物dox、顺式乌头酸酐(ca)、缚酸剂与有机溶剂混合，进行缩合反应，反应完成后所得产物洗涤并干燥，得到前药小分子(ca
‑
dox)；
[0019]
(5)将步骤(3)得到的msn
‑
polymer、步骤(4)得到的ca
‑
dox和催化体系分散在有机溶剂中，进行酯化反应，所得反应产物经洗涤、干燥，得到msn
‑
cis
‑
dox；
[0020]
(6)将步骤(5)得到的msn
‑
cis
‑
dox、icg分散于溶剂中，反应完成后干燥，得到msn
‑
cis
‑
dox/icg。
[0021]
步骤(1)所述有序介孔二氧化硅纳米粒子通过溶胶
‑
凝胶法制得，包括以下步骤：将模板剂、碱源和助剂溶解在水中，在70～80℃下搅拌0.5～1h后，加入硅源，反应0.5～4.0h，得到含有模板剂的介孔二氧化硅。
[0022]
优选的，所述模板剂、助剂、碱源与硅源的质量比为10～25：10～25：0.5～6：95～
96。所述的模板剂为十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、十六烷基三甲基对甲苯磺酸铵(ctat)和十六烷基三甲基氯化铵(ctac)中的至少一种，优选为ctab。所述的助剂为三氟乙酸钠。所述的硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯(teos)、正硅酸丙酯和硅酸钠中的至少一种，优选为正硅酸乙酯(teos)。所述的碱源可为氢氧化钠、三乙醇胺和氨水中的至少一种。所得介孔二氧化硅纳米粒子的粒径优选为50
‑
150nm，孔径优选为3～5nm。
[0023]
步骤(1)所述有序介孔二氧化硅纳米粒子与硅烷偶联剂的质量比为69～103：97～129。
[0024]
步骤(1)所述的硅烷偶联剂可为氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷中的至少一种。所述的有机溶剂为无水甲苯、无水乙醇中的至少一种。
[0025]
步骤(1)所述反应的温度为80～100，反应的时间为24～48h；
[0026]
步骤(1)反应完成后，还包括去除模板剂的步骤，去模板剂指将产物分散在nh4no3乙醇溶液或盐酸
‑
甲醇溶液中80～90℃回流24h，重复2次，优选为盐酸
‑
甲醇溶液。
[0027]
步骤(2)所述msn
‑
nh2、缚酸剂与酰溴的质量比为39～51：78～150：45～79。
[0028]
步骤(2)所述酰溴优选为2
‑
溴异丁酰溴(bibb)；所述的有机溶剂为无水四氢呋喃、无水二氯甲烷中的至少一种。
[0029]
步骤(2)所述酰胺化反应具体为冰浴下反应2～3h后在室温下反应24～48h。
[0030]
步骤(3)所述msn
‑
br、pegma、hema、六甲基三亚乙基四胺、溴化铜与抗坏血酸的质量比为10～30：10～30：10～30：1～15：1～5：10～46。
[0031]
步骤(3)所述的溶剂优选为甲醇和水的混合溶液；优选的，体积比为1/1。
[0032]
步骤(3)所述搅拌的时间为2～3h，加入抗坏血酸后所述的反应温度为40～80℃，反应时间为20～24h。
[0033]
步骤(4)所述药物dox、顺式乌头酸酐与缚酸剂的质量比为1～8：1～8：2～30。
[0034]
步骤(4)所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二氯甲烷、n,n
‑
二甲基吡啶、二甲基亚砜中的至少一种。
[0035]
步骤(4)所述缩合反应具体为在避光条件下搅拌反应12～24h。
[0036]
步骤(4)所述洗涤具体为将所得产物冰乙酸乙酯稀释后，用饱和氯化钠水溶液洗涤。
[0037]
步骤(5)中，所述msn
‑
polymer与ca
‑
dox的质量比为10～30：1～3；催化剂体系为催化量。
[0038]
步骤(5)中，所述的催化剂体系为n
‑3‑
(二甲氨基丙基)
‑
n
’‑
乙基碳二亚胺盐盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)，质量比约为4:3～2:1。
[0039]
步骤(5)所述的有机溶剂为二氯甲烷、n,n
‑
二甲基吡啶、二甲基亚砜中的至少一种。
[0040]
步骤(5)所述酯化反应为在室温下反应24～48h；
[0041]
步骤(6)所述msn
‑
cis
‑
dox、icg的质量比为10～30：1～3；
[0042]
步骤(6)所述溶剂优选为甲醇。
[0043]
步骤(6)所述反应具体为在室温下反应24～48h；
[0044]
步骤(3)和步骤(5)中，所述的缚酸剂相同或不同的分别为三乙胺和吡啶中的至少一种，优选为三乙胺。
[0045]
步骤(3)hema作为一种传统的生物基单体，水溶性好，含有羟基末端可以与顺式乌头酸酐键合，pegma作为广泛使用的亲水嵌段可以起到稳定纳米粒子的作用，修饰量为10～30wt％。
[0046]
步骤(4)通过ph敏感顺式乌头酸酐键接枝方法，将药物与hema末端羟基相连从而键合在介孔二氧化硅纳米粒子表面，不仅能够降低药物对于正常细胞的副作用，还能在细胞核内蓄积，从而提高抗肿瘤的效果。载药量为5～20wt％。
[0047]
步骤(6)所使用的icg是一种水溶性较好的三碳菁类近红外染料，经美国fda批准可临床使用。icg对800nm的近红外光有较强的吸收，可将大部分的光能转化为热能，是一种广泛使用的ptt试剂。该有机染料小分子具体装载在介孔二氧化硅纳米粒子孔道内部，负载量为8～13wt％。
[0048]
一种用于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子，通过上述方法制备得到。由包括介孔二氧化硅纳米粒子、装载在介孔二氧化硅纳米粒子内部的有机染料小分子、修饰在介孔二氧化硅纳米粒子表面的聚合物及键合在聚合物链上的药物构成。
[0049]
上述用于光热治疗联合化疗的介孔二氧化硅前药纳米粒子在制备药物控制释放领域、光热/化疗协同作用材料领域中的应用。制备得到的纳米颗粒在弱酸性ph微环境中可逆共价键断裂实现dox的释放。近红外激光照射实现光热转换，从而达到协同作用的目的。
[0050]
本发明中，先通过表面原子转移自由基聚合(atrp)得到含有功能基团羟基的介孔二氧化硅
‑
聚合物复合纳米颗粒；聚合物链通过ph敏感的顺式乌头酸酐键将dox修饰在介孔二氧化硅表面，然后将光热小分子载入介孔孔道之中，在弱酸性ph微环境中顺式乌头酸酐键断裂，药物从msn表现脱落药物的释放，可应用于药物控制释放领域中，在近红外激光辐射下，可以迅速提高局部的温度，实现光热治疗，并且温度的升高加速了药物分子的断裂，实现了化疗/光热治疗的协同作用。
[0051]
本发明纳米粒子材料生物相容性好，利用酸敏感的顺式乌头酸酐键实现药物的可控释放：药物在正常细胞周围几乎不释放，而在肿瘤细胞的微酸性环境下快速释放，实现对肿瘤的靶向治疗。近红外辐射不仅可以造成局部温度的提高，并且可以加速药物的释放，有助于药物迅速达到血药浓度，实现了光热/化疗的协同作用。
[0052]
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0053]
本发明以介孔二氧化硅纳米粒子作为药物载体，具有良好的药物包载能力与生物相容性；并且采用在ph环境中可断裂的顺式乌头酸酐键赋予了体系良好的ph响应释放性能，不仅可以改善药物的突释，还可以实现载药体系在特定ph范围内快速释放的要求；在介孔孔道中负载光热小分子，实现了协同治疗的效果，且对药物的释放有促进作用。
附图说明
[0054]
图1为实施例1中前药小分子(ca
‑
dox)的合成反应方程式。
[0055]
图2为实施例1中msn
‑
nh2纳米粒子的扫描电镜(sem)图。
[0056]
图3为实施例1中polymer@msn纳米粒子的透射电镜(tem)图。
[0057]
图4为实施例1中msn
‑
nh2纳米粒子的粒径分布图。
[0058]
图5为实施例1中msn@ctab、msn
‑
nh2、msn
‑
br和msn
‑
polymer的红外光谱对比图。
[0059]
图6为实施例1中msn
‑
nh2、msn
‑
polymer和msn
‑
cis
‑
dox/icg纳米粒子的n2吸附脱附
曲线对比图。
[0060]
图7为实施例1中msn
‑
nh2、msn
‑
polymer和msn
‑
cis
‑
dox/icg的孔径对比图。
[0061]
图8为实施例1中msn
‑
nh2、msn
‑
br和msn
‑
polymer和msn
‑
cis
‑
dox纳米粒子的tga对比图。
[0062]
图9为实施例1中dox、msn
‑
nh2、msn
‑
cis
‑
dox、icg和msn
‑
cis
‑
dox/icg的紫外
‑
可见光谱对比图。
[0063]
图10为实施例1中前药小分子ca
‑
doxft
‑
ir谱和1h nmr谱，溶剂为cdcl3。
[0064]
图11为实施例7中msn
‑
cis
‑
dox/icg纳米粒子体外药物释放曲线图。
[0065]
图12为实施例8中msn
‑
cis
‑
dox/icg纳米粒子纳米粒子的光热性能。
[0066]
图13为实施例9中msn
‑
cis
‑
dox/icg纳米粒子纳米粒子的体外细胞毒性。
具体实施方式
[0067]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明所使用的pegma优选数均分子量为mn＝500da。
[0068]
下列实施例中涉及的物料均可从商业渠道获得。各组分用量以质量体积份计，g/ml。在实施例中部分化学品使用的缩写对照如下：
[0069][0070][0071]
实施例1
[0072]
(1)含有表面活性剂的介孔二氧化硅的制备：取0.2质量份ctab、0.2质量份fc2、0.018质量份naoh和96体积份水机械搅拌0.5h后，快速加入1.0体积份正硅酸乙酯，升温到80℃，持续反应2h。反应完成后，自然冷却至室温，10000rpm离心分离，用水洗涤数次，30℃真空干燥24h，得白色粉末(msn@ctab)。
[0073]
所述步骤(1)中反应物的重量份数如下：0.20份ctab；0.2份fc2；0.018份氢氧化钠；0.96份teos；98.78份水。
[0074]
(2)表面氨基化介孔二氧化硅的制备：取0.5质量份msn@ctab分散在20体积份无水甲苯中，n2下80℃回流2h，用注射器将硅烷偶联剂0.75体积份aptes逐滴加入，n2下80℃回流24h。反应完成后，冷却至室温，离心(10000rpm，10min)分离，并用甲苯和乙醇分别洗涤两次。然后再用60体积份甲醇和3.8体积份浓hcl在70℃下搅拌24h除去模板剂ctab，离心并用甲醇洗涤三次，40℃、35mbar下真空干燥24h，得到的白色粉末即为氨基修饰的介孔二氧化硅(msn
‑
nh2)。
[0075]
所述步骤(2)中的反应物的重量份数如下：41.34份含模板剂的介孔二氧化硅；
58.66份aptes。
[0076]
(3)引发剂msn
‑
br的制备：取0.3质量份msn
‑
nh2份分散在20体积份无水四氢呋喃中，冰浴条件下加入1.4体积份三乙胺，并在缓慢搅拌的条件下将含有1.2体积份bibb的5体积份thf溶液逐滴滴入反应液，滴加完毕后继续搅拌反应2h，再撤除冰水浴，室温条件下继续反应48h。过滤得到固体用thf，乙醇和去离子水充分洗涤并在30℃下真空干燥得到引发剂msn
‑
br.
[0077]
所述步骤(3)中的反应物的重量份数如下：3份msn
‑
nh2；10.1份tea；6.2份bibb。
[0078]
(4)表面修饰聚合物的介孔二氧化硅纳米粒子(msn
‑
polymer)的制备：取0.2质量份msn
‑
br，0.02质量份cubr2混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，然后依次将0.12质量份pegma、0.15质量份hema、18体积份甲醇/水(1/1,v/v)和0.047质量份hmteta加入，搅拌10min使得催化剂配合物cu/hmteta形成。随后将0.15质量份抗坏血酸溶于2体积份甲醇/水中加入反应瓶中，搅拌10min后转入50℃油浴反应24h，冷却至室温，并将反应溶液暴露于空气中，加入50体积份thf，将粗产物超声分散在100体积份乙酰丙酮/乙醇(5/1,v/v)，室温下搅拌24h，离心并用大量水和乙醇洗涤沉淀，收集沉淀并真空干燥24h，得到白色产物msn
‑
polymer。
[0079]
所述步骤(4)中的反应物的重量份数如下：2份cubr2；12份pegma；15份hema；4.7份hmteta；15份抗坏血酸；20份msn
‑
br。
[0080]
(5)具有ph敏感性的前药小分子(ca
‑
dox)的制备(反应方程式如图1所示)：取0.08质量份dox
·
hcl和0.08质量份顺式乌头酸酐(ca)混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，加入10体积份的无水dmf和0.12质量份三乙胺(tea)，室温下避光反应24h，然后将混合物用冰乙酸乙酯稀释后，用饱和氯化钠水溶液洗涤并干燥，得到前药小分子(ca
‑
dox)。
[0081]
所述步骤(5)中的反应物的重量份数如下：8份dox
·
hcl；8份ca；12份tea。
[0082]
(6)制备前药纳米粒子：将10质量份msn
‑
polymer分散于20体积份无水二氯甲烷中，将2质量份的ca
‑
dox溶解于3体积份无水dcm中并加入反应体系，避光反应24h，离心并用大量水洗涤沉淀，除去未反应的ca
‑
dox，收集沉淀并冷冻干燥，即得msn
‑
cis
‑
dox。
[0083]
所述步骤(6)中的反应物的重量份数如下：10份msn
‑
polymer；2份ca
‑
dox。
[0084]
(7)制备光热/化疗协同作用纳米粒子：将3质量份msn
‑
cis
‑
dox分散在5体积份甲醇中，然后加入3质量份icg，在室温下搅拌24h，得到光热/协同作用纳米粒子(msn
‑
cis
‑
dox/icg)用水彻底洗涤并离心，25℃、35mbar下真空干燥24h。
[0085]
图2为实施例1中msn
‑
nh2纳米粒子的扫描电镜(sem)图。
[0086]
图3为实施例1中polymer@msn纳米粒子的透射电镜(tem)图。
[0087]
图4为实施例1中msn
‑
nh2纳米粒子的粒径分布图。
[0088]
图5为实施例1中msn@ctab、msn
‑
nh2、msn
‑
br和msn
‑
polymer的红外光谱对比图。
[0089]
图6为实施例1中msn
‑
nh2、msn
‑
polymer和msn
‑
cis
‑
dox/icg纳米粒子的n2吸附脱附曲线对比图。
[0090]
图7为实施例1中msn
‑
nh2、msn
‑
polymer和msn
‑
cis
‑
dox/icg的孔径对比图。
[0091]
图8为实施例1中msn
‑
nh2、msn
‑
br和msn
‑
polymer和msn
‑
cis
‑
dox纳米粒子的tga对比图。
[0092]
图9为实施例1中dox、msn
‑
nh2、msn
‑
cis
‑
dox、icg和msn
‑
cis
‑
dox/icg的紫外
‑
可见
光谱对比图。
[0093]
图10为实施例1中前药小分子ca
‑
doxft
‑
ir谱和1h nmr谱，溶剂为cdcl3。
[0094]
实施例2
[0095]
(1)含有表面活性剂的介孔二氧化硅的制备：取0.15质量份ctab、0.15质量份fc2、3.75体积份teoa溶液和96体积份水机械搅拌0.5h后，快速加入1.0体积份正硅酸乙酯，升温到80℃，持续反应2h。反应完成后，自然冷却至室温，10000rpm离心分离，用水洗涤数次，30℃真空干燥24h，得白色粉末(msn@ctab)。
[0096]
所述步骤(1)中反应物的重量份数如下：0.15份ctab；0.15份fc2；0.06份teoa；0.95份teos；98.78份水。
[0097]
(2)表面氨基化介孔二氧化硅的制备：取0.6质量份msn@ctab分散在20体积份无水甲苯中，n2下80℃回流2h，用注射器将硅烷偶联剂0.5体积份aps逐滴加入，n2下80℃回流24h。反应完成后，冷却至室温，离心(10000rpm，10min)分离，并用甲苯和乙醇分别洗涤两次。然后再用60体积份甲醇和3.8体积份浓hcl在70℃下搅拌24h除去模板剂ctab，离心并用甲醇洗涤三次，40℃、35mbar下真空干燥24h，得到的白色粉末即为氨基修饰的介孔二氧化硅(msn
‑
nh2)。
[0098]
所述步骤(2)中的反应物的重量份数如下：51.39份含模板剂的介孔二氧化硅；48.61份aps。
[0099]
(3)引发剂msn
‑
br的制备：取0.5质量份msn
‑
nh2份分散在20体积份无水四氢呋喃中，冰浴条件下加入1.5体积份三乙胺，并在缓慢搅拌的条件下将含有1.2体积份bibb的5体积份thf溶液逐滴滴入反应液，滴加完毕后继续搅拌反应2h，再撤除冰水浴，室温条件下继续反应48h。过滤得到固体用thf，乙醇和去离子水充分洗涤并在30℃下真空干燥得到引发剂msn
‑
br.
[0100]
所述步骤(3)中的反应物的重量份数如下：5份msn
‑
nh2；10.8份tea；6.2份bibb。
[0101]
(4)表面修饰聚合物的介孔二氧化硅纳米粒子(msn
‑
polymer)的制备：取0.2质量份msn
‑
br，0.01质量份cubr2混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，然后依次将0.15质量份pegma、0.2质量份hema、18体积份甲醇/水(1/1,v/v)和0.047质量份hmteta加入，搅拌10min使得催化剂配合物cu/hmteta形成。随后将0.15质量份抗坏血酸溶于2体积份甲醇/水中加入反应瓶中，搅拌10min后转入50℃油浴反应24h，冷却至室温，并将反应溶液暴露于空气中，加入50体积份thf，将粗产物超声分散在100体积份乙酰丙酮/乙醇(5/1,v/v)，室温下搅拌24h，离心并用大量水和乙醇洗涤沉淀，收集沉淀并真空干燥24h，得到白色产物msn
‑
polymer。
[0102]
所述步骤(4)中的反应物的重量份数如下：1份cubr2；15份pegma；20份hema；4.7份hmteta；15份抗坏血酸；20份msn
‑
br。
[0103]
(5)具有ph敏感性的前药小分子(ca
‑
dox)的制备(反应方程式如图1所示)：取0.05质量份dox
·
hcl和0.05质量份顺式乌头酸酐(ca)混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，加入10体积份的无水dmf和0.10质量份三乙胺(tea)，室温下避光反应24h，然后将混合物用冰乙酸乙酯稀释后，用饱和氯化钠水溶液洗涤并干燥，得到前药小分子(ca
‑
dox)。
[0104]
所述步骤(5)中的反应物的重量份数如下：5份dox
·
hcl；5份ca；10份tea。
[0105]
(6)制备前药纳米粒子：将10质量份msn
‑
polymer分散于20体积份无水二氯甲烷
中，将2质量份的ca
‑
dox溶解于3体积份无水dcm中并加入反应体系，避光反应24h，离心并用大量水洗涤沉淀，除去未反应的ca
‑
dox，收集沉淀并冷冻干燥，即得msn
‑
cis
‑
dox。
[0106]
所述步骤(6)中的反应物的重量份数如下：10份msn
‑
polymer；2份ca
‑
dox。
[0107]
(7)制备光热/化疗协同作用纳米粒子：将3质量份msn
‑
cis
‑
dox分散在5体积份甲醇中，然后加入3质量份icg，在室温下搅拌24h，得到光热/协同作用纳米粒子(msn
‑
cis
‑
dox/icg)用水彻底洗涤并离心，25℃、35mbar下真空干燥24h。
[0108]
实施例3
[0109]
(1)含有表面活性剂的介孔二氧化硅的制备：取0.25质量份ctab、0.25质量份fc2、2.5体积份氨水和96体积份水机械搅拌0.5h后，快速加入1.0体积份正硅酸乙酯，升温到80℃，持续反应2h。反应完成后，自然冷却至室温，10000rpm离心分离，用水洗涤数次，30℃真空干燥24h，得白色粉末(msn@ctab)。
[0110]
所述步骤(1)中反应物的重量份数如下：0.25份ctab；0.25份fc2；0.10份氨水；0.95份teos；98.78份水。
[0111]
(2)表面氨基化介孔二氧化硅的制备：取0.5质量份msn@ctab分散在20体积份无水甲苯中，n2下80℃回流2h，用注射器将硅烷偶联剂1.0体积份aptes逐滴加入，n2下80℃回流24h。反应完成后，冷却至室温，离心(10000rpm，10min)分离，并用甲苯和乙醇分别洗涤两次。然后再用60体积份甲醇和3.8体积份浓hcl在70℃下搅拌24h除去模板剂ctab，离心并用甲醇洗涤三次，40℃、35mbar下真空干燥24h，得到的白色粉末即为氨基修饰的介孔二氧化硅(msn
‑
nh2)。
[0112]
所述步骤(2)中的反应物的重量份数如下：34.58份含模板剂的介孔二氧化硅；65.42份aptes。
[0113]
(3)引发剂msn
‑
br的制备：取0.5质量份msn
‑
nh2份分散在20体积份无水四氢呋喃中，冰浴条件下加入1.5体积份三乙胺，并在缓慢搅拌的条件下将含有1.5体积份bibb的5体积份thf溶液逐滴滴入反应液，滴加完毕后继续搅拌反应2h，再撤除冰水浴，室温条件下继续反应48h。过滤得到固体用thf，乙醇和去离子水充分洗涤并在30℃下真空干燥得到引发剂msn
‑
br.
[0114]
所述步骤(3)中的反应物的重量份数如下：5份msn
‑
nh2；10.8份tea；7.75份bibb。
[0115]
(4)表面修饰聚合物的介孔二氧化硅纳米粒子(msn
‑
polymer)的制备：取0.5质量份msn
‑
br，0.01质量份cubr2混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，然后依次将0.15质量份pegma、0.2质量份hema、18体积份甲醇/水(1/1,v/v)和0.067质量份hmteta加入，搅拌10min使得催化剂配合物cu/hmteta形成。随后将0.15质量份抗坏血酸溶于2体积份甲醇/水中加入反应瓶中，搅拌10min后转入50℃油浴反应24h，冷却至室温，并将反应溶液暴露于空气中，加入50体积份thf，将粗产物超声分散在100体积份乙酰丙酮/乙醇(5/1,v/v)，室温下搅拌24h，离心并用大量水和乙醇洗涤沉淀，收集沉淀并真空干燥24h，得到白色产物msn
‑
polymer。
[0116]
所述步骤(4)中的反应物的重量份数如下：1份cubr2；15份pegma；20份hema；6.7份hmteta；15份抗坏血酸；50份msn
‑
br。
[0117]
(5)具有ph敏感性的前药小分子(ca
‑
dox)的制备(反应方程式如图1所示)：取0.08质量份dox
·
hcl和0.08质量份顺式乌头酸酐(ca)混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，加入10
体积份的无水dmf和0.12质量份三乙胺(tea)，室温下避光反应24h，然后将混合物用冰乙酸乙酯稀释后，用饱和氯化钠水溶液洗涤并干燥，得到前药小分子(ca
‑
dox)。
[0118]
所述步骤(5)中的反应物的重量份数如下：8份dox
·
hcl；8份ca；12份tea。
[0119]
(6)制备前药纳米粒子：将10质量份msn
‑
polymer分散于20体积份无水二氯甲烷中，将2质量份的ca
‑
dox溶解于3体积份无水dcm中并加入反应体系，避光反应24h，离心并用大量水洗涤沉淀，除去未反应的ca
‑
dox，收集沉淀并冷冻干燥，即得msn
‑
cis
‑
dox。
[0120]
所述步骤(6)中的反应物的重量份数如下：10份msn
‑
polymer；2份ca
‑
dox。
[0121]
(7)制备光热/化疗协同作用纳米粒子：将4.5质量份msn
‑
cis
‑
dox分散在5体积份甲醇中，然后加入4.5质量份icg，在室温下搅拌24h，得到光热/协同作用纳米粒子(msn
‑
cis
‑
dox/icg)用水彻底洗涤并离心，25℃、35mbar下真空干燥24h。
[0122]
实施例4
[0123]
(1)含有表面活性剂的介孔二氧化硅的制备：取0.2质量份ctab、0.25质量份fc2、0.7体积份naoh溶液(2m)和96体积份水机械搅拌0.5h后，快速加入1.0体积份正硅酸乙酯，升温到80℃，持续反应2h。反应完成后，自然冷却至室温，10000rpm离心分离，用水洗涤数次，30℃真空干燥24h，得白色粉末(msn@ctab)。
[0124]
所述步骤(1)中反应物的重量份数如下：0.2份ctab；0.25份fc2；0.06份naoh；0.96份teos；98.78份水。
[0125]
(2)表面氨基化介孔二氧化硅的制备：取0.5质量份msn@ctab分散在20体积份无水甲苯中，n2下80℃回流2h，用注射器将硅烷偶联剂0.75体积份aptes逐滴加入，n2下80℃回流24h。反应完成后，冷却至室温，离心(10000rpm，10min)分离，并用甲苯和乙醇分别洗涤两次。然后再用60体积份甲醇和3.8体积份浓hcl在70℃下搅拌24h除去模板剂ctab，离心并用甲醇洗涤三次，40℃、35mbar下真空干燥24h，得到的白色粉末即为氨基修饰的介孔二氧化硅(msn
‑
nh2)。
[0126]
所述步骤(2)中的反应物的重量份数如下：41.34份含模板剂的介孔二氧化硅；58.66份aptes。
[0127]
(3)引发剂msn
‑
br的制备：取0.5质量份msn
‑
nh2份分散在20体积份无水四氢呋喃中，冰浴条件下加入1.5体积份三乙胺，并在缓慢搅拌的条件下将含有1.5体积份bibb的5体积份thf溶液逐滴滴入反应液，滴加完毕后继续搅拌反应2h，再撤除冰水浴，室温条件下继续反应48h。过滤得到固体用thf，乙醇和去离子水充分洗涤并在30℃下真空干燥得到引发剂msn
‑
br.
[0128]
所述步骤(3)中的反应物的重量份数如下：5份msn
‑
nh2；10.8份tea；7.75份bibb。
[0129]
(4)表面修饰聚合物的介孔二氧化硅纳米粒子(msn
‑
polymer)的制备：取0.5质量份msn
‑
br，0.01质量份cubr2混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，然后依次将0.15质量份pegma、0.2质量份hema、18体积份甲醇/水(1/1,v/v)和0.067质量份hmteta加入，搅拌10min使得催化剂配合物cu/hmteta形成。随后将0.15质量份抗坏血酸溶于2体积份甲醇/水中加入反应瓶中，搅拌10min后转入50℃油浴反应24h，冷却至室温，并将反应溶液暴露于空气中，加入50体积份thf，将粗产物超声分散在100体积份乙酰丙酮/乙醇(5/1,v/v)，室温下搅拌24h，离心并用大量水和乙醇洗涤沉淀，收集沉淀并真空干燥24h，得到白色产物msn
‑
polymer。
[0130]
所述步骤(4)中的反应物的重量份数如下：1份cubr2；15份pegma；20份hema；6.7份hmteta；15份抗坏血酸；50份msn
‑
br。
[0131]
(5)具有ph敏感性的前药小分子(ca
‑
dox)的制备(反应方程式如图1所示)：取0.08质量份dox
·
hcl和0.08质量份顺式乌头酸酐(ca)混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，加入10体积份的无水dmf和0.12质量份三乙胺(tea)，室温下避光反应24h，然后将混合物用冰乙酸乙酯稀释后，用饱和氯化钠水溶液洗涤并干燥，得到前药小分子(ca
‑
dox)。
[0132]
所述步骤(5)中的反应物的重量份数如下：8份dox
·
hcl；8份ca；12份tea。
[0133]
(6)制备前药纳米粒子：将15质量份msn
‑
polymer分散于20体积份无水二氯甲烷中，将5质量份的ca
‑
dox溶解于3体积份无水dcm中并加入反应体系，避光反应24h，离心并用大量水洗涤沉淀，除去未反应的ca
‑
dox，收集沉淀并冷冻干燥，即得msn
‑
cis
‑
dox。
[0134]
所述步骤(6)中的反应物的重量份数如下：15份msn
‑
polymer；5份ca
‑
dox。
[0135]
(7)制备光热/化疗协同作用纳米粒子：将4.5质量份msn
‑
cis
‑
dox分散在5体积份甲醇中，然后加入4.5质量份icg，在室温下搅拌24h，得到光热/协同作用纳米粒子(msn
‑
cis
‑
dox/icg)用水彻底洗涤并离心，25℃、35mbar下真空干燥24h。
[0136]
实施例5
[0137]
(1)含有表面活性剂的介孔二氧化硅的制备：取0.2质量份ctab、0.7质量份fc2、0.7体积份naoh溶液(2m)和96体积份水机械搅拌0.5h后，快速加入1.0体积份正硅酸乙酯，升温到80℃，持续反应2h。反应完成后，自然冷却至室温，10000rpm离心分离，用水洗涤数次，30℃真空干燥24h，得白色粉末(msn@ctab)。
[0138]
所述步骤(1)中反应物的重量份数如下：0.20份ctab；0.7份fc2；氢氧化钠0.06份；0.96份teos；98.78份水。
[0139]
(2)表面氨基化介孔二氧化硅的制备：取0.5质量份msn@ctab分散在20体积份无水甲苯中，n2下80℃回流2h，用注射器将硅烷偶联剂0.75体积份aptes逐滴加入，n2下80℃回流24h。反应完成后，冷却至室温，离心(10000rpm，10min)分离，并用甲苯和乙醇分别洗涤两次。然后再用60体积份甲醇和3.8体积份浓hcl在70℃下搅拌24h除去模板剂ctab，离心并用甲醇洗涤三次，40℃、35mbar下真空干燥24h，得到的白色粉末即为氨基修饰的介孔二氧化硅(msn
‑
nh2)。
[0140]
所述步骤(2)中的反应物的重量份数如下：41.34份含模板剂的介孔二氧化硅；58.66份aptes。
[0141]
(3)引发剂msn
‑
br的制备：取0.5质量份msn
‑
nh2份分散在20体积份无水四氢呋喃中，冰浴条件下加入1.5体积份三乙胺，并在缓慢搅拌的条件下将含有1.5体积份bibb的5体积份thf溶液逐滴滴入反应液，滴加完毕后继续搅拌反应2h，再撤除冰水浴，室温条件下继续反应48h。过滤得到固体用thf，乙醇和去离子水充分洗涤并在30℃下真空干燥得到引发剂msn
‑
br.
[0142]
所述步骤(3)中的反应物的重量份数如下：5份msn
‑
nh2；10.8份tea；7.75份bibb。
[0143]
(4)表面修饰聚合物的介孔二氧化硅纳米粒子(msn
‑
polymer)的制备：取0.5质量份msn
‑
br，0.01质量份cubr2混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，然后依次将0.15质量份pegma、0.2质量份hema、18体积份甲醇/水(1/1,v/v)和0.067质量份hmteta加入，搅拌10min使得催化剂配合物cu/hmteta形成。随后将0.15质量份抗坏血酸溶于2体积份甲醇/水中加
入反应瓶中，搅拌10min后转入50℃油浴反应24h，冷却至室温，并将反应溶液暴露于空气中，加入50体积份thf，将粗产物超声分散在100体积份乙酰丙酮/乙醇(5/1,v/v)，室温下搅拌24h，离心并用大量水和乙醇洗涤沉淀，收集沉淀并真空干燥24h，得到白色产物msn
‑
polymer。
[0144]
所述步骤(4)中的反应物的重量份数如下：1份cubr2；15份pegma；20份hema；6.7份hmteta；15份抗坏血酸；50份msn
‑
br。
[0145]
(5)具有ph敏感性的前药小分子(ca
‑
dox)的制备(反应方程式如图1所示)：取0.08质量份dox
·
hcl和0.08质量份顺式乌头酸酐(ca)混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，加入10体积份的无水dmf和0.12质量份三乙胺(tea)，室温下避光反应24h，然后将混合物用冰乙酸乙酯稀释后，用饱和氯化钠水溶液洗涤并干燥，得到前药小分子(ca
‑
dox)。
[0146]
所述步骤(5)中的反应物的重量份数如下：8份dox
·
hcl；8份ca；12份tea。
[0147]
(6)制备前药纳米粒子：将15质量份msn
‑
polymer分散于20体积份无水二氯甲烷中，将5质量份的ca
‑
dox溶解于3体积份无水dcm中并加入反应体系，避光反应24h，离心并用大量水洗涤沉淀，除去未反应的ca
‑
dox，收集沉淀并冷冻干燥，即得msn
‑
cis
‑
dox。
[0148]
所述步骤(6)中的反应物的重量份数如下：15份msn
‑
polymer；5份ca
‑
dox。
[0149]
(7)制备光热/化疗协同作用纳米粒子：将4.5质量份msn
‑
cis
‑
dox分散在5体积份甲醇中，然后加入4.5质量份icg，在室温下搅拌24h，得到光热/协同作用纳米粒子(msn
‑
cis
‑
dox/icg)用水彻底洗涤并离心，25℃、35mbar下真空干燥24h。
[0150]
实施例6
[0151]
(1)含有表面活性剂的介孔二氧化硅的制备：取0.15质量份ctab、0.15质量份fc2、3.75体积份teoa溶液和96体积份水机械搅拌0.5h后，快速加入1.0体积份正硅酸乙酯，升温到70℃，持续反应1.5h。反应完成后，自然冷却至室温，10000rpm离心分离，用水洗涤数次，30℃真空干燥24h，得白色粉末(msn@ctab)。
[0152]
所述步骤(1)中反应物的重量份数如下：0.15份ctab；0.15份fc2；0.06份teoa；0.95份teos；98.78份水。
[0153]
(2)表面氨基化介孔二氧化硅的制备：取0.6质量份msn@ctab分散在20体积份无水甲苯中，n2下80℃回流2h，用注射器将硅烷偶联剂0.5体积份aps逐滴加入，n2下80℃回流24h。反应完成后，冷却至室温，离心(10000rpm，10min)分离，并用甲苯和乙醇分别洗涤两次。然后再用60体积份甲醇和3.8体积份浓hcl在60℃下搅拌24h除去模板剂ctab，离心并用甲醇洗涤三次，40℃、35mbar下真空干燥24h，得到的白色粉末即为氨基修饰的介孔二氧化硅(msn
‑
nh2)。
[0154]
所述步骤(2)中的反应物的重量份数如下：51.39份含模板剂的介孔二氧化硅；48.61份aps。
[0155]
(3)引发剂msn
‑
br的制备：取0.5质量份msn
‑
nh2份分散在20体积份无水四氢呋喃中，冰浴条件下加入1.5体积份三乙胺，并在缓慢搅拌的条件下将含有1.5体积份bibb的5体积份thf溶液逐滴滴入反应液，滴加完毕后继续搅拌反应2h，再撤除冰水浴，室温条件下继续反应48h。过滤得到固体用thf，乙醇和去离子水充分洗涤并在30℃下真空干燥得到引发剂msn
‑
br.
[0156]
所述步骤(3)中的反应物的重量份数如下：5份msn
‑
nh2；10.8份tea；7.75份bibb。
[0157]
(4)表面修饰聚合物的介孔二氧化硅纳米粒子(msn
‑
polymer)的制备：取0.5质量份msn
‑
br，0.06质量份cubr2混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，然后依次将0.15质量份pegma、0.2质量份hema、18体积份甲醇/水(1/1,v/v)和0.067质量份hmteta加入，搅拌10min使得催化剂配合物cu/hmteta形成。随后将0.15质量份抗坏血酸溶于2体积份甲醇/水中加入反应瓶中，搅拌10min后转入50℃油浴反应24h，冷却至室温，并将反应溶液暴露于空气中，加入50体积份thf，将粗产物超声分散在100体积份乙酰丙酮/乙醇(5/1,v/v)，室温下搅拌24h，离心并用大量水和乙醇洗涤沉淀，收集沉淀并真空干燥24h，得到白色产物msn
‑
polymer。
[0158]
所述步骤(4)中的反应物的重量份数如下：6份cubr2；15份pegma；20份hema；6.7份hmteta；15份抗坏血酸；50份msn
‑
br。
[0159]
(5)具有ph敏感性的前药小分子(ca
‑
dox)的制备(反应方程式如图1所示)：取0.08质量份dox
·
hcl和0.08质量份顺式乌头酸酐(ca)混合，密封后抽真空
‑
通氮气三次，加入10体积份的无水dmf和0.12质量份三乙胺(tea)，室温下避光反应24h，然后将混合物用冰乙酸乙酯稀释后，用饱和氯化钠水溶液洗涤并干燥，得到前药小分子(ca
‑
dox)。
[0160]
所述步骤(5)中的反应物的重量份数如下：8份dox
·
hcl；8份ca；12份tea。
[0161]
(6)制备前药纳米粒子：将15质量份msn
‑
polymer分散于20体积份无水二氯甲烷中，将5质量份的ca
‑
dox溶解于3体积份无水dcm中并加入反应体系，避光反应24h，离心并用大量水洗涤沉淀，除去未反应的ca
‑
dox，收集沉淀并冷冻干燥，即得msn
‑
cis
‑
dox。
[0162]
所述步骤(6)中的反应物的重量份数如下：15份msn
‑
polymer；5份ca
‑
dox。
[0163]
(7)制备光热/化疗协同作用纳米粒子：将4.5质量份msn
‑
cis
‑
dox分散在5体积份甲醇中，然后加入4.5质量份icg，在室温下搅拌24h，得到光热/协同作用纳米粒子(msn
‑
cis
‑
dox/icg)用水彻底洗涤并离心，25℃、35mbar下真空干燥24h。
[0164]
实施例7
[0165]
测定光热/化疗协同作用的复合纳米颗粒体外释放性能。
[0166]
取3mg实施例1制备的前药颗粒分散于3ml pbs(ph 7.4、6.5)或醋酸缓冲液(ph 5.0)后转入透析袋(mwco3000)中，将透析袋放入47ml pbs或醋酸缓冲液(v0＝50ml)中后置于药物溶出仪中，在37℃，100rpm转速下进行体外释放，定时取样4ml(v
e
＝4ml)测其480nm吸光度，并加入4ml新鲜缓冲液，计算不同时间释放液中阿霉素的浓度。每个ph值下平行进行3次，取平均值绘制释放曲线，见图11。
[0167]
由图11可知，在ph 7.4时，50h后仅有不到20％的dox从载体中释放出来，这是由于顺式屋头酸酐是对酸性环境敏感的动态化学键，因此在中性环境中相对更加稳定，不容易断裂从而减少了药物的突释。随着ph的降低，在相似的孵育条件下(约50h)，dox的释放分别为64.6％(ph 6.5)和84.3％(ph 5.0)远高于生理条件，表现出明显的ph响应性控制释放行为。
[0168]
实施例8
[0169]
测定光热/化疗协同作用的复合纳米颗粒的光热性能。
[0170]
为了研究光热加热效果，制备了一系列浓度(100、200和500ug/ml)的实施例1所得msn
‑
cis
‑
dox/icg纳米载体。将体积为100ul的溶液置于96孔板中，然后用nir激光(波长为980nm；功率为2w；激光光斑直径为3mm)照射。照射后立即用数字温度计监测溶液温度。在相
同条件下还测量了带有阴性样品(pbs溶液及msn
‑
cis
‑
dox)的对照实验，见图12。
[0171]
如图12所示，在nir激光(808nm，2w/cm2)连续照射6min后，pbs溶液及没有负载icg的体系温度变化均不明显，表示808nm的nir激光对正常组织无损伤；而msn
‑
cis
‑
dox/icg产生明显的温度升高。连续照射6min后，在0.2mg/ml及0.5mg/ml的浓度下，温度约升高了12.7℃和17.5℃，说明载药体系均具有较好的光热转换性能，可以达到产生高热杀死肿瘤细胞(温度高于42℃，肿瘤细胞将产生不可逆的损伤)和使酸敏感键加速断裂的目的。
[0172]
实施例9
[0173]
光热/化疗协同作用的复合纳米颗粒的细胞毒性测试。
[0174]
采用hepg2细胞进行细胞毒性实验。选用含10％热灭活胎牛血清(fbs)和1％双抗(100μl/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)的dmem培养基培养hepg2癌细胞，并将细胞接种于96孔板中(浓度为1
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104细胞/孔)，孔板置于37℃，饱和湿度，5％co2培养箱中培养24h。用含有不同浓度实施例1所得载药颗粒的新鲜培养基替换旧的培养基，培养48h，pbs洗涤，加入用dmem稀释的mtt培养4h。吸走未还原的mtt溶液，并用pbs洗涤之后加入dmso(200μl)溶解mtt结晶。将96孔板放置于37℃摇床中振荡10min，利用酶标仪测定570nm下每个孔的吸光度，进而计算细胞存活率结果如图13所示。
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从图13可以看出，msn
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cis
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dox/icg和游离dox均对hepg2细胞的生长和增值有显著的抑制作用。经过48h培养后，polymer@msn
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dox表现出明显的细胞毒性，而在近红外激光照射下，细胞存活率进一步下降。说明msn
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cis
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dox/icg能达到良好的光热/化疗协同作用。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。