一种用于体外细胞培养的纤维膜的制作方法

1.本发明涉及一种用于体外细胞培养的生物材料，具体而言，本发明涉及一种用于体外细胞培养的纳米纤维膜。


背景技术：

2.体外培养活细胞的物理环境影响了培养得到的细胞的增殖能力、代谢能力和分化能力等等。活细胞具有详细的表达谱系并表达不同的表现型和物理状态，其对培养基质具有非常灵敏的反应活性。生物工程师和生命科学家普遍认为，在很多情况下，二维平面结构的培养基质不适于细胞的生长，具体而言，在二维平面结构中进行细胞培养会使细胞逐渐丧失原有的性状；其不利于细胞间、细胞与细胞外基质间的交互作用；而且，在二维平面结构中，细胞在增殖至一定密度后会出现接触抑制，引起细胞的凋亡。
3.常用的细胞培养瓶、细胞培养皿、细胞培养板等其表面涂覆了聚苯乙烯或聚乙烯高分子材料，这样的细胞培养容器生物相容性较差，不利于细胞粘附。为了改善生物相容性，在传统的细胞培养瓶、细胞培养皿、细胞培养板等的表面上也采用胶原蛋白、聚赖氨酸等生物相容性好的材料进行涂覆，但是，这仍然仅提供了二维平面结构的培养基质，无法解决二维平面结构中进行细胞培养所存在的问题，即细胞增殖至一定密度后会出现接触抑制，导致细胞的凋亡。此外，简单的物理涂覆会造成涂覆不均匀的问题，而等离子喷涂技术或化学交联、接枝等表面改性方法的工艺较为复杂且成本非常高。
4.此外，现有技术中还采用细胞培养支架，其材料主要包括：天然细胞外基质支架(脱细胞基质)、天然材料支架、合成材料支架，脱细胞基质材料取材受限，且有免疫原的风险，合成材料(例如：pla)的生物活性相对较差，降解速度慢。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明一方面提供一种用于体外细胞培养的纤维膜，其为细胞的生长提供了有利于细胞攀附和便于细胞培养过程中营养物质的渗透和代谢产物的交换的三维结构。
6.本发明的用于体外细胞培养的纤维膜具有蛋白纳米纤维堆叠形成的疏松结构，其中，所述蛋白包括结构蛋白和/或其衍生物，所述疏松结构内部具有适于营养物质渗透和代谢产物交换的相互贯通的间隙。
7.在本发明的一些实施方式中，所述蛋白纳米纤维的直径在纤维膜中呈现连续变化趋势，沿纤维膜厚度方向呈梯度变化趋势，其中，所述蛋白纤维的直径梯度变化范围为100nm至1000nm。
8.在本发明的一些实施方式中，所述蛋白纤维堆叠形成的疏松结构中，蛋白纤维的取向是非定向的，各纤维的排布取向各异。
9.在本发明的一些实施方式中，所述蛋白纤维的直径沿着纤维膜的厚度方向呈现渐变趋势，即形成纤维直径梯度，例如呈逐渐增大趋势或逐渐减小趋势，其直径梯度变化范围
为400nm至800nm。
10.在本发明所述的纳米纤维膜中，纤维直径减小，则纤维堆叠形成的疏松结构中的间隙随之减小，将纤维膜表面的间隙控制在小于细胞直径，可阻止细胞长出纤维膜，同时又不影响营养物质的传递。
11.在本发明的一些实施方式中，所述蛋白为下列物质中的一种或多种：胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、明胶以及它们的衍生物。本发明选择结构蛋白及其衍生物作为纤维原料，可以提供细胞识别的rgd序列位点，与多种整合素特异性结合，有效促进细胞对纤维膜的粘附；同时，该结构蛋白及其衍生物的化学结构中还具有供交联剂反应的基团，便于纤维制备。
12.在本发明的一些实施方式中，所述纤维膜的厚度为0.1mm至0.4mm。
13.在本发明的一些实施方式中，所述蛋白纤维采用静电纺丝工艺制成。
14.另一方面，本发明提供一种制备用于体外细胞培养的纤维膜的方法，其包括如下步骤：
15.(1)提供蛋白溶液，所述蛋白包括结构蛋白和/或其衍生物；
16.(2)在步骤(1)提供的蛋白溶液中加入交联剂，静置预定时间后进行静电纺丝，纺丝形成纳米纤维膜，其包括堆叠形成的疏松结构，所述疏松结构内部具有适于营养物质渗透和代谢产物交换的、相互贯通的间隙。
17.在本发明的一些实施方式中，在进行步骤(2)的静电纺丝之前将加入了交联剂的蛋白溶液在0℃至50℃下静置0天至7天；优选在在20℃至30℃下静置0至36小时。
18.在本发明的一些实施方式中，在加入了交联剂的蛋白溶液中，所述交联剂的重量百分含量为0.1％至1％。本发明通过对交联程度的控制，可以控制所制备的纳米纤维膜的降解速度，使其与待培养的目标细胞的生长、分化需求相匹配。
19.在本发明的一些实施方式中，所述交联剂选自：戊二醛、乙二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺。
20.在本发明的一些实施方式中，所述蛋白溶液通过将下列物质中的一种或多种以质量比为1:3至1:12溶解于溶剂中配制得到，所述物质为：胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、明胶以及它们的衍生物，所述溶剂是水、乙酸、乙酸乙酯、pbs缓冲液、乙醇中的一种或为包含选自水、乙酸、乙酸乙酯、pbs缓冲液、乙醇中的多于一种的混合液。
21.在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)之后还包括高温定型步骤：在温度为50℃至160℃下放置2小时至10小时对纤维膜进行高温定型处理。高温处理步骤可进一步提高交联度，并去除残留溶剂。
22.本发明用于体外细胞培养的纳米纤维膜不同于传统的二维平面细胞培养基质，其中，蛋白纤维堆叠形成的疏松结构为细胞生长提供了三维结构，这种结构有利于细胞在该纤维膜中的攀附生长，为细胞生长提供良好的贴附性，细胞在培养过程中不易发生贴壁困难或脱落等情况；纤维膜中纳米纤维的疏松堆叠结构允许细胞多层生长，可以在培养过程中得到更高的细胞密度，避免在传统二维平面结构中细胞增殖至一定密度后会出现接触抑制产生细胞凋亡，并且，纤维堆叠形成的疏松结构本身在纤维膜内部产生的多孔隙结构便于细胞培养过程中营养物质的渗透和代谢产物的交换，进一步促进细胞的生长。此外，本发明的纤维膜由选自胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、明胶以及它们的衍生物制成，具有良好
的生物相容性。
附图说明
23.图1a和图1b是根据本发明的纤维膜样品1的底面和顶面的扫描电镜sem照片。
24.图2a和图2b是根据本发明的纤维膜样品2的底面和顶面的扫描电镜sem照片。
25.图3a和图3b是根据本发明的纤维膜样品3的底面和顶面的扫描电镜sem照片。
26.图4是根据本发明的纤维膜样品4的扫描电镜sem照片。
27.图5显示了将牙龈成纤维细胞分别接种于本发明的纤维膜样品3(bhm)、胶原蛋白基质(mcm)和涂覆了聚苯乙烯的培养皿(ctrl)之后所测试的细胞增殖情况。
28.图6是根据本发明的纤维膜样品3用于培养脐静脉内皮细胞株的细胞生长显微图像。
具体实施方式
29.以下将结合附图和具体实施例对本发明涉及的各个方面进行详细说明，这些具体实施例仅用于举例说明本发明，并不对本发明的保护范围和实质内容构成限定。
30.实施例1：用于体外细胞培养的纤维膜的制备
31.本实施例举例说明本发明的用于体外细胞培养的纤维膜及其制备方法。尽管本实施例中采用静电纺丝工艺制备本发明的纤维膜，可以理解，本发明的纤维膜还可以采用本领域已知的其它工艺进行制备。
32.纤维膜样品1的制备：
33.将5g明胶加入35g冰醋酸/纯化水混合溶剂中，其中冰醋酸与纯化水的质量比为1:1，搅拌12h混合溶解均匀。然后在该溶液中加入0.2g 40％wt乙二醛水溶液，混合均匀后在25℃温度下静置2h。然后将溶液注入静电纺丝设备中，使用单组6针头进行纺丝，纺丝喷头距离旋转接收轴装置150mm。随后启动静电纺丝过程，初始正电压为15kv，负电压为0.1kv，每纺丝30min正电压提升1kv，初始流速为2.5ml/h，每纺丝30min流速提升0.2ml/h，总纺丝时间为4h，随后纺丝结束，得到纤维膜。将纤维膜放入烘箱中，在100℃下处理6h，得到处理完成的纤维膜样品1。
34.纤维膜样品1具有采用静电纺丝制成的明胶纤维堆叠形成的疏松结构，该纤维膜的底面和顶面的扫描电镜sem照片如图1a和图1b所示，如图所示，蛋白纤维的取向是非定向的，各纤维排布取向各异，该纤维膜的厚度为0.2mm至0.3mm，纤维的直径沿着纤维膜的厚度方向呈梯度变化趋势，直径梯度变化范围为200nm至700nm，图1a显示在纤维膜的底面纤维直径分布为200至400nm，图1b显示在纤维膜的顶面纤维直径分布为300-700nm。纤维堆叠形成的疏松结构有利于细胞的粘附和攀附生长，纤维膜样品1的疏松结构内部的间隙互相贯通，适于细胞培养所需的营养物质的渗透和代谢产物的交换，但可避免细胞向纤维膜之外生长。
35.纤维膜样品2的制备：
36.将5g胶原蛋白加入35g冰醋酸/乙醇/乙酸乙酯/纯化水混合溶剂中，其中冰醋酸:乙醇:乙酸乙酯:纯化水的质量比为4:1:2:1，搅拌12h混合溶解均匀形成胶原蛋白溶液。然后在该溶液中加入0.1g 5％戊二醛水溶液，混合均匀后在25℃温度下静置2h。然后将溶液
注入静电纺丝设备中，使用单组6针头进行纺丝。纺丝喷头距离旋转接收轴装置150mm。随后启动静电纺丝过程，初始正电压为18kv，负电压为0.1kv，每纺丝30min正电压提升1kv，初始流速为3ml/h，每纺丝30min流速提升0.2ml/h，总纺丝时间为3.5h，随后纺丝结束，得到纤维膜。将纤维膜放入烘箱中，在120℃下处理4h，得到处理完成的纤维膜样品2。
37.纤维膜样品2具有采用静电纺丝制成的胶原蛋白纤维堆叠形成的疏松结构，该纤维膜的底面和顶面的扫描电镜sem照片如图2a和图2b所示，如图所示，蛋白纤维的取向是非定向的，各纤维排布取向各异，该纤维膜的厚度为0.2mm至0.3mm，纤维的直径沿着纤维膜的厚度方向呈梯度变化趋势，直径梯度变化范围为200nm至400nm，图2a显示在纤维膜的底面纤维直径分布为200至350nm，图2b显示在纤维膜的顶面纤维直径分布为300-400nm。纤维堆叠形成的疏松结构有利于细胞的粘附和攀附生长，疏松结构内部的间隙互相贯通，适于细胞培养所需的营养物质的渗透和代谢产物的交换，但可避免细胞向纤维膜之外生长。
38.纤维膜样品3的制备：
39.将5g明胶加入35g冰醋酸/纯化水混合溶剂中，其中冰醋酸与纯化水的质量比为1:1，搅拌12h混合溶解均匀。然后在该溶液中加入0.2g 40％乙二醛水溶液，混合均匀后在25℃温度下静置4h。然后将溶液注入静电纺丝设备中，使用单组6针头进行纺丝。纺丝喷头距离旋转接收轴装置150mm。随后启动静电纺丝过程，初始正电压为20kv，负电压为0.1kv，每纺丝30min正电压提升1kv，初始流速为3ml/h，每纺丝30min流速提升0.5ml/h，总纺丝时间为1.8h，随后纺丝结束，得到纤维膜。将纤维膜放入烘箱中，在100℃下处理6h，得到处理完成的纤维膜样品3。
40.纤维膜样品3具有采用静电纺丝制成的明胶纤维堆叠形成的疏松结构，该纤维膜的底面和顶面的扫描电镜sem照片如图3a和图3b所示，如图所示，蛋白纤维的取向是非定向的，各纤维排布取向各异，该纤维膜的厚度为0.3mm至0.4mm，纤维的直径沿着纤维膜的厚度方向呈梯度变化趋势，直径梯度变化范围为400nm至1000nm，图3a显示在纤维膜的底面纤维直径分布为400至800nm，图3b显示在纤维膜的顶面纤维直径分布为700-1000nm。纤维堆叠形成的疏松结构有利于细胞的粘附和攀附生长，纤维膜样品3中的疏松结构内部的间隙相互贯通，适于细胞培养所需的营养物质的渗透和代谢产物的交换，但可避免细胞向纤维膜之外生长。
41.纤维膜样品4的制备：
42.将5g明胶加入35g冰醋酸/纯化水混合溶剂中，其中冰醋酸与纯化水的质量比为1:1，搅拌12h混合溶解均匀。随后不加交联剂，直接将溶液注入静电纺丝设备中，使用单组6针头进行纺丝。纺丝喷头距离旋转接收轴装置150mm。随后启动静电纺丝过程，正电压为18kv，负电压为0.1kv，流速为3ml/h，总纺丝时间为4.4h，随后纺丝结束，得到纤维膜。将纤维膜放入烘箱中，在160℃下处理12h，得到处理完成的纤维膜样品4。其中热处理步骤使样品发生酰胺化脱水反应(热交联)，增强样品结构的稳定性。
43.纤维膜样品4具有采用静电纺丝制成的明胶纤维堆叠形成的疏松结构，该纤维膜的扫描电镜sem照片如图4所示，如图所示，蛋白纤维的取向是非定向的，各纤维排布取向各异，该纤维膜的厚度为0.2mm至0.3mm，纤维的直径为100nm至300nm，纤维堆叠形成的疏松结构有利于细胞的粘附和攀附，纤维膜样品4的疏松结构的内部间隙相互贯通，适于细胞培养所需的营养物质的渗透和代谢产物的交换，但可避免细胞向纤维膜之外生长。
44.实施例2：用于牙龈成纤维细胞的培养
45.以上述实施例1中制备的纤维膜样品3(bhm)为例，测试该纤维膜用于牙龈成纤维细胞的培养效果，本实施例采用细胞计数检测试剂盒cck-8进行检测。同时，在本实施例中使用胶原蛋白基质(mcm)和涂覆了聚苯乙烯的培养皿(ctrl)作为对照。将牙龈成纤维细胞分别接种于纤维膜样品3、胶原蛋白基质和涂覆了聚苯乙烯的培养皿上，并在接种后定期观察细胞的增殖情况，采用cck-8检测试剂盒检测本发明样品3(bhm)、胶原蛋白基质(mcm)和聚苯乙烯基质(ctrl)的细胞增殖，下表1列出了接种后3天、7天和14天的细胞培养液的od450值，相应的柱形图如图5所示。
46.表2接种3天、7天、14天细胞的增殖
[0047][0048]
其中，p《0.05
[0049]
对比表2和图5所示的牙龈成纤维细胞在bhm、mcm和ctrl上的细胞增殖情况，从3天、7天、10天的od450值可知：1)牙龈成纤维细胞在胶原蛋白mcm上的增殖明显低于在本发明的纤维膜bhm和聚苯乙烯ctrl；2)随着时间的延长，在本发明的纤维膜bhm和聚苯乙烯ctrl上的细胞的增殖明显增大，而在胶原蛋白mcm上培养的细胞并未表现出随时间延长不断增殖。由此可见，使用本发明的纤维膜培养细胞相比于使用胶原蛋白可显著促进细胞增殖，并且，采用本发明的纤维膜培养的细胞的增殖情况与在聚苯乙烯上培养的细胞的增殖情况类似，但是，本发明的纤维膜由结构蛋白及其衍生物制成，其相对于聚苯乙烯培养基质具有更好的生物相容性。
[0050]
实施例3：用于上皮细胞的培养
[0051]
纤维膜样品3用于脐静脉内皮细胞株与膜共培养(1x106cell/ml的量滴加在膜上)，在37℃，5％co2培养箱中培养2h，转移至新培养皿中，加入培养液1ml，放入培养箱中培养。
[0052]
培养条件：37℃，5％co2[0053]
培养基：内皮细胞培养基ecm(sciencell)
[0054]
培养7天，可以观察到2～3层的内皮细胞，细胞间紧密排列，其显微图像如图6所示。
[0055]
以上结合具体实施例对本发明进行了具体说明，这些具体实施例仅仅是示例性的，不能以此限定本发明的保护范围，本领域技术人员在不背离本发明的实质和范围的前提下可对本发明进行各种修改、变化或替换。因此，依照本发明所作的各种等同变化仍属于本发明所涵盖的范围。