蛋白质样品中絮凝剂的基于HPLC的检测的制作方法

蛋白质样品中絮凝剂的基于hplc的检测
发明领域
1.本发明涉及制造重组蛋白及其从宿主细胞上清液中回收和纯化的领域。本发明利用一种测量样品中聚(二烯丙基二甲基氯化铵)pdadmac的水平并确保在蛋白质纯化过程中将其去除的方法。
2.发明背景
3.在治疗领域，生物实体例如蛋白质和抗体、尤其是抗体衍生分子的应用始终在不断增加和具有重要性，因此，对受控制造过程的需求也同时随之发展。治疗性蛋白质的商业化需要大量生产它们，并且大量努力致力于改进表达所需的蛋白质的宿主细胞及其加工过程，从而提高产品滴度。因此，在细胞培养水平上也观察到了更多的生物质和碎片。作为蛋白质纯化过程的组成部分，必须去除生物质和碎片。
4.有助于去除生物质以得到澄清的细胞培养液以从中纯化关注的蛋白质的一种方法包括使用絮凝剂，例如用于包封哺乳动物细胞和酶以及絮凝微生物细胞培养物的阳离子聚合物。典型地，允许絮凝剂沉降，然后从细胞培养液中去除，然后通过离心和/或通过深度过滤器进一步处理，以得到所谓的澄清细胞培养物，从其中可以纯化关注的蛋白质。
5.絮凝剂可以是阴离子的、阳离子的或“多模式的”。当溶液的ph值小于特定蛋白质的pi时，该蛋白质带有净正电荷。在这些条件下，阳离子聚电解质可以沉淀杂质并将关注的蛋白质保留在溶液中。相反，阴离子聚电解质可以沉淀关注的蛋白质，形成蛋白质-聚电解质沉淀物，在溶液中留下杂质。
6.考虑到细胞和细胞碎片典型地带有整体负电荷，阳离子聚合物特别适合这种用途。这导致通过离子相互作用形成的中和粒子形成，其从溶液中脱落。用于絮凝来自重组蛋白产生细胞的澄清细胞培养液的阳离子聚合物的实例包括聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)、聚胺、聚氨基酸、聚丙烯酰胺和脱乙酰壳多糖。
7.另一方面，阴离子絮凝剂也已在此上下文中使用，特别是阴离子聚电解质、聚乙烯基磺酸、聚丙烯酸和硫酸羧甲基葡聚糖已被评估用于从cho细胞收获物中富集和选择性沉淀单克隆抗体，在上清液中留下杂质。
8.最近的方法已经尝试使用具有多模式功能的絮凝剂，这些絮凝剂不需要定制并且可以与广泛的抗体一起使用。
9.有关絮凝剂在净化细胞培养物上清液中的用途的另外的信息可以在singh等人2016 clarification technologies for monoclonal antibody manufacturing processes：current state and future perspectives biotechnol bioeng 113:698中找到。
10.从治疗剂的大规模商业生产的角度来看，在将蛋白质制备成可施用形式之前，确保在随后的纯化过程中将此类絮凝剂去除至对人体施用是安全的水平是必不可少的。
11.称作用于细胞培养物的絮凝剂的阳离子聚合物的实例为聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)(参见，例如peck等人2015 dosing considerations and impacts on the clarification of mammalian cell culture feed streams using poly—
diallyldimethylammonium chloride flocculant in conjunction withdepth filters)。迄今为止，测量预处理细胞培养进料流中残留pdadmac的方法是基于使用表面等离子共振(参见，例如detection of residual pdadmac using surface plasmon resonance spectroscopy,merck kgaa)。另一种近期的方法基于使用蒸发光散射检测(elsd)(khodadadian等人，2019，determination of residual poly diallyldimethylammonium chloride(pdadmac)in monoclonal antibody formulations by size exclusion chromatography and evaporative light scattering detector)biologicals 57:21。然而，现存的方法在精密度、灵敏度、动态范围和校准曲线性质方面存在局限性。
12.因此，持续需要提供用于检测适用于包含复杂蛋白质混合物的样品的残留絮凝剂水平的快速且稳定的方法，所述方法将允许在制造过程中评估该絮凝剂的清除率。
13.发明概述
14.本发明提供了用于测量含有关注的重组蛋白的样品中的pdadmac的快速而简便的方法，其包括使用反相疏水相互作用hplc和带电荷气溶胶检测(charged aerosol detection)。
15.在第一个方面，本发明涉及测量含有关注的重组蛋白的样品中的pdadmac的方法，所述方法包括下列步骤：
16.a)将样品施加于反相疏水相互作用hplc，
17.b)使用疏水梯度洗脱从柱上洗脱结合的pdadmac，
18.c)使用带电荷气溶胶检测器测量步骤b)中回收的pdadmac，
19.其中a)中施加的样品包含0.2-3％(v/v)的cad-相容性酸。
20.在另一个方面，本发明涉及制造关注的蛋白质的方法，其包括在蛋白质纯化过程中加入pdadmac，其中根据用于测量pdadmac的本发明的方法测量所述pdadmac的后续去除。
21.附图简述
22.图1：根据本发明的方法测量从6种浓度的pdadmac得到的校准曲线。
23.图2：根据单个测量浓度对药物物质样品中加标的pdadmac的理论水平(1.0-10.0μg pdadmac/ml评估的5种水平)的关系绘图得到的结果的线性。
24.图3：“按原样”(未加标)分析和用1.0μg pdadmac/ml加标的药物物质的色谱图叠加。
25.图4：两种不同药物物质样品中在1.0μg/ml加标水平下pdadmac回收的验证。
26.图5：在三个浓度水平(1.0-2.0和5.0μg pdadmac/ml)加标的两个药物物质样品中得到的真实度和精密度结果的总结。
27.图6：在另外修饰的抗体形式fab-scfv(称为双特异性的)和fab-2x dsscfv(称作三价的)中的真实度和精密度的总结。
28.图7：“按原样”(未加标)分析和用1.0μg pdadmac/ml加标的药物物质的色谱图叠加。
29.发明详述
30.本发明通过提供一种用于检测复杂蛋白质混合物中的pdadmac的新方法来解决上述需求，所述方法快速而简便，并允许在蛋白质制造过程中评估该絮凝剂的清除率。特别
2％的cad-相容性酸或0.1％-1.5％的cad-相容性酸或0.5％-1.5％的cad-相容性酸。在本发明的另一个实施方案中，样品包含1％的cad-相容性酸。
44.在一个实施方案中，步骤a)中施加的样品具有2至4的ph。
45.本发明上下文中可能的cad-相容性酸包括但不限于三氟乙酸(tfa)、七氟丁酸、乙酸或甲酸。在本发明方法的一个具体实施方案中，所述cad-相容性酸为三氟乙酸。
46.cad-相容性酸的确切比例性质由本领域技术人员根据样品的具体性质，且特别是作为纯化对象的关注的重组蛋白的性质来选择。
47.在本发明的一个具体的实施方案中，所述cad-相容性酸将在上述方法的步骤a)之前添加到样品中，例如，通过从储备溶液中添加15％(vol/vol)的cad-相容性酸。
48.向样品中加入酸会对同样包含在样品中的重组蛋白的溶解度产生影响，并且在某些情况下可能导致其沉淀。这种沉淀也可能包含一些残留的pdadmac，因此会低估样品中存在的pdadmac的量。为了避免这种现象，本领域技术人员会意识到稀释样品以降低重组蛋白浓度的有益作用。
49.类似地，如果期望调整蛋白质浓度，则可以使用适当的缓冲液稀释样品，例如，通过在样品中加入另外的缓冲液。
50.在本发明方法的一个实施方案中，步骤a)中施加的样品包含小于200mg/ml的重组蛋白浓度，例如小于100mg/ml，例如小于60mg/ml。在另一个具体的实施方案中，样品包含20至60mg/ml的重组蛋白浓度。
51.类似地，可以期望其他样品制备技术，例如过滤步骤，以去除较小分子量的分子。
52.在本发明方法的一个实施方案中，用具有80kda或更小、60kda或更小、50kda或更小的孔径的滤膜过滤步骤a)中施加的样品。在另一个具体的实施方案中，用具有30kda孔径的滤膜过滤样品。
53.类似地，可能期望对样品进行酸性处理，使得样品中存在的一些或全部蛋白质被消化。在另一个实施方案中，所述方法包括在将样品应用于步骤a)之前对样品进行酸处理。在所述方法的另一个实施方案中，样品在其应用于步骤a)之前经历酸处理步骤和过滤步骤。
54.在一个具体的实施方案中，本发明的方法还包括通过参比对照物来确定样品中存在的pdadmac浓度的步骤。
55.典型地，使用添加到制剂缓冲液中并根据本发明的方法处理的已知浓度的pdadmac来制备校准曲线。
56.当本发明的方法用于定量测定时，在具有未知量聚合物的样品中测量的pdadmac电荷被内插入校准曲线中以得到样品的pdadmac浓度。然而，本发明的方法也可用于“极限测试”测定，即目标是确定pdadmac的存在低于关注的特定极限的测试。在这些“极限测试”中，每个样品都按“原样”进行分析，并用与关注的极限相当的pdadmac量加标。例如，如果关注的极限为1μg/ml pdadmac，则取样并分成2个等分部分，在所得的一个等分部分用1μg/ml pdadmac加标并通过在校准曲线中插入来测量pdadmac的浓度，然后通过本发明的方法直接测量剩余的等分部分，并且通过对校准曲线的内插来验证不存在pdadmac。
57.含有关注的重组蛋白的样品可以直接从纯化过程中的步骤中得到，或者可以在所述过程结束时或从允许分析pdadmac逐渐清除的纯化过程中的步骤中得到。
58.在一个实施方案中，步骤a)中施加的样品为直接从其中已经添加了cad-相容性酸的所述重组蛋白的纯化中的步骤中得到的样品。
59.在治疗学领域，关注的蛋白质可以例如选自抗体、细胞因子、生长因子、激素和其他调节肽和蛋白质。此类蛋白质可从组织和分泌物中提取，但随着生物技术的发展以及对这些分子的更高数量和它们制备中更高标准化的增加的需求，它们更频繁地作为重组蛋白生产。
60.在本发明的一个具体的实施方案中，关注的重组蛋白为抗体、抗体片段或其衍生物。
61.可以通过培养用一种或多种编码重组抗体的表达载体转染的真核宿主细胞来生产关注的重组蛋白，例如用于大规模商业目的制造的抗体。真核宿主细胞优选哺乳动物细胞，更优选中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
62.哺乳动物细胞可以在支持它们生长和抗体表达的任何培养基中培养，优选培养基是化学成分确定的培养基，其不含动物来源的产物，例如动物血清和蛋白胨。本领域技术人员可以使用不同的细胞培养基，其中包含维生素、氨基酸、激素、生长因子、离子、缓冲液、核苷、葡萄糖或等效能源的不同组合，它们以适当的浓度存在以促进细胞生长和蛋白质生产。在本领域技术人员已知的细胞培养周期期间的不同时间，额外的细胞培养基成分可以以适合的浓度包括在细胞培养基中。
63.哺乳动物细胞培养可以在任何适合的容器中进行，例如摇瓶或生物反应器，其可以以补料分批模式操作，也可以不以补料分批模式操作，这取决于例如所需的生产规模。这些生物反应器可以是搅拌罐或空气升液反应器。各种大型生物反应器的容量超过1,000l至50,000l，优选5,000l至20,000l或至10,000l之间。或者，也可使用较小规模的生物反应器，例如2l至100l，以便根据本发明的方法制造抗体。
64.可以根据本发明的方法制造的抗体或其抗原结合片段典型地存在于哺乳动物宿主细胞培养物、典型地为cho细胞培养物的上清液中。对于其中关注的蛋白质(例如抗体或其抗原结合片段)分泌在上清液中的cho培养过程，通过本领域已知的方法，典型地通过离心收集所述上清液。为免生疑问，上清液表示位于细胞培养物离心产生的沉淀细胞上方的液体。
65.絮凝是悬浮液中的颗粒形成较大尺寸的聚集物或簇的过程。在此过程中，通过添加絮凝剂，颗粒以絮凝物的形式从悬浮液中脱离出来。絮凝剂可以是阳离子聚合物的阴离子型。存在天然絮凝剂以及可制造成具有特定分子量和分布的合成絮凝剂。
66.阳离子聚合物与带负电荷的颗粒(例如有机物质)相互作用。在细胞培养上清液中，阳离子聚合物与带负电荷的颗粒相互作用，例如活细胞和非活细胞、细胞代谢物和细胞碎片，包括核酸、蛋白质和脂质体。细胞培养上清液中发现的带负电荷的化合物与阳离子聚合物的絮凝导致形成较大的颗粒，其然后从溶液中脱落。
67.向含有或已经含有表达重组蛋白的细胞的哺乳动物培养基中加入阳离子聚合物，例如聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)使带负电荷的颗粒絮凝，包括细胞(活和非活的)、细胞代谢物和细胞碎片。然后可以通过离心或重力沉降去除这些大絮凝颗粒，与典型的离心收获进料流相比，产生的进料流具有明显更高的收获过滤器阵列(train)流通量。
68.在此过滤器阵列后回收的上清液典型地称作澄清的细胞培养液，其然后将通过多
个步骤进一步处理，典型地包括2或3个色谱步骤和超滤/渗滤步骤，以得到纯化的关注的蛋白质。
69.在进一步纯化或下游纯化过程中，残留的絮凝剂(例如pdadmac)以及其他杂质(包括宿主细胞蛋白质、蛋白质聚集物和降解产物)也将被去除。
70.在本文上下文中，测量纯化的蛋白质样品(典型地称作药物物质)中pdadmac的终浓度以确保足够的清除可能是有意义的，但在纯化步骤期间进行这种测量以改善对整个过程的控制也可能是有意义的。
71.因此，在本发明方法的一个具体的实施方案中，样品得自最终纯化的关注的蛋白质。并且在本发明的方法的一个替代实施方案中，样品得自所述蛋白质的纯化流中的步骤。
72.在第二个方面，本发明涉及制造关注的蛋白质的方法，其包括在蛋白质纯化过程中添加pdadmac的步骤，其中根据前述段落中所述的方法测量所述pdadmac的去除。
73.如本文所用，术语“抗体”是指单克隆或多克隆抗体。如本文所用，术语“抗体”包括、但不限于通过本领域已知的重组技术产生的重组抗体。“抗体”包括任何物种的抗体，特别是哺乳动物物种的抗体；例如任何同种型的人抗体，包括igd、igg1、igg
2a
、igg
2b
、igg3、igg4、ige和作为这种基本结构的二聚体产生的抗体，包括igga1、igga2或五聚体，例如igm及其修饰变体，非人灵长类抗体，例如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴；啮齿动物抗体，例如来自小鼠或大鼠；兔子、山羊或马抗体；和骆驼抗体(例如来自骆驼或美洲驼，例如nanobodies
tm
)及其衍生物；或鸟类的抗体，例如鸡的抗体或鱼物种的抗体，例如鲨鱼的抗体。术语“抗体”还指“嵌合”抗体，其中至少一个重链和/或轻链抗体序列的第一部分来自第一物种，而重链和/或轻链抗体序列的第二部分来自第二物种。本文关注的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如旧世界猴，例如狒狒、恒河猴或食蟹猴)和人恒定区序列的可变结构域抗原结合序列。“人源化”抗体是嵌合抗体，其包含来源于非人抗体的序列。在大部分情况下，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人类物种(供体抗体)的高变区[或互补决定区(cdr)]的残基替代，其具有期望的特异性、亲和力和活性，所述非人类物种例如小鼠、大鼠、兔子、鸡或非人灵长类动物。在大多数情况下，人(受体)抗体在cdr之外即在框架区(fr)中的残基另外被相应的非人类残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体性能。人源化降低了非人类抗体在人类中的免疫原性，从而促进了抗体在人类疾病治疗中的应用。人源化抗体和产生它们的几种不同技术是本领域众所周知的。术语“抗体”还指人抗体，其可以作为人源化的替代物产生。例如，有可能产生转基因动物(例如小鼠)，这些动物在免疫接种后能够在不产生内源性鼠抗体的情况下产生完整的人抗体库。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(jh)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在用所述抗原免疫接种携带人种系免疫球蛋白基因的转基因动物时产生对特定抗原具有特异性的人抗体。生产此类转基因动物的技术和从此类转基因动物中分离和生产人抗体的技术是本领域已知的。或者，在转基因动物中；例如小鼠，只有编码小鼠抗体可变区的免疫球蛋白基因被相应的人可变免疫球蛋白基因序列替代。编码抗体恒定区的小鼠种系免疫球蛋白基因保持不变。按照这种方式，抗体效应子在转基因小鼠的免疫系统中发挥作用，且由此b细胞发育基本保持不变，这可能会导致体内抗原攻击时抗体反应的改善。一
旦从这些转基因动物中分离出编码特定关注抗体的基因，则可以用人恒定区基因替代编码恒定区的基因，以得到完整的人抗体。用于体外得到人抗体/抗体片段的其他方法基于展示技术，例如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中使用至少部分人工产生或从供体免疫球蛋白可变(v)结构域基因库产生的重组dna文库。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术是本领域众所周知的。人抗体也可以从分离的人b细胞产生，这些人b细胞用关注的抗原离体免疫接种，随后融合产生杂交瘤，然后可以筛选最佳人抗体。如本文所用，术语“抗体”也指无糖基化抗体。
[0074]
如本文所用，术语“抗体”不仅指任何物种的未截短的抗体，包括来自人(例如igg)和其他哺乳动物物种的抗体，而且还指抗体片段。抗体片段包含至少一个本领域已知的重链或轻链免疫球蛋白结构域并结合一种或多种抗原。本发明的抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv和scfv片段；以及双体、三体、四体、微型抗体、结构域抗体(dab)，例如单结构域抗体(sdab)、vhh和v
nar
片段、单链抗体、由抗体片段或抗体形成的双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括、但不限于fab-fv或fab-fv-fv构建体。如上定义的抗体片段是本领域已知的。
[0075]
在一个实施方案中，所述抗体为多特异性分子，其包含下列成分或由下列成分组成：
[0076]
a)式(i)的多肽链：
[0077]
vh-ch1-x-v1；和
[0078]
b)式(ii)的多肽链：
[0079]
vl-cl-y-v2；
[0080]
其中：
[0081]
vh表示重链可变结构域；
[0082]
ch1表示重链恒定区结构域，例如其结构域1；
[0083]
x表示价键或连接基；
[0084]
y表示价键或连接基；
[0085]
v1表示dsfv、sdab、scfv或dsscfv；
[0086]
vl表示轻链可变结构域；
[0087]
cl表示来自轻链恒定区的结构域，例如ckappa；
[0088]
v2表示dsfv、sdab、scfv或dsscfv；
[0089]
其中v1或v2的至少一个为wo2015/197772中所述的dsfv或dsscfv，通过引用并入本文。
[0090]
如本文所用，“单链可变片段”或“scfv”是指包含重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)或由重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)组成的单链可变片段，其由vh与vl可变结构域之间的肽接头稳定。vh和vl可变结构可以处于任何适合的方向，例如，vh的c-末端可以连接至vl的n-末端，或者vl的c-末端可以连接至vh的n-末端。
[0091]“二硫化物稳定的单链可变片段”或“dsscfv”是指单链可变片段，其通过vh和vl可变结构域之间的肽接头稳定，并且还包括vh与vl之间的域间二硫键。
[0092]“二硫化物稳定的可变片段”或“dsfv”是指单链可变片段，其在vh和vl可变结构域之间不包括肽接头，而是由vh与vl之间的域间二硫键稳定。
[0093]
在一个具体的实施方案中，所述多特异性抗体为wo2015/197772中所述的形式fab-2x dsscfv的多特异性抗体，通过引用并入本文。
[0094]
在另一个具体的实施方案中，形式fab-2x dsscfv的多特异性抗体为三价抗体，即fv各自结合不同的表位。
[0095]
在另一个具体的实施方案中，所述多特异性抗体具有如wo2015/197772中所述的fab-dsscfv-dsfv形式。
实施例
[0096]
下列实施例使用agilent提供的8μ颗粒(150x2.1mm)plrp-s柱和millipore提供的10％pdadmac水溶液(编号137069)进行。如下详述，得到聚阳离子pdadmac聚合物与所制备样品的其他成分(蛋白质、制剂赋形剂、
…
)之间的分离。
[0097]
实施例1：校准曲线制备
[0098]
使用聚合物的10％重量比体积的参比溶液在适合的蛋白质制剂缓冲液中制备25μg和100μg pdadmac/ml的两种浓缩溶液。将这两种溶液在缓冲液中进一步稀释以得到已知理论浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、8.0和10.0μg pdadmac/ml的校准曲线。在进行hplc分析之前，通过将10μl 15％(v/v)tfa水溶液添加到100μl标准品中来酸化6种校准标准品中的每一种，并注入两次。使用corona
tm veo
tm rs带电荷气溶胶检测器进行分析，
[0099]
应用于洗脱的梯度如下：
[0100]
溶剂a：h2o/tfa 0.1％
[0101]
溶剂b：ch3cn/tfa 0.1％
[0102]
溶剂c：meoh/tfa 0.1％
[0103] 时间(min)流速(ml/min)％a％b％c1起始0.800905524.000.800905535.500.8005054546.300.8005054557.000.80037184567.500.800107020714.500.800107020815.000.8009055918.500.8009055
[0104]
在待分析的每个系列样品之前和之后注入校准标准品，并且使用校准标准品的12次注入面积构建具有1/x权重的二次(二阶)回归线。得到的校准曲线的实例如图1中所示。决定系数(r2)为1.00(≥0.98，典型接受标准)。然后将针对每个分析样品得到的pdadmac测量值插入校准曲线，并确定pdadmac浓度。
[0105]
实施例2：结果的线性
[0106]
在一次验证练习的情况时，将pdadmac加标到最初包含56.8mg抗体/ml样品的药物物质(igg4)样品中，在五个浓度水平(1.0、2.0、5.0、8.0和10.0μg/ml)，每个级别制备三次。
在hplc分析之前，通过将10μl 15％tfa水溶液添加到100μl标准品中并进一步稀释添加110μl适合的蛋白质制剂缓冲液来酸化每个样品。所述方法适用于分析15种制剂，并将得到的单个测量浓度(μg pdadmac/ml的加标样品)与加标pdadmac的理论水平绘图。如图2中所示，所得线性回归的决定系数(r2)为1.00(≥0.98，典型的可接受标准)。因此，所述方法在评估范围内是线性的(1.0至10.0μg pdadmac/ml药物物质样品)。
[0107]
实施例3：定量测量
[0108]
每个样品都按“原样”进行分析，并加标1.0μg pdadmac/ml样品(每个样品制备三次)。6种制剂中的每一种都经过如下酸化和稀释步骤：在hplc分析之前，向100μl样品中加入10μl 15％tfa水溶液和110μl适合的蛋白质制剂缓冲液。
[0109]
对未加标和加标1.0μg pdadmac/ml的药物物质样品(包含97.8mg igg4抗体/ml并得自应用了pdadmac絮凝的制造方法)得到的典型色谱图的叠加显示在图3中。
[0110]
为避免检测器可能受到污染或结垢，仅在读取pdadmac峰值信号所必不可少的时间期间(即pdadmac峰保留时间之前约1分钟和之后1分钟)才使用cad仪器的切换阀。该曲线显示接近5.3分钟的pdadmac聚合物的代表峰。由于在pdadmac峰的保留时间(5.3分钟)未检测到干扰峰，因此证明了所述方法的特异性。此外，在样品之间没有观察到明显的pdadmac夹带污染物，正如通过从最高pdadmac浓度开始对校准曲线进行测量并逐渐降低到最低浓度的参比标准品，并在校准曲线后注入一个空白来确定的。
[0111]
考虑到理论pdadmac浓度，使用6种校准标准品的注入得到回归线。验证未加标样品中不存在pdadmac，同时从曲线插入加标样品中测量浓度。使用在三次重复制备中测量的pdadmac浓度，1.0μg/ml的加标水平验证如下：
[0112]
·
测量与理论pdadmac浓度之间的各个％回收必须在60％至140％之间。
[0113]
·
3种测量的pdadmac浓度的％rsd(相对标准偏差)必须≤15％。
[0114]
图4显示了两种不同药物物质样品中得到的在1.0μg/ml加标水平下的pdadmac回收。
[0115]
实施例4：真实度、精密度和定量限
[0116]
pdadmac测量的验证使用两个药物物质样品进行。样品来自同一抗体的两个不同制造批次，一个使用絮凝剂制造(以下称作“絮凝”样品)，而另一个不使用絮凝剂制造(下文称作“未絮凝”样品)。未絮凝样品包含56.8mg igg4抗体/ml，而絮凝样品包含97.8mg igg4抗体/ml。两个样品都添加了三个浓度水平：1.0、2.0和5.0μg pdadmac/ml，并在每种水平下一式三份用本发明的方法分析两次(在分开的日期)。每种制剂均经历了与上述实施例2和3中所述相同的酸化和稀释步骤。评估了以下参数：
[0117]
·
与理论pdadmac浓度相比的真实度(％回收)基于实际测量的pdadmac浓度计算(每种情况下每种水平的三次重复制备的平均值)。
[0118]
·
精密度-重复性(％rsd，n＝3)使用单独的pdadmac浓度计算(针对每种制剂、每种情况下的每个水平测量)。
[0119]
·
总体中间精密度(％rsd，n＝6)使用单独的pdadmac浓度计算(针对每种制剂、在两种情况下的每个水平测量)。
[0120]
如图5中所示，对于如此低水平的杂质，在评估的三种浓度水平下的三个参数均满足典型的验收标准：
[0121]
·
真实度在60％-140％内的平均值(n＝3)％回收
[0122]
·
精密度-重复性的平均值(n＝3)％rsd≤15％
[0123]
·
中间精密度的总平均值(n＝6)％rsd≤20％
[0124]
样品中pdadmac的定量限(按照满足三个典型可接受标准的样品中最低加标浓度计算)为1.0μg pdadmac/ml样品。
[0125]
实施例5：所述方法在另外的抗体形式中的应用：
[0126]
在另外的实验中，本发明的方法针对以58.2mg/ml配制的fab-scfv以及如wo2015/197772中所述的以80mg/ml配制的fab-2x dsscfv进行了验证。所述方法变成了1.0μg pdadmac/ml目标限值的限值测试。在这种情况下，根据校准曲线(0.3至5.0μg pdadmac/ml)对加标样品中定量的pdadmac浓度(以μg/ml计)进行定量，以计算相对于理论1.0μg/ml加标浓度的％回收。
[0127]
对于两种修饰抗体形式，来源于例如柱、仪器和操作员这样的因素对方法变异性的贡献被视为相同。因此，最初在掺入1.0μg pdadmac/ml的fab-scfv样品中进行四次(每种情况重复6次)，以评估真实度、精密度-重复性和中间精密度。此外，在第五次实验中，验证了类似加标的fab-2x dsscfv fab真实度和精密度-重复性。
[0128]
在fab-scfv和fab-2x dsscfv样品中，通过添加10％tfa水溶液，然后在适当的缓冲液中稀释2倍，以1.0μg pdadmac/ml的浓度进行6次重复加标。得到的结果如图6中所示。
[0129]
在两种修饰抗体形式中，均评估了真实度和精密度-重复性，并满足了典型的可接受标准(60-140％内的％回收和％rsd n＝6制剂不超过15％)。此外，在fab-scfv抗体形式中，四次情况的中间精密度在可接受标准内(有关24个加标样品中测量的pdadmac浓度的总体rsd不超过20％)。
[0130]
实施例6：所述方法在不同样品制备中的应用：
[0131]
将一种可替代选择的样品制备方法评估为极限测试方法(检测极限1μg/ml)。为了进行这种测量，制备两种样品：
[0132]-一种样品为纯净的(作为药物物质得自制造方法)，且
[0133]-另一种样品为1μg pdadmac/ml加标样品，
[0134]
然后将两者在80℃下与强酸(在这种情况下为37％的盐酸)一起温育3小时。温育后，将样品蒸发过夜直至完全干燥。然后将它们在0.5％tfa水溶液中重构，然后用离心过滤器单元(30kda截断孔径)离心以进行纯化和pdadmac浓缩。在0.1％tfa水溶液中重构包含被过滤器保留的pdadmac的样品。
[0135]
然后在plrp-s柱上将pdadmac与蛋白质残留物和剩余的赋形剂和杂质分离，并使用cad检测器根据本发明的方法进行测量。
[0136]
示例性结果如图7中所示。所述方法已针对多种抗体形式进行了验证，从而评估了每种情况下6次重复的特异性和检测限。针对每种情况优化了与盐酸的温育时间，并确定在80℃下3至6小时内。
[0137]
由于基质干扰被完全去除，这些样品制备步骤的添加对于评估过程样品中的pdadmac清除具有特别意义。