海松烷型二萜类化合物及制备方法和在制备抗炎药物中的应用与流程

1.本发明涉及天然药物化学技术领域，特别涉及海松烷型二萜类化合物及制备方法和在制备抗炎药物中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.炎症是由内外环境中的有害刺激引起的复杂的生理和病理反应。它通过相关的信号通路清除有害因素和受损组织，并在许多人类疾病的发展中发挥重要作用。脂多糖(lps)是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种成分，是体内炎症和免疫反应的诱导剂。它是强有力的单核巨噬细胞激活剂，在启动宿主对细菌感染的炎症和免疫反应中起着重要作用。巨噬细胞受刺激后可分泌多种炎症介质，如一氧化氮、前列腺素e2、诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶
‑
2、肿瘤坏死因子
‑
子、白细胞介素
‑
6、白细胞介素
‑
1素等。这些炎症介质的大量产生可能导致全身炎症反应综合征、严重的组织损伤和内毒素休克。因此，活化的巨噬细胞已被广泛用于评价各种药物的抗炎作用。
4.核因子κ子(nf
‑
κf)是一类具有多种生物活性的核转录因子家族。nf
‑
κf易被某些刺激性物质诱导和激活。通过特异性结合启动子基因位点，nf
‑
κf启动下游基因的转录和促进蛋白的表达，从而促进炎症相关因子的合成和分泌，导致体内一系列变化，并介导相关疾病的发生。nf
‑
κf已被证明是炎症级联反应的上游信号之一。通过抑制nf
‑
κf信号，raw264.7细胞中诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶
‑
2的水平可以下调，炎性介质的释放也可以减少。这种抑制主要是通过nf
‑
κf信号级联和随后的p65从细胞质到细胞核的转位来介导的。此外，已有研究证明，细胞外信号调节激酶和pi3k/akt等上游激酶也参与了nf
‑
κf转录活性的增强，因此，nf
‑
κf在介导炎症和免疫应答中起着核心作用。
5.荆芥属植物nepetaadenophyta hedge(简称：nah)为巴基斯坦吉尔吉特地区特色植物，在当地吉尔吉特地区广泛使用，具有祛风止面、穿透皮疹、祛疮的功效。目前报道该植物化学成分的文献较少，尚未发现具有抗炎作用的活性成分。组分及其药理活性研究较少，未有对该植物进行分离和药理研究。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术的不足，本公开提供了海松烷型二萜类化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用，对荆芥属植物nepetaadenophyta hedge(简称：nah)中抗炎活性成分(2r,4as,4bs,8as)
‑2‑
ethenyl
‑
1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9
‑
dodecahydro
‑
2,4b,8,8
‑
tetramethyl
‑
3,5
‑
phenanthrenediol(简称：nac)进行分离和结构鉴定，并对nac抗炎活性的分子机制进行了系统研究。并采用gc
‑
ms/ms、lc
‑
ms/ms和nmr法进行结构解析，采用细
胞和小鼠实验对分离得到的单体化合物抗炎活性进行了评价。
7.具体地，本发明是通过如下技术方案实现的：
8.在本发明的第一方面，一种从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法，包括：
9.(1)：将nah药材萃取得到萃取物，将萃取物蒸发干燥得到粗品；
10.(2)：将粗品悬浮于水中后用等体积正己烷和乙酸乙酯萃取得到萃取物，采用硅胶柱色谱对正己烷萃取物进行分离，得到24个组分，为fr.1
‑
fr.24；
11.(3)：继续对fr.11进行二次分离，以甲醇为溶剂进行重结晶，获得高纯度化合物(2r,4as,4bs,8as)
‑2‑
ethenyl
‑
1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9
‑
dodecahydro
‑
2,4b,8,8
‑
tetramethyl
‑
3,5
‑
phenanthrenediol。
12.在本发明的第二方面，海松烷型二萜类化合物，采用任一所述的从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法提取得到，所述化合物结构如下：
[0013][0014]
在本发明的第三方面，以任一所述的从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法提取得到的化合物为活性成分，加入药剂学上接受的辅料按照常规的制备方法可以制成药剂学上接受的任一制剂。
[0015]
在本发明的第四方面，任一所述的从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法提取得到的化合物在以下任一领域中的应用，所述应用包括：
[0016]
抑制raw264.7细胞中的no、tnf
‑
α、il
‑
1β、pge2和il
‑
6的表达；
[0017]
或，减少lps激活的细胞中no和pge2的产生；
[0018]
或，抑制tlr4、p
‑
p65和p
‑
iκbα及其下游靶点；
[0019]
或，抑制p
‑
p65蛋白的表达。
[0020]
在本发明的第五方面，任一所述的从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法提取得到的化合物和/或所述的制剂在制备治疗炎症药物中的应用。
[0021]
本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
[0022]
(1)、研究结果表明，nac能显著抑制raw264.7细胞中的no、tnf
‑
α、il
‑
1β、pge2和il
‑
6的表达。akt1在lps诱导的cox
‑
2表达、ros生成和ho
‑
1过表达中起关键作用，为炎症性疾病的治疗提供了新的特异性靶点和替代途径，在开发新型功能食品和开发天然药物方面具有很大潜力。
[0023]
(2)、本发明建立的分离方法，可快速制备出nac，为该化合物的快速制备提供技术途径。
[0024]
(3)、本发明首次从nah中提取分离出了高纯度海松烷型二萜类化合物nac，并发现该化合物具有抗炎作用，对于制备治疗炎症药物具有重要的应用前景。
附图说明
[0025]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0026]
图1：nac的gc
‑
ms/ms色谱图(a)和gc
‑
ms/ms裂解图(b)；
[0027]
图2：nac的lc
‑
ms/ms色谱图(a)和lc
‑
ms/ms裂解图；
[0028]
图3：nac的mtt比色试验结果；
[0029]
图4：nac产生no的能力；
[0030]
图5：nac的共聚焦扫描电镜结果；
[0031]
图6：nac的抗炎通路检测结果。
具体实施方式
[0032]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0033]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合
[0034]
目前，尚未发现nah植物化学成分具有抗炎作用的活性成分，也没有从nah中分离提取出具有抗炎活性成分物质的报道，但是，本发明却发现，nah中含有抗炎作用的活性成分，并采用特定的分离提取方法首次从nah中分离得到了抗炎活性成分，提供了一种从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法和应用。
[0035]
在本发明的一种或多种实施例中，一种从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法，包括：
[0036]
(1)：将nah萃取得到萃取物，将萃取物蒸发干燥得到粗品；
[0037]
(2)：将粗品悬浮于水中后用等体积正己烷和乙酸乙酯萃取得到萃取物，采用硅胶柱色谱对正己烷萃取物进行分离，得到24个组分，为fr.1
‑
fr.24；
[0038]
(3)：继续对fr.11进行二次分离，以甲醇为溶剂进行重结晶，获得高纯度化合nac。
[0039]
目前，还没有从nah药材中提取得到高纯度海松烷型二萜类化合物nac的方法。同时，也没有相关研究报道该化合物具有抗炎作用。
[0040]
在上述提取、分离过程中，采用等体积的正己烷和乙酸乙酯萃取，得到正己烷和乙酸乙酯萃取物，其中，正己烷萃取物中含有抗炎活性成分海松烷型二萜类化合物，而乙酸乙酯萃取物中化合物极性较大，不含有该类成分，通过正己烷萃取，有利于富集海松烷型二萜类成分。
[0041]
步骤(1)中，所述萃取包括：将nah药材在室温下用无水乙醇浸泡提取，保持固液比为1:10
‑
20；优选的，为1:15；或，所述蒸发采用的旋转蒸发器进行蒸发。其中，保持固液比为1:15，有利于保持海松烷型二萜类成分较高的提取率，同时，有利于提高提取纯度，降低杂质的影响。
[0042]
步骤(2)中，采用硅胶柱色谱进行分离时，洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯。以正己烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱：20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、纯乙酸乙酯，v/v。该梯度洗脱并非任一洗脱条件都能分离出海松烷型二萜类化合物，基于该梯度洗脱条件，有利于快速定向制备出nac化合物，避免出现杂质，改变洗脱条件，容易导致富集效果较差。
[0043]
步骤(3)中，所述二次分离包括：对正己烷/乙酸乙酯＝5:1，v/v洗脱组分fr.11进行二次分离，以氯仿/甲醇体系为洗脱剂，进行梯度洗脱。需要注意的是，fr.11中含有nac，而其他组分中，无法提取得到抗炎活性组分海松烷型二萜类化合物。
[0044]
其中，为了进一步提高分离纯度和效果，进一步地，所述氯仿/甲醇的体积比为20:1
‑
10:1，该条件下有利于高纯度化合物的提取和分离。
[0045]
在本发明的一种或多种实施例中，海松烷型二萜类化合物，采用任一所述的从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法提取得到，所述化合物结构如下：
[0046][0047]
在本发明的一种或多种实施例中，以任一所述的从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法提取得到的化合物为活性成分，加入药剂学上接受的辅料按照常规的制备方法可以制成药剂学上接受的任一制剂；
[0048]
进一步地，所述制剂包括但不限于胶囊剂、注射液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、口崩片、气雾剂。
[0049]
在本发明的一种或多种实施例中，任一所述的从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法提取得到的化合物在以下任一领域中的应用，所述应用包括：
[0050]
抑制raw264.7细胞中的no、tnf
‑
α、il
‑
1β、pge2和il
‑
6的表达；
[0051]
或，减少lps激活的细胞中no和pge2的产生；
[0052]
或，抑制tlr4、p
‑
p65和p
‑
iκbα及其下游靶点；
[0053]
或，抑制p
‑
p65蛋白的表达。
[0054]
在本发明的一种或多种实施例中，任一所述的从nah中提取海松烷型二萜类化合物的方法提取得到的化合物和/或所述的制剂在制备治疗炎症药物中的应用。
[0055]
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
[0056]
实施例1
[0057]
1.材料和方法
[0058]
1.1化学品和试剂
[0059]
dmem高糖培养液、胎牛血清(fbs)和磷酸盐缓冲盐水(pbs)培养液、mtt和dmso购自
北京太阳能生物科技有限公司。小鼠肿瘤坏死因子
‑
α、白细胞介素
‑
6和白细胞介素
‑
1β酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒和pge2购自美国ebioscience公司。lps(大肠杆菌0111：b4)购自美国sigma aldrich公司。抗tlr4、cox
‑
2、诱导型一氧化氮合酶、磷酸化iκbα、ho
‑
1、β
‑
肌动蛋白和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体均购自美国cell signating technology公司。其他化学品和试剂都是分析级的，实验用水为milliq纯净水。
[0060]
1.2样品的提取和分离
[0061]
将干燥的nah全株原料(5.5kg)在室温下用无水乙醇浸提3次(3
×
24h)，固液比为1：15。合并萃取液，用旋转蒸发器蒸发至干燥，最终得到乙醇提取物480g。将乙醇提取物10g悬浮于200ml水中，分别用等体积的正己烷和乙酸乙酯萃取3次，得到正己烷和乙酸乙酯萃取物36.48g和129.12g。采用硅胶柱色谱对正己烷萃取物进行分离，以正己烷/乙酸乙酯体系为洗脱剂，进行梯度洗脱(20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、纯乙酸乙酯，v/v)，得到24个组分(fr.1
‑
fr.24)。正己烷/乙酸乙酯＝5:1洗脱组分fr.11进行二次分离，以氯仿/甲醇体系为洗脱剂(20:1～10:1，v/v)，进行梯度洗脱，以甲醇为溶剂进行重结晶，最终得到高纯度化合物(2r,4as,4bs,8as)
‑2‑
ethenyl
‑
1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9
‑
dodecahydro
‑
2,4b,8,8
‑
tetramethyl
‑
3,5
‑
phenanthrenediol(简称：nac)1.3g。
[0062]
1.3抗炎活性研究
[0063]
1.3.1细胞培养
[0064]
取自中国中医科学院的raw264.7细胞，在含10％胎牛血清和100u/ml青霉素/(100μg/ml)链霉素的高糖dmem培养基中，37℃，5％的co2培养。
[0065]
1.3.2细胞活力测定
[0066]
mtt比色法检测nac对raw264.7细胞活力的影响。raw264.7细胞接种于96孔板，密度为10
×
105个/ml。培养24h后，分别加入50、100、200、400、800μm的nac，培养24h。每孔加入10μl的mtt(5mg/ml)继续培养4h。抽出培养基，加入100μldmso溶解形成的晶体。用酶标仪在490nm波长下测量每孔的光密度(od)值。
[0067]
1.3.3一氧化氮的测定
[0068]
将raw264.7细胞接种于96孔板，调整细胞密度为10
×
105个/ml。在孵箱中培养24h后，分别加入不同浓度的nac，浓度分别为25、50、100μm。每种浓度设置6个平行。同时设空白对照组和脂多糖模型组。将96孔板放回培养箱中继续培养24h后，将每孔上清液50μl吸收到新的96孔板中，每孔加入griess试剂。用酶标仪在540nm处测量了96孔板的吸光度。
[0069]
1.3.4酶联免疫吸附试验
[0070]
对照组、模型组(200ng/ml的lps处理)、3个剂量组(200ng/ml的lps 25、50、100μm的nac样品)和raw264.7细胞接种于48孔板中培养24h。取细胞培养上清液(30μl/孔)测定细胞炎症因子。
[0071]
用elisa试剂盒检测nac样品对肿瘤坏死因子
‑
α、白细胞介素
‑
6和白细胞介素
‑
1mrna的抑制作用。
[0072]
1.3.5蛋白印迹分析
[0073]
raw264.7细胞(10
×
105/ml)接种于6孔板中，每孔2ml。培养24h后，用脂多糖(200ng/ml)和不同浓度的nac样品(25、50、100μm)处理细胞，并设空白对照组和脂多糖模型组，24h后提取细胞总蛋白。用pbs洗涤细胞，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa
裂解液，冰冻30min。上清液以12000r/s的速度离心10min。用bca蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，加入5x负载缓冲液，煮沸变性。sds
‑
pgae分离不同组相同浓度的蛋白质，转移到pvdf膜上。加入4％(w/v)的脱脂奶粉(均用tbst稀释)封口，置于室温摇床中1h，再用tbst清洗5min。加入一抗(一抗稀释液以1:10 0 0稀释)，在4℃的摇床中孵育过夜。回收一抗，用tbst洗膜。然后加入4％(w/v)的脱脂奶粉稀释二抗(辣根过氧化物酶结合山羊抗体)，在37℃恒温摇床中孵育1h。最后用tbst洗涤3次，ecl化学发光。
[0074]
1.3.6免疫荧光分析
[0075]
raw264.7细胞接种于激光共聚焦培养皿中12h后，用lps刺激，100μmnac样品孵育。24h后，用pbs洗涤细胞，室温下4％甲醛固定10min。然后，用0.1％triton x
‑
100渗透4min，用pbs清洗两次。细胞与抗nf
‑
κb的p65抗体(1:1000)孵育过夜，然后用硫代巴比妥钠洗涤2次，与cy3标记的山羊抗兔igg在室温黑暗中孵育1h。最后，细胞与dapi贴壁培养基孵育10min。然后通过荧光显微镜对样品进行分析。
[0076]
统计分析
[0077]
数据采用graphpad prism 8.0软件进行统计分析。p值小于或等于0.05被认为具有统计学意义。
[0078]
2.结果
[0079]
2.1结果确认
[0080]
对实施例1中1.2提取并分离的化合物分别采用gc
‑
ms/ms、lc
‑
ms/ms进行分析，谱图如图1、2所示，具体检测条件如下：
[0081]
gc
‑
ms/ms分析检测条件为：
[0082]
色谱条件：使用氦气(99.999％)为载气，载气流速为1.0ml/min。喷射器温度280℃，初始温度100℃，以10℃/min的速度增加至270℃，不分流。
[0083]
质谱条件：碰撞能量为70ev，扫描范围m/z 29
‑
600，用nist库进行结果辨别。
[0084]
lc
‑
ms/ms分析检测条件为：乙腈和水为流动相，梯度洗脱条件为0
‑
5min，75％水，5
‑
17min，75％
‑
25％水，17
‑
22min，25％
‑
75％水，22
‑
25min，75％水。检测波长390nm，流速1ml/min，进样量10l/。毛细管电压为3500v，端板偏移为500v，雾化器气压力2.0bar，载气流速8.0l/min，干燥气温度200℃，扫描范围m/z 50
‑
1500。
[0085]
目标化合物的如式1所示，结构鉴定数据如下：
[0086][0087]
白色粉末，m/z＝303.2260[m
‑
h]

，分子式c
20
h
32
o2，1h
‑
nmr(dmso
‑
d6,400mhz)δ:3.48
(1h,m,h
‑
1),1.44(2h,m,h
‑
2),1.61(2h,m,h
‑
3),1.36(1h,m,h
‑
5),1.85(2h,m,h
‑
6),5.29(1h,m,h
‑
7),2.54(1h,m,h
‑
9),1.57(2h,m,h
‑
11),3.56(1h,dd,j＝11.5,4.4hz,h
‑
12),1.97(2h,m,h
‑
14),5.90(1h,dd,j＝17.6,10.9hz,h
‑
15),4.92(2h,m,h
‑
16),0.75(3h,s,h
‑
17),0.89(3h,s,h
‑
18),0.84(3h,s,h
‑
19),0.78(3h,s,h
‑
20).
13
c
‑
nmr(dmso
‑
d6,100mhz)δ:148.5(ch,c
‑
15),135.3(c
‑
8),120.5(ch,c
‑
7),111.3(ch2,c
‑
16),73.9(ch,c
‑
12),69.4(ch,c
‑
1),45.2(ch2,c
‑
14),43.8(ch,c
‑
5),42.0(c
‑
13),41.3(ch,c
‑
9),39.0(c
‑
10),34.1(ch2,c
‑
3),33.8(ch3,c
‑
19),32.5(c
‑
4),28.5(ch2,c
‑
11),25.9(ch2,c
‑
2),23.4(ch2,c
‑
6),23.0(ch3,c
‑
18),15.4(ch3,c
‑
17),15.2(ch3,c
‑
20)。化合物鉴定为(2r,4as,4bs,8as)
‑2‑
ethenyl
‑
1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9
‑
dodecahydro
‑
2,4b,8,8
‑
tetramethyl
‑
3,5
‑
phenanthrenediol。
[0088]
2.2 nac的细胞活力测定结果
[0089]
为评价nac的毒性水平，首先用raw264.7细胞进行mtt比色试验。如图3所示，结果表明nac在200μm浓度以下不能诱导细胞死亡。在200μm以上，对细胞有明显的毒性(p<0.05)。
[0090]
2.3 nac对no生成的影响
[0091]
用raw264.7细胞进行griess法检测nac产生no的能力。如图4所示，结果表明结果表明nac在200μm浓度以下不能诱导细胞死亡。
[0092]
2.4促炎细胞因子的抑制作用
[0093]
为评价nac对炎性细胞因子的抗炎作用，在48细胞培养板中加入不同浓度nac(25、50、100μm)的lps。结果如图4和5所示，与对照组相比，随着剂量的增加，no、tnf
‑
α、il
‑
1β和il
‑
6均显著降低(p<0.05)。它还具有剂量依赖性。
[0094]
2.5 nac通过抑制nf
‑
κb和akt信号通路抑制脂多糖刺激的ra w264.7细胞
[0095]
在正常细胞中，nf
‑
κb与iκbα结合形成蛋白质复合物，定位于细胞质中。脂多糖刺激后，其抑制剂iκbα被磷酸化，然后被泛素化，蛋白降解，释放nf
‑
κb移位到细胞核，引发炎症反应。因此，为了探讨nac通过nf
‑
κb信号通路对iκbα磷酸化和降解的影响，进行了western blot分析。结果表明，nac对nf
‑
κb依赖的炎症通路有明显的抑制作用。如图6所示，内毒素处理组iκbα磷酸化水平显著升高，但这种作用可被剂量依赖性的nac显著修正(p<0.05)。
[0096]
结论：
[0097]
首次研究了从荆芥属植物nah中分离出的nac的炎症作用，结果表明它能显著抑制raw264.7细胞中的no、tnf
‑
α、il
‑
1β、pge2和il
‑
6的表达。细胞因子、脂多糖等多种刺激均可诱导过量的no、tnf
‑
α、il
‑
6等。所有能促进细胞增殖、肿瘤血管生成和生长的促炎细胞因子都与炎症性疾病和其他一些疾病的发病机制有关。此外，还发现nac可减少lps激活的细胞中no和pge2的产生，提示nac可能抑制inos酶和cox
‑
2的蛋白活性。这意味着它可能通过调节nf
‑
κb/akt信号通路来阻断raw264.7细胞中cox
‑
2和inos的表达。对tlr4、p
‑
p65和p
‑
iκbα及其下游靶点均有明显的抑制作用，并对其抗炎作用有积极作用。免疫组织化学检测发现，nac能显着抑制高表达的p
‑
p65蛋白的表达，从而阻断其进入细胞核的表达。提示它与nf
‑
κb的调节有潜在的密切关系。这些调节作用不仅与肿瘤、炎症和感染的治疗有关，而且对某些自身免疫性疾病的治疗也有重要意义。
[0098]
综上所述，研究结果表明，akt1在lps诱导的cox
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2表达、ros生成和ho
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1过表达中起关键作用，为炎症性疾病的治疗提供了新的特异性靶点和替代途径，在开发新型功能食品和开发天然药物方面具有很大潜力。
[0099]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。