一种重组蛋白K-S及其制备方法和应用与流程

一种重组蛋白k-s及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白k-s及其制备方法和应用。


背景技术：

2.由sars-cov-2引起的covid-19，在全球引起的大流行已经造成了超过了2亿次的感染和430余万死亡病例。这一趋势随着在全球不时出现的变异株大流行而进一步加剧，更加引起了人们的广泛关注和担忧。随着全球大流行，各种变异株不断出现，包括阿尔法、贝塔、伽玛、德尔塔和拉姆达等，还无法预料后续会出现何种新的变异株。所有已出现的变异株都具有两个共同特点，传染性和免疫逃逸力都显著增强。疫苗是预防和控制传染病最有效的途径，面对全球变异株大流行等复杂多变的趋势，疫苗接种仍然是最有效防控手段。面对疫情反扑等严峻形势，多国都准备在原来两针疫苗的基础上接种“加强针”。目前来看，所谓“加强针”可以是原来的疫苗，也可以用新的变异毒株或新的目的基因序列代替原来的疫苗。但所有的这些疫苗都是基于现有的一种变异株而言，存在一定的滞后性和局限性。比较理想的情况是，生产出一种疫苗，可以应对当前的各种变异株，还能预测将来可能的流行株，即所谓的第二代疫苗，可以从根本上解决变异株免疫逃逸的问题。


技术实现要素：

3.为了解决covid-19变异株感染性和免疫逃逸增强的问题，本发明提供了一种重组蛋白k-s及其制备方法和应用。
4.本发明的技术方案如下：
5.一种重组蛋白k-s，其核苷酸序列如seqidno：1，或者蛋白序列如seqidno：2。
6.本发明还提供一种重组蛋白k-s的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)根据已经公布的基因序列(mt226610.1)，选取s1蛋白的核苷酸序列；
8.(2)在所述s1蛋白的核苷酸序列上，对6个关键位点进行突变构建新序列，突变位点及碱基分别为：g1251t，t1355g，g1450c， a1501t，a1841g和c2042g，编码蛋白后相应的位点为：k417n， l452r，e484q，n501y，d614g和p681r；
9.(3)所述新序列两端加上酶切位点nheⅰ(gctagc)和kpn
ꢀⅰ
(ggtacc)，连接到真核表达载体pcdna3.1中，利用cho-s 细胞(thermofisher)进行表达；
10.(4)获取表达后的上清液，进行蛋白纯化得到重组蛋白k-s；
11.所述重组蛋白k-s核苷酸序列或蛋白序列如权利要求1所述。
12.本发明还提供重组蛋白k-s的应用，根据上述技术方案的所述重组蛋白k-s应用于新型冠状病毒免疫。
13.进一步地，所述免疫方式为皮内免疫。
14.进一步地，所述重组蛋白k-s与灭活疫苗进行序贯免疫。
15.本发明所使用的灭活疫苗已经公开，由中国医学科学院医学生物学研究所制备。将临床分离sars-cov-2病毒接种于非洲绿猴肾细胞系(vero)后3-5天，细胞出现典型的病
变，收获病毒培养液并过滤，先使用200μg/ml甲醛(hcho)灭活48h，然后再以β丙内酯(bpl) 灭活24h，经超滤浓缩、纯化和过滤得到疫苗原液，再加入氢氧化铝配制而成。
16.有益效果：本发明建立针对已经出现和将要出现的病毒变异株的疫苗抗原制备技术体系，采取序贯免疫策略并创新性地应用皮内免疫的方式进行研究，皮内免疫不同于传统的皮下和肌肉免疫，能在短时间内快速、大量激活皮肤内的免疫细胞，为快速构建新型冠状病毒免疫体系提供理论和技术依据，具体的实验数据，有益效果和原理见具体实施方式。
附图说明
17.图1为重组蛋白k-s和灭活疫苗免疫原性验证图；
18.图2为皮内免疫与肌肉免疫引起的免疫反应比较图；
19.图3为免疫小鼠中和抗体及elisa抗体图；
20.图4为免疫小鼠细胞免疫elispot检测(ifn-γ)图；
21.图5为免疫小鼠攻毒保护效果分析图；
22.图6为小鼠免疫血清对三种毒株的中和作用图；
23.其中，图1(a)图为含有6个突变位点的s1重组蛋白k-s模式图；(b)图为蛋白免疫印迹图，conv:恢复期病人血清，immu:接种者血清。1：s1蛋白，2：k-s重组蛋白；(c)图为蛋白免疫印迹图， 1:重组蛋白(k417n)2:重组蛋白(l452r)，3：重组蛋白(e484q)， 4：重组蛋白(n501y)，5：重组蛋白(d614g)，6：重组蛋白(p681r)，7：rbd蛋白(d)图为病毒抗原免疫电镜，s抗原(左)，n抗原(右)；
24.图2，(a)为皮肤中免疫相关分子mrna不同时间点表达水平比较图，im-v：肌肉免疫灭活疫苗；im-k：肌肉免疫重组蛋白s1； id-v：皮内免疫灭活疫苗；id-k：皮内免疫重组蛋白s1；(b)为皮内与肌肉免疫皮肤中抗原(红色)与树突状细胞(绿色)共定位情况图。(c)为免疫小鼠中和抗体和阳转率图。
25.图3，(a)小鼠序贯免疫灭活疫苗及k-s重组蛋白中和抗体图； (b)小鼠序贯免疫灭活疫苗及k-s重组蛋白elisa抗体图。md-1：单剂重组蛋白k-s组；md-2：佐剂组；md-3：流感对照组；mc-1：单低剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；mc-2：单高剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；mc-3：两剂低剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；mc-4：两剂高剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组。
26.图4，(a)为在重组蛋白(k417n)、(l452r)、(e484k)、 (n501y)和(l452r e484q)作为抗原，分别进行刺激下，特异性 t细胞表达ifn-γ水平图；(b)为在蛋白n作为抗原，分别进行刺激下，特异性t细胞表达ifn-γ水平图。其中，md-1：单剂重组蛋白k-s组；md-2：佐剂组；md-3：流感对照组；mc-1：单低剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；mc-2：单高剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s 组；mc-3：两剂低剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；mc-4：两剂高剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；
27.图5，(a)免疫小鼠攻毒后体重变化图。(b)死亡率图。(c) 攻毒后各组织病毒载量图。(d)鼻和咽部排毒情况图。mb-1：单剂重组蛋白k-s组；mb-2：佐剂组；ma-1：单低剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；ma-2：单高剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；ma-3：两剂低剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；ma-4：两剂高剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组。
28.图6，mb-1：单剂重组蛋白k-s组；mb-2：佐剂组；ma-1：单低剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；ma-2：单高剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组；ma-3：两剂低剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s
组；ma-4：两剂高剂量灭活疫苗 重组蛋白k-s组。
具体实施方式
29.下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
30.实施例1
31.重组蛋白k-s构建及表达
32.根据已经公布的基因序列(mt226610.1)，选取s1蛋白的核苷酸序列，针对目前的流行株构建立含6个突变位点的序列(g1251t， t1355g，g1450c，a1501t，a1841g和c2042g)，对应的蛋白突变位点为k417n，l452r，e484q，n501y，d614g和p681r。把修饰后的序列两端加上酶切位点nheⅰ(gctagc)和kpn
ⅰꢀ
(ggtacc)，委托公司进行序列的人工合成，序列的两端，连接到真核表达载体pcdna3.1中，利用cho-s细胞(thermofisher)进行表达，收获上清液进行蛋白纯化得到重组蛋白k-s。对重组蛋白进行蛋白电泳和蛋白免疫原性鉴定，按实施例2进行。
33.实施例2
34.重组蛋白k-s和灭活疫苗免疫原性鉴定及分析
35.基于目前报道的流行变异株及其变异位点，如图1(a)图所示，本发明设计了带有6个突变位点的s1蛋白k-s (n501y,k417n,e484q,l452r,p681r和d614g)。如图1(b)图所示，蛋白免疫印迹结果表明，重组蛋白k-s能很好的识别病人恢复期血清和新冠灭活疫苗接种者血清。为进一步了解重组蛋白k-s的免疫原性，通过免疫兔制备血清并分别与突变s蛋白(k417n)、(l452r)、 (e484q)、(n501y)、(n439k)、(a520v)和rbd蛋白进行免疫印迹实验，如图1(c)图所示，兔免疫血清能很好的与这些蛋白相互识别。
36.灭活疫苗制备
37.本发明所使用的灭活疫苗由中国医学科学院医学生物学研究所制备。将临床分离sars-cov-2病毒接种于非洲绿猴肾细胞系(vero) 后3-5天，细胞出现典型的病变，收获病毒培养液并过滤，先使用200 μg/ml甲醛(hcho)灭活48h，然后再以β丙内酯(bpl)灭活24h，经超滤浓缩、纯化和过滤得到疫苗原液，再加入氢氧化铝配制而成。
38.本发明使用的灭活疫苗是由甲醛和β丙内酯分别灭活制备而成，如图1(d)图所示，采取两步灭活工艺能有效裂解病毒包膜，充分暴露s和n主要抗原，免疫电镜研究也证明了这一灭活工艺的科学性。在大规模临床试验中，灭活疫苗接种人群后能产生较高的抗体水平。
39.实施例3
40.准备雌性c57和c57bl/6hace
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小鼠，无特定病原体级 (specificpathogenfree,spf)，4周龄，10-15g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，按照实验动物标准饲养规程饲养。接种灭活疫苗1剂或2剂后，初次免疫28天后取血测定中和抗体及elisa抗体。然后进行重组蛋白k-s加强免疫，14天后取血测定中和抗体(印度株(b.1.617.2)、英国株(b.1.351)株和sars-cov-2)及elisa 抗体，加强免疫28天后进行病毒攻击感染，每天采集鼻、咽部拭子，进行排毒监测。在感染后的第3、7和11天每组分别处死3只，进行组织病毒载量检测。
41.(1)中和抗体测定
42.按照实验设计时间在感染后的不同时间段采集0.5ml非抗凝血，分离血清后进行中和抗体检测。将已知滴度的病毒样品10倍系列稀释至2x103ccid50/ml，以50μl/孔将稀释液加入96孔板中，同时将小鼠所制备的抗血清以1:4开始做对倍稀释 (1:4,1:8,1:16,1:32,1:64
……
)。系列稀释血清以50μl/孔分别加入已含病毒的96孔板中，在37℃中和2h后，加入消化后的vero细胞悬液，细胞浓度约为(2-3)x105/ml。于37℃，5％co2孵箱中静置培养5-7天，观察细胞病变情况。抗体效价以能中和相应病毒而阻止细胞不病变的血清最高稀释度计算。
43.(2)elisa检测
44.elisa检测试剂盒购自北京义翘神州科技有限公司。酶标仪购自中国基因公司。按照试剂盒说明书对抗体预包被的elisa板进行醒板，后将标准品、待检样本加入板中，同时设立阴性对照。然后按照试剂盒说明书对板子进行显色，酶标仪450nm处读取吸光度值。
45.(3)特异性ctl检测
46.在相应时间点采集小鼠外周抗凝血，分离pbmc后，于含10％胎牛血清的rpmi1640培养液中4℃暂时保存。按照试剂盒说明书对抗体预包被的elispot板进行醒板，后将一定浓度的pbmc细胞加入板中。随后将抗原肽加入培养液中，随后于37℃，5％co2条件下培养24小时，培养时避免晃动板子。然后去除细胞及培养液，按照试剂盒说明书对板子进行显色，使用elispot自动分析仪(美国ctl 公司)进行记录、统计、分析。
47.实施例4
48.皮内免疫重组蛋白k-s和灭活疫苗可有效激活小鼠先天免疫反应。
49.前期的研究表明，皮内免疫不仅能有效降低疫苗免疫接种时抗原的剂量，还能通过先天免疫和获得性免疫反应增强机体的抗病毒免疫反应。
50.在本发明中，使用micronjet600分别对c57小鼠进行了重组蛋白k-s和灭活疫苗进行皮内免疫和肌肉免疫，在免疫后12、24和48 小时分别取注射部位的皮肤和肌肉进行免疫相关细胞因子表达水平检测，如图2所示，图2中为不同的组别，检测方法都是荧光定量 pcr，与传统肌肉免疫相比，免疫调节信号分子 ifn-α,tnf-α,rankl,btla,light,ikkβ,4ibbl和白介素il-5,il-9,il-13,il-25和il-33均有大幅提高。免疫共聚焦结果也表明，皮内免疫所诱导的树突状细胞(dcs)的数量是肌肉免疫途径的2-3 倍。这些结果表明，皮内免疫蛋白k-s和灭活疫苗可有效提高表皮组织中先天免疫反应，进而激活获得性免疫反应，从而提高机体整体抗病毒免疫反应。免疫小鼠后中和抗体结果也表明(检测方法见实施例 3中中和抗体测定)，皮内免疫蛋白k-s(10ug/剂)和灭活疫苗(30u/ 剂)抗体阳转率为100％，gmt为20-30，而肌肉免疫同等剂量的蛋白k-s和灭活疫苗，阳转率为50％，gmt为3-4。以上结果表明，皮内免疫新冠蛋白或灭活疫苗相较于传统肌肉免疫具有明显的优势。
51.实施例5
52.皮内序贯免疫灭活疫苗及重组蛋白k-s有效激活机体抗体水平
53.本发明以c57bl/6hace
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转基因小鼠为模型进行了免疫效果的分析。在c57bl/6hace
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小鼠中，接种低剂量灭活疫苗(30u/剂)1 剂或2剂后，在末次接种后的28天，进行重组蛋白k-s加强免疫，在加强免疫前和免疫后的14天，分别测定每组中和抗体并计算gmt，如图3所示，结果表明，加强免疫前gmt为88.4，加强免疫14天后为322.5，升高了3.2倍。接种高剂量灭活疫苗(50u/剂)1剂或2 剂后，在末次接种后的28天，进行重组蛋白k-s加强免疫，在
加强免疫前和免疫后的14天，分别测定每组中和抗体并计算gmt，结果表明，加强免疫前gmt为70.2，加强免疫14天后为222.9，升高了 3.6倍，具体检测方法见实施例3中中和抗体测定。
54.针对当前流行株，原有灭活疫苗是否有效，目前来说还没有明确的定论。但可以肯定得是利用一种毒株制备的灭活疫苗不可能同时预防几种流行株的感染。本发明在灭活疫苗接种的基础上，再次以包含多个突变位点的重组s1蛋白进行加强免疫，从理论上讲可有效预防多种流行株的感染。
55.实施例6
56.皮内序贯免疫灭活疫苗及蛋白k-s有效激活机体细胞免疫水平
57.在本发明先前的研究中，无论是免疫的动物还是受试者，在免疫后180天，其记忆性t细胞反应在新冠灭活病毒抗原s和n抗原刺激下，能够快速产生细胞免疫反应，具体检测方法见实施例3中特异性ctl检测。但不清楚重组蛋白加强免疫后，机体能否保持对各种突变体免疫记忆反应。
58.在实施例5的c57bl/6hace
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小鼠模型中，通过分离小鼠 pbmc，分别以不同突变位点(k417n,l452r,e484q,n501y和 l452r e484q)的重组s1蛋白进行刺激，具体检测方法见实施例3 中elisa检测。如图4所示，与阴性对照组(md-1)和佐剂对照组 (md-1)相比，能显著提高机体记忆性细胞免疫，但与免疫接种次数及剂量没有相关性。在n抗原刺激的作用下，所诱导的细胞免疫反应与重组蛋白s1产生细胞免疫反应趋势是一致的。
59.实施例7
60.皮内序贯免疫c57bl/6hace
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小鼠攻毒保护分析
61.通过对皮内序贯免疫小鼠中和抗体和细胞免疫分析，这种策略能够快速诱导机体的免疫反应，且对各种变异株(417n，452r，484q，501y，452r，484q)的免疫记忆反应可在短时间内被快速激活。
62.为进一步验证这种免疫效果，本发明选取一种变异株b.1.617.2，对实施例5上述中免疫的c57bl/6hace
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小鼠进行攻毒保护效果分析。在攻毒后，进行连续11天临床症状观察，如图5所示，单剂量蛋白组(mb-1)、佐剂组(mb-2)均出现了弓背、倒毛和体重减轻，在攻毒后的5-8天均全部死亡，而低剂量组(ma-1和ma-3)仅个别小鼠出现临床症状，致死率为20-25％。单剂次高剂量组(ma-2) 在攻毒后3天1只小鼠出现了临床症状并死亡，致死率为10％。2剂次高剂量组小鼠均无异常，无死亡。从排毒情况来看，高剂量组在感染后的第7天已基本清除病毒，而低剂量组在感染后的第9天基本检测不到病毒。在感染后的第3、7和11天，分别处死3只进行病毒载量检测，高剂量组各组织中基本检测不到病毒。以上结果表明，高剂量组对免疫小鼠具有很好的保护作用。
63.实施例8
64.皮内序贯免疫血清中和流行株及变异株分析
65.病毒感染机体，首先必须与机体上相应的受体进行结合，才能成功入侵细胞并进行感染。中和抗体是适应性免疫细胞b淋巴细胞产生的可溶性蛋白，能与入侵机体的病毒结合，阻止病毒入侵并感染细胞。从某种程度上，中和抗体中和病毒的强弱，可在某种程度上反映对机体的保护效果。通过对c57bl/6hace
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小鼠攻毒保护效果分析，皮内序贯免疫方式能很好的保护b.1.617.2株对其的感染攻击。
66.将免疫小鼠血清与代表性的英国株b.1.351和国内sars-cov-2 进行交叉中和作用分析，如图6所示，发现免疫血清不但能很好的中和b.1.617.2株，也能中和b.1.351株和sars-cov-2，且具有很高的抗体效价，每组均在1:128以上。这也间接说明了，通过皮内序贯免疫的小鼠也能抵御b.1.351株和sars-cov-2的感染。从理论上分析，通过皮内序贯免疫的方式，能抵御目前出现的各种变异株的感染。