一种PCR基因检测试剂盒及其检测方法、扩增方法、应用与流程

一种pcr基因检测试剂盒及其检测方法、扩增方法、应用
技术领域
1.本发明涉及于生物技术领域，特别是一种pcr基因检测试剂盒及其检测方法、扩增方法、应用。


背景技术：

2.idh1基因所编码的蛋白名为异柠檬酸脱氢酶1，人类idh有三种类型，分别为idh1、idh2和idh3，但仅idh1定位与细胞质和过氧化物酶体中发挥主要作用，而idh2和idh3定位与线粒体中。该类蛋白酶可以将异柠檬酸氧化为草酰琥珀酸，然后再转化为α-酮戊二酸。大量研究发现idh1的突变与多种肿瘤密切相关，如肝内胆管癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌、副神经节瘤、急性髓细胞性白血病和脑胶质瘤等。其致瘤机制为突变的idh1能将α-酮戊二酸转化为2-羟戊二酸，然后在细胞内积累，后者可以抑制前者的靶点，导致这些靶点表达异常引发癌症。而idh1最主要的突变类型为r132h突变，占全部突变类型的80%以上，是最关键的idh突变位点，也是多种肿瘤的重要分型标记物。因此，围绕idh的临床诊断和临床治疗迅猛突破。在大多数成人aml研究中，idh1的突变频率约为5.5%-10.4%，针对idh突变的靶向治疗在aml中的潜在效果已在多项体外及体内的临床前研究中得到证实。idh1的抑制剂在一些小鼠模型中取得了较好的临床前结果，目前已在开发针对idh1突变的aml治疗的一些小分子药物，如针对idh1突变的口服靶向抑制剂 lvosidenib(ag-120)用于治疗idh1基因突变的复发或难治性aml的新药已通过fda审批。此外，idh1/2还被写入中枢神经系统肿瘤分类指南，成为了脑肿瘤诊断的金标准之一。
3.目前，肿瘤等疾病相关突变位点的基因检测是通过血液、体液或组织细胞对dna进行检测的技术，随着基因测序技术发展，临床上基因突变检测的金标准是二代测序法，此方法的优点是实验方法简单，结果直观可靠，成本较低，但该技术检测灵敏度较不高，且检测周期较长，通常从临床样本获取到检测报告回复至少需要1-2周时间。随着荧光定量pcr 技术的发展，出现了越来越多的基于pcr的基因检测试剂盒产品，而主流pcr试剂盒通常需要针对肿瘤组织细胞进行人工裂解、清洗、核酸提取、扩增等多个复杂步骤，需要多种试剂、设备和器材顺序配合完成，再利用荧光pcr引物探针等进行光学检测，并依赖于实时定量荧光pcr仪进行检测。整个过程需要专业技术人员操作，且检测较为麻烦，而且在不同步骤间常需要在不同设备之间转移样品，极易产生核酸污染和人工操作误差，十分影响检测精度，且pcr相关设备和pcr实验室建设成本高，占地面积大，维护运营复杂，在临床上推广难度极高，现多由第三方专业检测机构和公司实现检测。


技术实现要素：

4.鉴于上述问题，本发明提出了一种pcr基因检测试剂盒及其检测方法、扩增方法、应用，本发明所述试剂盒针对idh1 r132h突变性基因检测具有超高的灵敏性，检测高效且快速。
5.依据本发明第一方面，提供了一种pcr基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒
包括外引物对、内引物对、探针和反应液，所述试剂盒用于检测肿瘤组织中的idh1 r132h突变型基因。
6.可选地，所述外引物对为检测idh1 r132h突变型基因的引物；所述内引物对为gapdh内参引物；所述探针包括idh1 r132h突变型基因探针、idh1野生型基因探针和gapdh内参基因探针；所述反应液包括idh1野生基因型、idh1 r132h突变基因型以及gapdh内参基因的核酸扩增反应液。
7.可选地，所述检测idh1 r132h突变型基因的引物碱基序列如下所示：idh1 r132h突变型基因上游引物：5'-caccaacgaccaagtcac-3'idh1 r132h突变型基因下游引物：5'-cttggtgtgtaggttatctct-3'所述idh1 r132h突变型基因探针的碱基序列如下所示：5'-catcataggtcatcatgct-mgb-3'所述idh1野生型基因探针的碱基序列如下所示：5'-tcataggtcgtcatgct-mgb-3'所述gapdh内参引物碱基序列如下所示：内参基因上游引物：5'-agatttggacctgcgagcg-3'内参基因下游引物：5'-gagcggctgtctcccacaagt-3'所述gapdh内参基因探针的碱基序列如下所示：5'-ttctgacctgaaggctctgcgcg-3'依据本发明第二方面，提出了一种基于本发明第一方面所述试剂盒的idh1 r132h突变型基因检测方法，包括：对受检样本dna用核酸扩增反应液进行扩增，得到pcr扩增产物；其中，所述pcr扩增产物包括荧光标记的idh1野生型基因、gapdh内参基因和/或idh1 r132h 突变型基因；对所述pcr扩增产物进行分析，得到针对所述pcr扩增产物的扩增曲线，根据所述扩增曲线判断肿瘤组织中是否存在idh1 r132h突变型基因。
8.可选地，所述对受检样本dna用核酸扩增反应液进行扩增之前，所述方法还包括：获取受检样本，所述受检样本为0.1~20mg脑胶质瘤组织；对所述受检样本进行匀浆前处理，得到充分裂解的受检样本；所述匀浆前处理包括但不限于手动破碎、研磨、离心、震荡；打开试剂盒盖及封口膜，加入10μl磁珠并振荡使之充分悬浮，加入200μl充分裂解的受检样本，利用移液器分吹打试剂混匀，盖上所述试剂盒盖。
9.可选地，所述对受检样本dna用核酸扩增反应液进行扩增，包括：对核酸检测分析仪设置运行参数，利用所述核酸检测分析仪的热循环部件对所述受检样本dna进行rna逆转录、变性、退火及延伸循环扩增。
10.可选地，所述对所述pcr扩增产物进行分析，包括：利用所述核酸检测分析仪的光电部件实时采集所述受检样本dna在扩增过程中产生的荧光信号，并对所述荧光信号进行实时存储和/或扩增曲线绘制。
11.依据本发明第三方面，提出了一种采用本发明第一方面所述试剂盒的扩增方法，
包括以下步骤：预变性由1次循环构成，其条件为：温度为95℃，时间为1~5min；pcr扩增由35~40次循环构成，其条件为：变性：温度为95℃，时间为10~30s；退火：温度为55-60℃，时间为10~30s。
12.依据本发明第四方面，提出了本发明第一方面所述试剂盒或本发明第二方面所述检测方法在检测肿瘤组织中的idh1 r132h突变型基因中的应用。
13.本发明提供的一种pcr基因检测试剂盒及其检测方法、扩增方法、应用，通过在试剂盒中设置用于检测肿瘤组织中的idh1 r132h突变型基因的外引物对、内引物对、探针和反应液，实现整个idh1 r132h突变型基因检测的工序，包括肿瘤组织裂、核酸提取、核酸纯化、dna扩增、荧光检测的过程。且不依赖传统pcr的各种大量仪器设备，还能避免污染和人工操作误差，显著提升了检测精度和效率。
14.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
15.根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
16.通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：图1示出了本发明实施例提供的受检体呈idh1 r132h阴性的扩增曲线对比图；图2示出了本发明实施例提供的受检体呈idh1 r132h阳性的扩增曲线对比图。
具体实施方式
17.下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
18.本发明提供了一种pcr基因检测试剂盒，试剂盒包括外引物对、内引物对、探针和反应液，所述试剂盒用于检测肿瘤组织中的idh1 r132h突变型基因。
19.其中，外引物对为检测idh1 r132h突变型基因的引物；内引物对为gapdh内参引物；探针包括idh1 r132h突变型基因探针、idh1野生型基因探针和gapdh内参基因探针；反应液包括idh1野生基因型、idh1 r132h突变基因型以及gapdh内参基因的核酸扩增反应液。
20.本发明提供的pcr基因检测试剂盒包括顶部带铝箔密封的加样口，以及加样后可单向封闭的卡盒盖，一旦锁死则无法再行开启，可以避免后续污染和干扰，卡盒内分隔并以微流控方式进行检测工作液的混合和顺序裂解、清洗和pcr扩增反应，分隔小室间有自动化控制的可横向移动带有纵向通道的阻断柱，裂解区预存有裂解液，清洗区预存有缓冲液，反
应区设有含idh1 r132h突变特型基因探针、idh1野生型基因探针和gapdh内参引物探针三种荧光探针的三色三通道核酸扩增反应液。
21.下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及器材均为市售商品。
22.实施例检测试剂盒的使用步骤1：受检样本获取取受检者0.1~20mg的脑胶质瘤组织，优选地，取受检者1~5mg的脑胶质瘤组织；对所述受检样本进行匀浆前处理，可以通过手动破碎、研磨、离心、震荡等方式使受检样本充分裂解；优选地，利用geneready动物样本前处理试剂盒（kt01-200/kt01-400）和生物样品低温快速制备离心系统（bsh-cl2）进行匀浆前处理，处理参数为：温度0~10℃，震荡时间30~60s，循环数1cycles，转速5000~7000rpm离心2~4min；优选地，处理参数可设置为：温度8℃，震荡时间45s，循环数1cycles，转速6000rpm离心3min。此步骤可以实现肿瘤组织的裂解。
23.步骤2：核酸提取及纯化打开试剂盒的卡盖，再打开封口膜，加入10μ1的磁珠，并振荡使之充分悬浮。再加入200μ1经步骤1处理后的受检样本，用移液器分吹打试剂混匀，优选地，至少吹打15次，后盖紧盖试剂盒卡盖。此步骤利用磁珠法吸附裂解组织中的核酸，对受检样本dna进行提取和纯化。
24.步骤3：pcr扩增反应利用全自动核酸检测分析系统（lifeready 1000）与适配试剂配合使用，设定运行参数，通过热循环部件为受检样本dna在体外进行rna逆转录以及变性、退火、延伸循环扩增及熔解提供所需的温度环境。
25.进行pcr扩增反应时，pcr扩增程序可以包括以下步骤：预变性由1次循环构成，参数为：温度为95℃，时间为1~5min；pcr扩增由35~40次循环构成，参数：变性：温度为95℃，时间为10~30s；退火：温度为55-60℃，时间为10~30s。
26.优选地，本发明实施例中的pcr扩增程序见下表：
利用如上方法对受检样本dna用核酸扩增反应液进行扩增，得到pcr扩增产物；其中，pcr扩增产物包括荧光标记的idh1野生型基因、gapdh内参基因和/或idh1 r132h突变型基因。
27.步骤4：结果分析利用全自动核酸检测分析系统（lifeready 1000）的光电部件实时转换受检样本dna在扩增过程中产生的荧光信号，应用软件对荧光信号进行采集、存储和分析处理，用于对样本中特定靶基因或核酸序列进行扩增和分析，也可利用应用软件根据荧光信号进行扩增曲线的绘制，并自动输出检测结果。不同的荧光信号对应有不同的pcr扩增产物，根据扩增曲线可以判断肿瘤组织中是否存在idh1 r132h突变型基因。
28.本发明实施例中，荧光标记设置见下表：荧光通道标记对象famidh1野生型基因roxidh1r132h突变型基因cy5内参基因如图1所示，为本发明实施例提供的受检体呈idh1 r132h阴性（即受检体肿瘤组织内不存在idh1 r132h突变型基因）时的三种基因的扩增曲线对比图，图2所示，为受检体呈idh1 r132h阳性（即受检体肿瘤组织内存在idh1 r132h突变型基因）时的三种基因的扩增曲线对比图。
29.如图1~2所示的扩增曲线对比图，可以显示出idh1野生型基因(fam)、idh1 r132h突变型基因(rox)以及内参基因(cy5)的检测结果。
30.idh1野生型基因(fam)的检测结果应呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台期的s曲线），认为idh1野生型基因(fam)是可正常检测的。
31.内参基因(cy5)检测结果应呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台期的s曲线），表明试剂盒内试剂有效，若未能检测到idh1野生型基因(fam)，则样本需要重新取样后检测。
32.当idh1 r132h突变型基因(rox)的检测结果应呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台期的s曲线），认为肿瘤组织内存在idh1 r132h突变型基因，呈idh1 r132h阳性；当未能检测到idh1 r132h突变型基因(rox)，认为肿瘤组织内不存在idh1 r132h突变型基因，呈idh1 r132h阴性。
33.一般情况下，根据ct值确定基因检测的灵敏度。在扩增反应过程中，根据荧光信号可以绘制出扩增曲线，设置一条水平阈值线，将水平阈值线移动至扩增曲线的拐点处，两线交叉处的循化数即为ct值。可以理解的是，当ct值越小时，对基因检测的灵敏度越高。
34.本发明实施例提供了三组引物/探针配置，如下表所示：参照组1：
参照组2：参照组3：
根据上述优选实施例中阐述的步骤进行了实验，各参照组的ct值检测结果如下表：结果显示：对比参照组1-3，参照组1的引物/探针组合的检测敏感性和特异性最优。
35.本发明通过将idh1 r132h突变型基因pcr检测的全过程进行自动化实现，利用基于多腔室微流控标准化试剂盒，将肿瘤组织裂解、核酸提取、核酸纯化、dna扩增、荧光pcr检测全流程进行自动化和封闭化整合，实现床旁快速基因检测，床旁pcr仪器和操作在床旁完成，无需专业人员，普通医务工作者即可完成加样，后续检测自动化完成，整个检测过程小于1小时，并自动进行结果判读和报告输出，避免了污染和人工操作误差，大大提升了检测精度和效率。
36.综上，本发明提供的检测检测肿瘤组织中的idh1 r132h突变型基因的试剂盒具有较高的灵敏度及特异性，是检测人类idh1 r132h基因突变的一种理想选择。
37.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行改进、修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。