一种重组猫干扰素融合蛋白及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及由猫干扰素feifnω重组蛋白及其制备方法。


背景技术：

2.干扰素(interferon，ifn)是机体在感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应从而产生的糖蛋白，干扰素在抗病毒复制活性上具有突出优势，可以增强自然杀伤细胞(nk细胞)、巨噬细胞和t淋巴细胞的活性，调节宿主免疫功能，发挥其抗病毒作用。根据产生干扰素的来源不同、理化性质不同、生物活性不同以及识别受体不同，ifn分为ⅰ、ⅱ和ⅲ型。ⅰ型干扰素还可分为ifn
‑
α、ifn
‑
β和ifn
‑
ω，ⅰ型干扰素抗病毒活性较强。现有猫用干扰素ω型属于ⅰ型干扰素，具有抗病毒和免疫调节活性，但在临床中存在半衰期短、体内易降解等难题，研制安全长效的猫ifn
‑
ω制剂具有重大意义。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种重组猫干扰素融合蛋白，包含猫干扰素feifnω蛋白突变体，所述猫干扰素feifnω蛋白突变体是将seq id no：1所示的氨基酸序列的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的蛋白。分别对于野生型和突变蛋白做柔性分析,如果突变区域蛋白柔性提升，则将该区域的一个或几个氨基酸作为突变位点，突变为极性氨基酸。
4.所述极性氨基酸具有亲水性，提高蛋白等电点和稳定性，通过本发明通过分析推断维持feifnω蛋白三维结构的关键位点，并选择非关键位点进行突变，以破坏天然feifnω蛋白的二硫键，同时保证制备得到的feifnω突变体蛋白维持蛋白天然的三维构构象，维持了蛋白的生物学功能，并且所获得的突变在保存过程中不易产生沉淀。
5.优选的是，突变方式包括将seq id no：1所示的氨基酸序列的第44位氨基酸谷氨酸突变为极性氨基酸。
6.上述任一项优选的是，所述极性氨基酸包括精氨酸或组氨酸的至少一种。
7.上述任一项优选的是，feifnω突变体蛋白的氨基酸序列如seq id no：17所示。
8.上述任一项优选的是，所述重组猫干扰素融合蛋白还包括蓖麻毒素b链。
9.上述任一项优选的是，所述蓖麻毒素b链蛋白为截短的蓖麻毒素b链蛋白，所述截短的蓖麻毒素b链蛋白的氨基酸序列为seq id no：2所示氨基酸序列中的第n位至m位氨基酸，其中n＝1，2，3或4，m≥134。
10.蓖麻毒素b链(ricin toxin，rtb)没有毒性且具有增强机体免疫反应的功能。本发明进一步优选的将猫ifnω与rtbd1截短肽组成融合蛋白获得长效猫干扰素，可增强猫干扰素抗病毒活性，提高干扰素在机体血液中蛋白稳定性，进而提高干扰素于机体内药物半衰期。优选的，所述蓖麻毒素b链蛋白的氨基酸序列包括seq id no：2所示的氨基酸序列，优选的，使用截短的蓖麻毒素b链蛋白，截短方式包括将seq id no：2所示的氨基酸序列第1位氨基酸敲除、第1、2位氨基酸敲除、第1至3位氨基酸敲除；和/或将seq id no：2所示的氨基酸
序列第135至263位氨基酸序列敲除、第136至263位氨基酸序列敲除、第137至263位氨基酸序列敲除、第138至263位氨基酸序列敲除、第139至263位氨基酸序列敲除、第140至263位氨基酸序列敲除、
……
、第260至263位氨基酸序列敲除、第261至263位氨基酸序列敲除、第262至263位氨基酸序列敲除、第263位氨基酸序列敲除。本发明所优选的蓖麻毒素b链截短肽(即截短的蓖麻毒素b链)相对于全长rtb蛋白减小蛋白分子大小，增加在体内组织的渗透率。
11.上述一项优选的是，截短的蓖麻毒素b链(rtbd1)的氨基酸序列如seq id no：18所示。
12.上述任一项优选的是，所述融合蛋白包括如seq id no：3所示的氨基酸序列。
13.本发明还提供了一种含有所述基因的重组载体，包括上述任一项所述的融合蛋白的编码序列。
14.本发明还提供了一种含有所述重组载体的基因工程菌，将所述的重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得所述基因工程菌。
15.本发明还提供了一种制备所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：步骤一、mfeifnω/rtbd1融合基因克隆载体构建，所述mfeifnω/rtbd1融合基因为如seq id no：4所示的核苷酸序列；步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；步骤三、重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白表达；步骤四、融合蛋白纯化与复性。
16.本发明还提供了所述的融合蛋白在猫抗病毒药物中的应用。
17.本发明一个优选的实施方式中，所述重组融合蛋白由猫干扰素ω与蓖麻毒素b链截短肽经柔性linker连接而形成。猫干扰素ω优选为feifnω蛋白突变体，优选的将seq id no：1所示的氨基酸序列的第44位氨基酸谷氨酸突变为精氨酸或组氨酸。蓖麻毒素b链截短肽优选为rtbd1，其氨基酸序列如seq id no：18所示，所得到含有feifnω蛋白突变体和rtbd1的的重组融合蛋白命名为mfeifnω/rtbd1。
18.进一步优选的是，所述柔性linker为(gly4ser)3连接肽。
19.优选的一种猫干扰素重组融合蛋白的制备方法，主要包括以下步骤：
20.步骤一、mfeifnω/rtbd1融合基因克隆载体构建；
21.步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；
22.步骤三、重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白表达；
23.步骤四、融合蛋白纯化与复性。
24.作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：
25.(1)生物信息学分析feifnω潜在突变位点：通过在线公开数据库对猫干扰素ω与猫i型干扰素受体进行同源建模，使用z
‑
dock获得分子对接结构模型，对i型干扰素全长序列进行丙氨酸扫描突变，分析突变前后干扰素与受体结合力变化，筛选获得潜在的突变位点(突变位点的选择原则为：预测评估突变前后ifn与ifn受体间结合力的变化，推算蛋白三维结构维持的关键位点，再将众多非关键位点作为突变位点的候选进行不同天然氨基酸的定点突变，选择最终突变结果中结合力较高的位点与氨基酸)；
26.(2)feifnω突变基因克隆载体构建：设计猫ifnω定点突变引物(猫ifnω定点突变引物包括以下名称以及序列所示的核苷酸序列：f：seq id no：5；r：seq id no：6；pmf:seq id no：7；pmr:seq id no：8)，以实验室构建的pmd18t
‑
feifnω为模板，将猫ifnω序列
中第44位氨基酸谷氨酸突变为精氨酸，增加猫ifnω与1型干扰素受体的结合能力以增强其抗病毒活性，并将突变后的序列命名为mfeifnω。将突变后的mfeifnω连接至pmd18t载体，将测序正确的产物命名为：pmd18t
‑
mfeifnω质粒；
27.(3)rtb截短基因克隆载体构建：设计rtbd1截短引物(rtbd1截短引物包括以下名称以及序列所示的核苷酸序列：rtbd1f：seq id no：9和rtbd1r：seq id no：10)，以实验室构建的pmd18t
‑
rtb为模板，将全长rtb序列中调取第10至402位核苷酸序列，对应rtb氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸，调取基因命名为rtbd1。将调取基因连接至pmd18t克隆载体，测序正确的产物命名为pmd18t
‑
rtbd1质粒；
28.(4)mfeifnω2/rtbd1融合基因克隆载体构建：设计含有(g4s)3linker基因的重叠pcr引物(重叠引物包括以下名称以及序列所示的核苷酸序列：f：seq id no：11；over
‑
lap pcr f：seq id no：12；over
‑
lap pcr r：seq id no：13；r：seq id no：14)，以构建正确的上述克隆质粒pmd18t
‑
mfeifnω与pmd18t
‑
rtbd1为模板，扩增获得以5
’‑
mfeifnω
‑
linker
‑
rtbd1
‑3’
为正确构成的融合基因，命名为mfeifnω/rtbd1。将融合基因连接至pmd18t载体，测序正确的产物命名为pmd18t
‑
mfeifnω/rtbd1质粒，以便下游基因工程操作。
29.作为优选的实施方式，步骤二具体包括以下步骤：
30.分别对测序正确的pmd18t
‑
mfeifnω/rtbd1质粒和pet28a载体进行双酶切，反应体系及条件见下表，将双酶切产物进行胶回收；利用t4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件见下表；
[0031][0032]
将上述连接产物转化至trans10感受态细胞；转化后涂布至终浓度为100μg/ml kan 抗性的lb固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行pcr；将pcr鉴定正确的阳性质粒进行测序分析。
[0033]
作为优选的实施方式，步骤三具体包括以下步骤：
[0034]
将测序正确的阳性菌bl21(de3)/pet28a
‑
mfeifnω/rtbd1按1:100v:v的比例接种于5ml含浓度为100μg/ml卡那霉素(kanamycin，kan)的lb培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6时，再按1:100v:v的比例转接至500ml同样的lb培养基中，并补加kan至终浓度为100μg/ml，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6；诱导组添加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀。
[0035]
作为优选的实施方式，步骤四具体包括以下步骤：
[0036]
(1)离子交换层析；
[0037]
(2)金属鳌合层析；
[0038]
(3)rmfeifnω/rtbd1蛋白复性。
[0039]
作为优选的实施方式，步骤(1)具体包括以下步骤：
[0040]
使用蛋白纯化a液平衡q柱(强离子交换柱)，将rmfeifnω/rtbd1包涵体溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/l以进行下一步金属鳌合层析。
[0041]
作为优选的实施方式，步骤(2)具体包括以下步骤：
[0042]
使用蛋白纯化b液对装载ni2 chelating sepharose进行平衡；将离子交换层析纯化的rmfeifnω/rtbd1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化b液和蛋白纯化c液进行混合(蛋白纯化系统中梯度混合模块，为akta蛋白纯化系统中模块，仪器厂商为美国通用公司，型号为akta explorer。)，分别使用终浓度为50mmol/l与250mmol/l的咪唑对chelating sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液；将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％sds
‑
page分析。
[0043]
作为优选的实施方式，步骤(3)具体包括以下步骤：
[0044]
将经两步纯化的rmfeifnω/rtbd1蛋白溶液使用蛋白复性a液进行稀释，稀释至rmfeifnω/rtbd1浓度为0.1mg/ml，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性b液；调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与b液进液速度保持一致；蛋白复性过程于4℃进行，蛋白复性b液流尽后，通入蛋白复性c液去除复性过程中残留的蔗糖及甘油成分，并将rmfeifnω/rtbd1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1
‑
1.5mg/ml，得到重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白。
[0045]
本发明的一种猫干扰素重组融合蛋白能够应用在制备抗病毒药物中。
[0046]
本发明的有益效果是：本发明的一种猫干扰素重组融合蛋白，由猫干扰素ω与蓖麻毒素b链截短肽经柔性linker连接而形成，其中，柔性linker选用(gly4ser)3连接肽。本发明的一种猫干扰素重组融合蛋白比普通猫干扰素ω半衰期长、生物学活性高，延长了半衰期，提高了生物活性，降低了干扰素制剂的制备成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。
附图说明
[0047]
图1本发明优选实施例2中的突变的猫干扰素ω与野生型猫干扰素ω三维结构对比图
具体实施方式
[0048]
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
[0049]
实施例1重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白的制备
[0050]
1、mfeifnω/rtbd1融合基因克隆载体构建
[0051]
(1)生物信息学分析feifnω潜在突变位点：通过在线公开数据库对猫干扰素ω与猫i型干扰素受体进行同源建模，使用z
‑
dock获得分子对接结构模型，对i型干扰素全长序列进行丙氨酸扫描突变，分析突变前后干扰素与受体结合力变化，筛选获得潜在的突变位点；
[0052]
(2)feifnω突变基因克隆载体构建：设计猫ifnω定点突变引物，以实验室构建的pmd18t
‑
feifnω(将seq id no：15所示的feifnω核苷酸序列构建于pmd18t属于本领域的常规操作，在此不进行赘述)为模板，将猫ifnω序列中第44位氨基酸谷氨酸突变为精氨酸，增加猫ifnω与1型干扰素受体的结合能力以增强其抗病毒活性，并将突变后的序列命名为mfeifnω。将突变后的mfeifnω连接至pmd18t载体，将测序正确的产物命名为：pmd18t
‑
mfeifnω质粒；
[0053]
(3)rtb截短基因克隆载体构建：设计rtbd1截短引物，以实验室构建的pmd18t
‑
rtb为模板(将seq id no：16所示的全长rtb的核苷酸序列构建于pmd18t属于本领域的常规操作，在此不进行赘述)，从seq id no：16所示的全长rtb序列中调取第10至402位核苷酸序列，对应seq id no：2所示的全长rtb氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸，调取基因命名为rtbd1。将调取基因连接至pmd18t克隆载体，测序正确的产物命名为pmd18t
‑
rtbd1质粒；
[0054]
(4)mfeifnω2/rtbd1融合基因克隆载体构建：设计含有(g4s)3linker基因的重叠pcr引物，以构建正确的上述克隆质粒pmd18t
‑
mfeifnω与pmd18t
‑
rtbd1为模板，扩增获得以5
’‑
mfeifnω
‑
linker
‑
rtbd1
‑3’
为正确构成的融合基因，命名为mfeifnω/rtbd1。将融合基因连接至pmd18t载体，测序正确的产物命名为pmd18t
‑
mfeifnω/rtbd1质粒，以便下游基因工程操作。
[0055]
2、大肠杆菌重组表达载体构建
[0056]
分别对上述测序正确的pmd18t
‑
mfeifnω/rtbd1质粒和pet28a载体进行双酶切，反应体系及条件如表1所示，将双酶切产物进行胶回收。利用t4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件如表2所示。
[0057]
表1重组质粒双酶切体系
[0058][0059][0060]
表2重组质粒连接体系
[0061][0062]
将上述连接产物转化至trans10感受态细胞。转化后涂布至终浓度为100μg/ml kan 抗性的lb固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行pcr。将pcr鉴定正确的阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序分析。
[0063]
3、重组融合蛋白表达
[0064]
将上述测序正确的阳性菌bl21(de3)/pet28a
‑
mfeifnω/rtbd1按1:100v/v的比例接种于5ml含浓度为100μg/ml kan的lb培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500ml同样的lb培养基中，并补加kan至终浓度为100μg/ml，37℃下、180rpm恒温振荡培养至od600＝0.6；诱导组添加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀。
[0065]
4、融合蛋白纯化与复性
[0066]
使用两步纯化法将菌体沉淀rmfeifnω/rtbd1进行纯化。其纯化方法以先进行离子交换层析、后进行金属鳌合层析的顺序进行，具体操作步骤如下：
[0067]
(1)离子交换层析：使用蛋白纯化a液(50mmol/l pb，8mol/l urea，ph 6.0)平衡q柱，将重组mfeifnω/rtbd1包涵体以蛋白纯化a液变性溶解并将溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/l以进行下一步金属鳌合层析。
[0068]
(2)金属鳌合层析：使用蛋白纯化b液(50mmol/l pb，8mol/l urea，0.5mol/l nacl ph 6.0)对装载ni2 chelating sepharose进行平衡。将离子交换层析纯化的重组mfeifnω/rtbd1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化b液和蛋白纯化c液(50mmol/l tris，8mol/l urea，0.5mol/l nacl，500mmol/l imidazole ph 8.5)进行混合，分别使用终浓度为50mmol/l与250mmol/l的咪唑对chelating sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液。将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％sds
‑
page分析。
[0069]
(3)重组mfeifnω/rtbd1蛋白复性：将经两步纯化的重组mfeifnω/rtbd1蛋白溶液使用蛋白复性a液(50mmol/l tris，8mol/l urea，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，5mmol/l dtt，ph 8.5)进行稀释，稀释至重组mfeifnω/rtbd1浓度为0.1mg/ml，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性b液(50mmol/l tris，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，ph 8.5)。调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与b液进液速度保持一致。蛋白复性过程于4℃进行，蛋白复性b液流尽后，通入蛋白复性c液(50mmol/l tris，ph 8.5)去除复性过程中残留的蔗糖及甘油等成分，并将重组mfeifnω/rtbd1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1
‑
1.5mg/ml，得到重组
mfeifnω/rtbd1融合蛋白。
[0070]
实施例2feifnω突变蛋白三维结构验证
[0071]
制备feifnω突变蛋白(氨基酸序列如seq id no：17所示)，feifnω突变蛋白的制备方法与实施例1中重组融合蛋白的制备方法相似。feifnω突变蛋白与野生型feifnω蛋白(氨基酸序列如seq id no：1所示)的三维构象一致，如图1所示。
[0072]
实施例3重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白的抗病毒检测
[0073]
1、体外抗猫水泡型口炎病毒活性检测
[0074]
将重组mfeifnω/rtbd1蛋白进行10倍比稀释分别处理猫肾细胞(f81)24h，然后以100
×
tcid
50
浓度的猫水泡性口炎病毒(vsv)感染，以抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素活性单位，检测结果表明，重组融合蛋白对vsv表现出极高的抑制活性，病毒效价达到3.12
×
108u/ml，重组融合蛋白浓度为1.3mg/ml，重组融合蛋白抗病毒比活为2.4
×
108u/mg。
[0075]
2、体外抗猫肠道冠状病毒活性检测
[0076]
在24孔细胞板上常规培养f81细胞，长成单层后，每孔加入100μl 2倍系列稀释的重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白，37℃处理24h，然后用100
×
tcid
50
的猫肠道冠状病毒攻毒，48h后观察f81细胞病变抑制结果，并作病毒空白对照，结果如下。
[0077]
表3重组mfeifnω/rtbd1抑制猫肠道冠状病毒致病变结果
[0078][0079]
实施例4重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白药代动力学研究
[0080]
对重组mfeifnω/rtbd1进行半衰期的测定，测定方法采用细胞病变抑制法测定重组mfeifnω/rtbd1的血药浓度与时间的关系；
[0081]
取12只spf试验猫，分2组(6只/组)：长效干扰素组(实施例1提供的重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白)与普通干扰素组(天然干扰素，其氨基酸序列如seq id no：1所示)，分别肌肉注射0.5ml 2mg/ml rmfeifnω/rtbd1与feifnω，注射后1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h静脉采血，血液静置4℃低温凝固后，3000r/min低温离心5min，获取上层血清；
[0082]
采用细胞病变抑制法测定不同时间点血清中重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白浓度，利用das药动学软件进行曲线拟合并计算相关参数；
[0083]
经测定各组的半衰期如下表4所示，rmfeifnω/rtbd1的半衰期远高于feifnω，本发明所提供的重组mfeifnω/rtbd1融合蛋白能够显著延长半衰期。
[0084]
表4药物半衰期测定结果
[0085]
[0086]
相比较于天然干扰素3.2h左右的半衰期，rmfeifnω/rtbd1半衰期的均有大幅度的提升，半衰期提高至3.06倍。
[0087]
本发明公开了一种猫干扰素重组融合蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。