一种麦芽糖浆的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种麦芽糖浆的制备方法及其应用，属于酶工程和发酵工程技术领域。


背景技术：

2.酪醇是一种具有特殊药理作用的酚类有机化合物。采用微生物发酵法生产酪醇主要以葡萄糖为原料，原料成本低且可再生，是一种有发展前景的酪醇制备方法。xu等构建了一株高产酪醇的重组大肠杆菌ymg5a*(xu w,yang c,xiay,et al.high
‑
level production of tyrosol with noninduced recombinant escherichia coli by metabolic engineering.agricultural and food chemistry,2020,68:4616
‑
4623)，文献中这株菌发酵产酪醇的最高产量为3.9g/l，发酵时间为48h。以后梁一晨等以上述ymg5a*菌株为基础进行了发酵条件的优化(
3.梁一晨，张海冰，张利华，等.高密度发酵大肠杆菌产酪醇[eb/ol].北京：中国科技论文在线,[2021
‑
03
‑
26].http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/202103
‑
299.)，该论文报道的酪醇发酵最高水平为5.06g/l，以上是已见报道的酪醇发酵的最高水平。上述报道的酪醇发酵水平较高，但发酵时间较长，均为48h。梁一晨等通过自然筛选结合基因工程改造获得了一株酪醇发酵时间大幅度缩短的重组大肠杆菌yc166(梁一晨、张锦雯、沈微、陈献忠、杨海泉、夏媛媛、陈磊.一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用.中国发明专利申请,202110598376.7)，虽然这株菌的酪醇产量只有3.3g/l，发酵水平明显不如上述报道，但由于宿主菌生长快，细胞密度高，因此重组菌的发酵周期大幅度缩短，发酵时间只有24h，因此也有一定的应用前景。
[0004]
重组菌yc166的宿主菌yec166是一株野生型大肠杆菌，其性能与实验室常用大肠杆菌有着显著的不同。前期研究发现，yc166用于酪醇发酵时，其最适碳源并不是葡萄糖，而是麦芽糖。当yc166以纯麦芽糖为碳源进行发酵时，酪醇产量可以达到4.2g/l以上，发酵周期依然是24h。由于纯麦芽糖价格很高，因此不适合用作发酵原料，而采用真菌淀粉酶、β
‑
淀粉酶等传统方法制备的麦芽糖浆可能由于纯度不足等原因，发酵得到的酪醇产量较低，应用价值不明显。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种麦芽糖浆的制备方法及其应用，其为重组大肠杆菌yc166发酵产酪醇提供一种针对性的碳源，以此进行的发酵可以获得较高的酪醇产量。
[0006]
本发明的技术方案，一种麦芽糖浆的制备方法，以酵母淀粉酶sfa水解玉米淀粉，得到以麦芽糖和麦芽三糖为主要成分的麦芽糖浆。
[0007]
进一步地，步骤为：以玉米淀粉为原料，加水配制质量浓度为8％
‑
9％的淀粉悬液，加热至78
‑
82℃使淀粉充分糊化，糊化后自然降温至40℃以下；在上述糊化淀粉液中按每克
淀粉加入0.055
‑
0.065u酶活单位的量准确加入酵母淀粉酶sfa，随后在39
‑
41℃反应11
‑
12h，即得到麦芽糖浆。
[0008]
进一步地，所述酵母淀粉酶sfa是用重组乳酸克鲁维酵母yw07发酵制备的重组淀粉酶。
[0009]
所述方法制备的麦芽糖浆的应用，将其应用于重组大肠杆菌发酵。
[0010]
进一步地，所述重组大肠杆菌具体为重组大肠杆菌yc166。
[0011]
进一步地，首先采用麦芽糖浆制备发酵罐发酵培养基；随后配置玉米淀粉悬液，在淀粉悬液中加入中温α
‑
淀粉酶以及真菌淀粉酶，制备得到真菌淀粉酶水解液，随后添加酵母粉制备得到补料培养基；采用发酵罐培养基对重组大肠杆菌yc166进行发酵，采用补料培养基进行补料，最终制备得到酪醇。
[0012]
进一步地，所述发酵罐发酵培养基的制备过程如下：按初始发酵液总体积40％
‑
60％加入麦芽糖浆，再依次加入十二水磷酸氢二钠16
‑
18g/l、磷酸二氢钾1
‑
2g/l、硫酸铵3
‑
5g/l、酵母粉5
‑
8g/l，七水硫酸镁1
‑
2g/l，搅拌溶解；加水至折合初始淀粉量为35
‑
45g/l；110
‑
120℃灭菌10
‑
20min，即得到发酵罐发酵培养基。
[0013]
进一步地，所述真菌淀粉酶水解液的制备过程如下：首先配制质量浓度为40％
‑
60％的淀粉悬液，按每克淀粉0.4
‑
0.6u的量加入中温α
‑
淀粉酶，在74
‑
76℃水浴锅中加热至淀粉完全液化；降温至50℃，准确的按每克淀粉0.12
‑
0.13u的量加入真菌淀粉酶，严格控制反应时间为3.3
‑
3.4h，，获得真菌淀粉酶水解液。
[0014]
进一步地，在真菌淀粉酶水解液中添加浓度为180
‑
220g/l的酵母粉，得到补料培养基。
[0015]
进一步地，所述发酵过程具体为：在发酵罐中加入发酵罐发酵培养基。以lb液体培养基摇瓶培养重组大肠杆菌yc166，30℃培养24h，再按1％
‑
2％的接种量接种新的lb液体培养基继续培养2
‑
3h，获得种子培养液；将上述种子培养液按10％的接种量接种到发酵罐的初始培养基中进行发酵；发酵过程以氨水控制ph在6.5
±
0.5，间隔4h检测培养基残糖，当培养基残糖含量低于20g/l时补加补料培养基至总糖浓度在30
‑
40g/l之间，发酵制备得到酪醇。
[0016]
本发明的有益效果：本发明提供的大肠杆菌yc166发酵产酪醇的原料主要是玉米淀粉，价格相对低廉，获得的酪醇发酵水平较高，发酵周期短于已见报道，具有良好的工业化应用前景，具备产业化价值。
[0017]
生物材料样品保藏：产酪醇重组大肠杆菌yc166，已经在专利中公开(梁一晨、张锦雯、沈微、陈献忠、杨海泉、夏媛媛、陈磊.一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用.中国发明专利申请,202110598376.7)，该专利申请时菌株yc166已经进行了专利菌种保藏，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，菌株的分类命名为大肠杆菌yc166(escherichia coliyc166)，保藏日期2021年4月12日，保藏编号cctcc no：2021358。
[0018]
产酵母淀粉酶sfa的菌种乳酸克鲁维酵母yw07已经公开在文献中(郭玉婉,沈微,王一恬,樊游,王正祥.扣囊复膜孢酵母α
‑
淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质.工业微生物,2014,44(2):25
‑
29)。
附图说明
[0019]
图1以麦芽糖浆为原料的酪醇发酵进程。
具体实施方式
[0020]
以下实施例中用于液相检测的酪醇标样为sigma公司产品。所述淀粉均为玉米淀粉，为山东恒仁工贸有限公司产品。中温α
‑
淀粉酶(又称中温淀粉酶)和真菌淀粉酶均为南宁庞博生物工程有限公司产品。为保证酶作用的稳定性，使用前，一般是24h内需要对酶活进行了重新测定，方法同文献(姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002，北京：轻工业出版社)，按其中α
‑
淀粉酶测定方法分别在中温淀粉酶和酵母淀粉酶sfa的最适条件下进行。酶活定义为：一小时液化1g淀粉所需要的酶量为一个酶活单位，表述为1u)。糖化酶为夏盛生物科技有限公司产品(强效型powermix2.0)，使用时酶活力直接按产品标注使用。酵母粉即酵母浸粉，为青岛海博生物技术有限公司产品。其他试剂均购自国药集团化学试剂公司。
[0021]
实施例1麦芽糖浆的制备方法
[0022]
(1)取适量玉米淀粉，加普通自来水配制成质量浓度为8％的淀粉悬液。加热至80℃使淀粉充分糊化，糊化后自然降温至40℃以下。在上述糊化淀粉液中按每克淀粉加入0.06u酶活单位的量加入酵母淀粉酶sfa；在40℃反应11
‑
12h，得到麦芽糖浆；
[0023]
所述酵母淀粉酶sfa是用重组乳酸克鲁维酵母yw07发酵制备的重组淀粉酶。重组菌乳酸克鲁维酵母yw07及以此为菌种发酵得到重组酶sfa的方法已经公开在文献中。(郭玉婉,沈微,王一恬,樊游,王正祥.扣囊复膜孢酵母α
‑
淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质.工业微生物,2014,44(2):25
‑
29；郭玉婉.酵母α
‑
淀粉酶：基因克隆、表达及其应用于麦芽三糖的制备.硕士学位论文,2014,无锡,江南大学)。具体操作时一般按文献(郭玉婉.酵母α
‑
淀粉酶：基因克隆、表达及其应用于麦芽三糖的制备.硕士学位论文,2014,无锡,江南大学)中的“3.1.6重组酵母上罐发酵实验”章节中介绍的yw07菌株的优化后的5l发酵罐发酵方法进行发酵，发酵液离心除去菌体后可以直接用于淀粉的水解。用其他方法发酵获得的sfa发酵液酶活可能稍低但只要针对每克淀粉使用的酶的活力相当，则水解效果基本一样。使用经过浓缩或纯化的sfa也有同样的效果。
[0024]
在糖浆制备时需要严格按照条件进行，酶活的增减或酶解时间的变化都能导致最终发酵获得的酪醇大幅度下降。例如按照上述文献，或另一篇相关文献(沈微,林丽珍,黄雯雯,郭玉婉,陈献忠,樊游,王正祥.一种酸性真菌α
‑
淀粉酶的异源表达与重组酶性质)所公布的条件用sfa进行淀粉或糊精的水解得到的水解液不但会导致发酵终点酪醇产量下降而且发酵时间也会显著延长。
[0025]
实施例2补料用真菌淀粉酶水解液的制备及补料培养基的制备
[0026]
首先配制浓度为50％的玉米淀粉悬液，按每克淀粉0.5u的量加入中温α
‑
淀粉酶，在75℃水浴锅中加热至淀粉完全液化，淀粉液化后要迅速在电炉或微波炉中加热已经液化的淀粉液至95℃以上并维持5min。降温至50℃，准确的按每克淀粉0.12
‑
0.13u的量加入真菌淀粉酶，严格控制反应时间为3.3
‑
3.4h，，反应4h，获得真菌淀粉酶水解液，水解完成后迅速加热水解液至90℃维持5min。在上述水解液中添加酵母粉至浓度为200g/l即获得补料培养基。
[0027]
这一步骤同样必须按照上述方法严格控制淀粉水解程度，中温淀粉酶液化或真菌
淀粉酶水解程度不足或过度均会导致最终发酵酪醇产量的显著下降。
[0028]
真菌淀粉酶水解液本质上也是一种以麦芽糖或麦芽寡糖为主要成分的麦芽糖浆，但具体成分与上述sfa水解液有很大不同，用真菌淀粉酶水解液替代实施例1得到的麦芽糖浆制备发酵液初始培养基则发酵得到的酪醇产量很低，一般在3g/l以下。为便于叙述本发明将sfa在特定条件下水解玉米淀粉得到的水解液称为麦芽糖浆，而淀粉被中温淀粉酶液化后进一步用真菌淀粉酶水解得到的淀粉水解产物称为真菌淀粉酶水解液。
[0029]
实施例3酪醇的5l发酵罐发酵
[0030]
本实施例中使用的检测方法如下：
[0031]
细胞浓度的检测过程如下：紫外分光光度计在600nm处检测细胞密度od600；需要检测细胞干重是按以下方法进行：取1ml待测菌液，12000r/min离心10min，弃上清，去离子水重复洗涤3次后烘箱烘干至恒重；称重，根据前期研究结果yc166细胞干重dcw(y)与od600(x)的比值为：0.382:1。
[0032]
hplc法检测发酵液中酪醇含量：
[0033]
样品处理：发酵液离心除去细胞后在100℃中加热10min，再离心收集上清，水系微孔滤膜过滤。
[0034]
液相条件：以1ml/min的80％的0.1％甲酸和20％纯甲醇作为流动相；色谱柱为博纳艾杰尔c18色谱柱(4.6
×
250mm，孔径为5μm)；柱温30℃；检测波长为276nm紫外检测器，进样量为10μl。
[0035]
标曲测定：通过标样倍比稀释，通过上述条件进行检测，以酪醇浓度为横坐标，酪醇标品的hplc峰面积为纵坐标，测定得到酪醇浓量(g
·
l
‑
1)标准曲线为：y＝7054x
‑
564.5(r2＝0.9998)。
[0036]
hplc的检测仪器为：高效液相色谱安捷伦，型号为1260hplc。
[0037]
发酵液中残糖的检测方法
[0038]
发酵液取出后8000r/min离心5min，取上清液，一般是每毫升发酵液加入10u的糖化酶，混合后在60℃反应20min，反应液按常规的dns法检测还原糖总量作为发酵液残糖量。
[0039]
重组大肠杆菌yc166的发酵罐发酵：将重组大肠杆菌yc166按如下步骤进行5l发酵罐发酵：
[0040]
(1)初始培养基的配制：在5l大烧杯中加入上述实施例1中制备的麦芽糖浆，一般是1.5l，再依次加入：十二水磷酸氢二钠17.1g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、硫酸铵4g/l、酵母粉6g/l，七水硫酸镁1.2g/l，搅拌溶解。加水至预定体积(一般是3l)。进行发酵实验时，一般取2.5l于5l发酵罐中，115℃灭菌15min。即得到发酵罐初始培养基。
[0041]
(2)菌种的准备及接种：以lb液体培养基摇瓶培养重组大肠杆菌yc166，30℃培养24h，再按1％的接种量接种新的lb液体培养基培养2
‑
3h获得种子培养液，这时的培养液菌浓大约为od
600
＝0.25左右；将上述种子培养液按10％的接种量接种到上一步骤获得的5l发酵罐的初始培养基中进行发酵；
[0042]
(3)酪醇发酵过程：发酵过程以氨水作为中和剂，恒定ph＝6.5
±
0.5；溶氧控制在20％～30％，主要以搅拌转速控制溶氧量，用通风量控制溶氧也有同样的效果，对发酵结果影响不明显。发酵温度全程30℃。
[0043]
发酵过程中每4h取样，取样时测定残糖浓度。根据残糖检测结果，当培养基总糖含
量低于20g/l时补加实施例2中介绍的补料培养基至总糖浓度在30
‑
40g/l。按照上述工艺，ycc166发酵产酪醇的最终产量为4.3g/l左右，发酵时间为20h。
[0044]
图1是一次比较典型的酪醇发酵过程，这次发酵达到终点的时间是20小时，酪醇产量是4.3g/l。多次试验均得到类似的结果，数据误差在5％以内。维持这一结果的最关键的影响因素是麦芽糖浆的制备，在制备前必须对酵母淀粉酶sfa的酶活进行严格的检测，以保障得到的糖浆的成分基本不变。
[0045]
在微生物发酵法制备酪醇的研究中，梁一晨等报道的以ymg5a*菌株为基础的发酵(梁一晨，张海冰，张利华，等.高密度发酵大肠杆菌产酪醇[eb/ol].北京：中国科技论文在线,[2021
‑
03
‑
26].http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/202103
‑
299.)，所获得的酪醇的发酵最高水平为5.06g/l，这是目前为止可见的最高水平的发酵。
[0046]
本发明建立的方法酪醇发酵水平为4.3g/l，虽然发酵水平不如上述报道，但发酵时间缩短为20h。与梁一晨等前期对菌种yc166研究相比，本专利获得的发酵水平显著提高，而发酵时间则由24h缩短为20h，进一步提高生产强度和设备利用率，并减少发酵过程染菌的风险。本发明所使用的原料是玉米淀粉，价格相对低廉。因此本发明的以yc166为菌种的酪醇发酵方法有一定的工业应用价值。