糖基转移酶OsUGT91C1突变体及其用途的制作方法

糖基转移酶osugt91c1突变体及其用途
技术领域
1.本发明属于酶学领域，具体涉及一种糖基转移酶osugt91c1突变体及其用途。


背景技术：

2.原产于南美的甜叶菊在当地作为天然甜味来源已有超过百年的历史。甜菊糖苷是从甜叶菊叶片中提取的高甜度、低热量天然甜味剂，以其健康、安全的特点，近年来逐渐成为一种取代蔗糖的首选天然甜味剂。糖尿病人可以食用甜菊糖苷，而且动物实验表明甜菊糖苷对糖尿病还有治疗的效果。根据mintel数据，在全球范围内，从2015年到2019年上市的含有甜菊糖苷的产品复合年增长率为15％。有数据显示，2019年全球食品饮料新品中，甜菊糖苷作为甜味剂的使用量已仅次于三氯蔗糖和安赛蜜。
3.甜菊糖苷具有相似的结构模式，即在通用的甜菊醇(steviol，cas 471
‑
80
‑
7)核心骨架 c13
‑
羟基(为了简化，在附图中也用r1代表)和(或)c19
‑
羧基(为了简化，在附图中也用r2代表)存在不同的葡萄糖基修饰(图1中a)。根据c13
‑
羟基和c19
‑
羧基的糖基组成和糖苷键的组合情况，可对甜菊糖苷分子进行命名。其中含量最多并得到商品化的有甜菊苷 (stevioside，cas 57817
‑
89
‑
7占比57％，用st表示)和甜菊糖苷a(rebaudioside a， cas 58543
‑
16
‑
1，含量可达甜菊糖苷的32％，用reb a表示)。二者都带有一定的后苦味，影响了甜菊糖苷的口感和市场的接受度。最近发现甜菊糖苷d(rebaudioside d，cas 63279
‑
13
‑
0，reb d代表)和m(rebaudioside m，cas 1220616
‑
44
‑
3，reb m代表)甜度是蔗糖的200
‑
300倍，口感非常接近于甜味标准品蔗糖，成为甜菊糖苷品质最好的组分，也是甜菊糖苷生产商研发的重点。
4.甜菊糖苷d和m在天然甜叶菊叶片中的含量低于1％，不能直接从天然种植的甜叶菊提取。常用的方法是通过酶促反应在生物体内(不一定是甜叶菊)或生物体外利用前体物质进行合成转化，或通过酶促反应对含量最丰富的甜菊苷(st)和甜菊糖苷a(reb a)或其他可利用的甜菊糖苷分子在其特定位置添加葡萄糖基，转化生成甜菊糖苷d和m(reb d 和reb m)。在甜菊糖苷d和m酶促转化过程中，一种水稻来源的糖基转移酶osugt91c1 (也可称为eugt11)，可在甜菊糖苷的c13
‑
羟基和c19
‑
羧基方向添加2号葡萄糖基(2号葡萄糖基是与1号葡萄糖基形成β(1
‑
2)糖苷键的葡萄糖基，1号葡萄糖基特指直接与c13
‑ꢀ
羟基或c19
‑
羧基形成β
‑
糖苷键的葡萄糖基)(图1中b，c，d)。糖基转移酶osugt91c1是甜菊糖苷d和m酶促转化的多步过程中最为关键的糖基转移酶，决定了能否最终生成甜菊糖苷d和m。
5.但发明人首次发现糖基转移酶osugt91c1在催化甜菊糖苷d、m转化过程中的特异性不好，除了添加2号葡萄糖基外(这是酶促转化生成甜菊糖苷d、m所需的反应，称为正常反应)，还存在明显的副反应，即在c13
‑
羟基方向或c19
‑
羧基方向添加6号葡萄糖基(或4 号葡萄糖基)，二者与1号葡萄糖基形成β(1
‑
6)糖苷键(或β(1
‑
4)糖苷键)(本发明后面提到的副反应均指添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的反应)(图1中b，c，d)。副反应将浪费酶催化资源和底物，形成明显的副产物，既影响了甜菊糖苷d和m的生成效率，还带来杂质，给获得高品质甜菊糖苷d、m纯品带来很大困难。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题为：如何解决糖基转移酶osugt91c1催化甜菊糖苷的c13
‑ꢀ
羟基和c19
‑
羧基方向添加2号葡萄糖基过程中存在副反应的问题。
7.基于发明人独立发现的糖基转移酶osugt91c1三维空间结构，理性优化糖基转移酶 osugt91c1原有氨基酸序列，发明人将第93位的组氨酸改为色氨酸(his93trp)，或将第 379位的苯丙氨酸改为丙氨酸(phe379ala)。通过上述两个氨基酸的改变，可得到两个新酶，在本专利中，命名为新酶1(his93trp)和新酶2(phe379ala)。通过大肠杆菌蛋白表达系统，纯化制备两个新酶，它们都可去除osugt91c1原始状态下会催化添加6号葡萄糖基 (或4号葡萄糖基)，形成β(1
‑
6)糖苷键(或β(1
‑
4)糖苷键)副反应的缺陷。其中新酶 1(his93trp)(第93位的组氨酸被改为色氨酸)不影响osugt91c1原始状态下催化正常酶促转化所需要的催化能力，即在甜菊糖苷的c13
‑
羟基或/和c19
‑
羧基方向添加2号葡萄糖基 (形成β(1
‑
2)糖苷键)的催化能力；新酶2(phe379ala)(第379位的苯丙氨酸被改为丙氨酸)对添加2号葡萄糖基的正常酶促反应可达2倍以上的增强作用。
8.进一步地的研究发现，在上述突变的基础上，删除或改变糖基转移酶osugt91c1前端 1
‑
14个氨基酸(mdsgysssyaaaag)均不影响突变后的酶性质。说明前端的14个氨基酸具有冗余性，可以完全去除或改变。
9.本发明的技术方案为：糖基转移酶osugt91c1突变体，其氨基酸序列为以下a、b、c、 d中的任一种：
10.a、seq id no.1所示，它是在糖基转移酶osugt91c1氨基酸的基础上将93位的his 突变为trp；
11.b、seq id no.2所示，它是在糖基转移酶osugt91c1氨基酸的基础上将379位的phe 突变为ala；
12.c、在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上任意删除或改变第1
‑
14位氨基酸；
13.d、在seq id no.2所示氨基酸序列的基础上任意删除或改变第1
‑
14位氨基酸。
14.编码上述所述糖基转移酶osugt91c1突变体的基因。
15.含有上述所述编码基因的表达载体。
16.携带上述所述表达载体的重组菌或细胞。
17.糖基转移酶osugt91c1突变体在甜菊糖苷d或m及其他甜菊糖苷分子的酶促合成或转化过程的用途。
18.进一步地，所述糖基转移酶osugt91c1突变体在甜菊糖苷d或m及其他甜菊糖苷分子的酶促合成或转化过程的用途，是指在甜菊糖苷的c13
‑
羟基或/和c19
‑
羧基方向添加2号葡萄糖基。所述2号葡萄糖基是与1号葡萄糖基形成β(1
‑
2)糖苷键的葡萄糖基，1号葡萄糖基特指直接与c13
‑
羟基或c19
‑
羧基形成β
‑
糖苷键的葡萄糖基。
19.本专利的副反应定义为，在甜菊醇或甜菊糖苷的c13
‑
羟基，c19
‑
羧基两个方向添加6 号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)，与1号葡萄糖基形成β(1
‑
6)糖苷键(或β(1
‑
4)糖苷键) 的副反应；本专利的正常反应的定义是在甜菊醇或甜菊糖苷的c13
‑
羟基，c19
‑
羧基两个方向添加2号葡萄糖基，与1号葡萄糖基形成β(1
‑
2)糖苷键的反应。
20.本发明的实施例，利用了液相色谱
‑
质谱联用验证了两个新酶不出现副反应；通过液相色谱
‑
质谱联用、荧光转化法等方法测定了两个新酶催化反应的米氏动力学参数，验证
了新酶1不明显影响添加2号葡萄糖基的正常催化能力；新酶2有超过两倍的增强加速作用。新酶可催化酶促转化，得到添加了2号葡萄糖基的正常产物(包括甜菊糖苷e(reb e)的一系列甜菊糖苷产物)，不含副产物，可用于甜菊糖苷d和m的进一步酶促转化。
21.除了可在大肠杆菌中表达、纯化、制备天然状态osugt91c1或本发明的两个新酶，还可在其他生物系统、非生物系统、细胞、非细胞(cell
‑
free)等其他表达体系中进行表达和制备；将这些消除了副反应的新酶，通过转基因或其他基因导入手段，引入生物体、非生物体、细胞、非细胞(cell
‑
free)进行甜菊糖苷的酶促转化，以及在酶、酶固定化等体外体系，用于在甜菊糖苷添加2号葡萄糖基的酶促转化，包括制备但不限于甜菊糖苷d和m的酶促转化过程，达到消除副反应的目的。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.本发明的糖基转移酶osugt91c1突变体去除了osugt91c1原始酶存在副反应的劣势，保留和原始酶相同或提高了催化相同正常反应的能力，即在甜菊糖苷底物c13
‑
羟基或(和) c
‑
19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应，可催化生成包括reb e(rebaudioside e，cas 63279
‑
14
‑
1)的一系列甜菊糖苷产物，用于甜菊糖苷d和m的酶促合成或酶促转化过程。在此基础上，利用糖基转移酶ugt76g1接力，继续在c13
‑
羟基或(和)c
‑
19羧基方向添加3号葡萄糖基，则可获得甜菊糖苷d和m(rebaudioside d，cas 63279
‑
13
‑
0和 rebaudioside m，cas 1220616
‑
44
‑
3)。
附图说明
24.图1与本专利相关的部分甜菊糖苷结构，结构的简化表示及osugt91c1酶促转化生成甜菊糖苷d和m过程中正常反应和副反应的示意图；
25.a部分甜菊糖苷的结构，包括甜菊醇、甜菊糖苷d和m的结构及结构的简化形式。甜菊醇用完整的化学结构表示，甜菊糖苷d和m用完整的化学结构和简化图两种方法表示，括号内为二者相比于蔗糖的甜度倍数。简化图中c13
‑
羟基(用r1简化表示)，c19
‑
羧基 (用r2简化表示)。葡萄糖基用六边形表示，每个葡萄糖的1
‑
羟基用黑点标注，每个葡萄糖中间的数字代表是几号葡萄糖基，同时也表示该葡萄糖基与1号葡萄糖基形成的糖苷键的类型，如2代表β(1
‑
2)糖苷键，3代表β(1
‑
3)糖苷键，4代表β(1
‑
4)糖苷键，6代表β(1
‑
6)糖苷键。
26.b osugt91c1在甜菊糖苷底物c13
‑
羟基(用r1简化表示)或(和)c19
‑
羧基(用r2 简化表示)两端催化添加2号葡萄糖基正常反应及添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的示意图。
27.c osugt91c1在甜菊糖苷底物c13
‑
羟基(用r1简化表示)催化添加2号葡萄糖基正常反应及添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的示意图。
28.d osugt91c1在甜菊糖苷底物c19
‑
羧基(用r2简化表示)催化添加2号葡萄糖基正常反应及添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的示意图。
29.图2新酶1(his93trp)、天然状态osugt91c1、新酶2(phe379ala)的sds
‑
page 分析；
30.a新酶1(his93trp)的sds
‑
page分析。m,marker；1，菌体裂解液沉淀；2，ni柱流穿样品；3
‑
7，ni柱洗脱蛋白样品；8，q柱上样前样品；9
‑
12，q柱洗脱蛋白样品；
31.b天然状态osugt91c1和新酶2(phe379ala)的sds
‑
page分析。m,marker；1，天然状态osugt91c1；2，q柱流穿样品；3
‑
7，q柱洗脱蛋白样品。两个图右侧箭头表示目的蛋白条带
的位置。
32.图3天然状态osugt91c1在底物stb和rebe添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的情况；
33.a,b利用lc
‑
ms检测osugt91c1在甜菊糖苷底物stb(a)及rebe(b)添加6号葡萄糖基的副反应。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.75mg/ml酶反应0小时作为对照，0.15mg/ml酶反应2小时和18小时，0.75mg/ml酶反应2小时和18小时，显示副反应产物随时间和酶量的增加而增多；a,b液相图下方分别为osugt91c1催化stb和rebe副反应的示意图。
34.图4天然状态osugt91c1、新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)在底物stb添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的对比；
35.天然状态的osugt91c1(a)、新酶1(his93trp)(b)、新酶2(phe379ala)(c)与底物stb反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.75mg/ml酶反应0小时作为对照，0.15mg/ml酶反应2小时和18小时，0.75mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1副反应产物随时间和酶量的增加而增多，而新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)无副反应产物的生成。d,天然状态osugt91c1催化stb的副反应示意图，e,新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)无副反应的进行。
36.图5天然状态osugt91c1、新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)催化在底物rubu的c13
‑
羟基(r1)和(或)c19
‑
羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基，形成β(1
‑
2)糖苷键正常酶促反应的对比；
37.天然状态的osugt91c1(a)、新酶1(his93trp)(b)、新酶2(phe379ala)(c)与rubu反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.75mg/ml酶反应0小时作为对照，0.15mg/ml酶反应2小时和18小时，0.75mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1在rubu的c13
‑
羟基(r1)和c19
‑
羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基的产物随时间和酶量的增加而增多，而新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)具有同样的酶促催化反应和能力。d,天然状态osugt91c1催化底物rubu的c13
‑
羟基(r1)和c19
‑
羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基，生成rebe的反应示意图，新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)可进行同样的正常目标催化反应，且不产生副产物。
38.图6天然状态osugt91c1、新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)催化在底物reba的c19
‑
羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，形成β(1
‑
2)糖苷键，生成rebd的正常酶促反应的对比；
39.天然状态的osugt91c1(a)、新酶1(his93trp)(b)、新酶2(phe379ala)(c)与reba反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.75mg/ml酶反应0小时作为对照，0.15mg/ml酶反应2小时和18小时，0.75mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1在reba的c19
‑
羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，生成产物rebd随时间和酶量的增加而增多，而新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)具有同样的酶促催化反应和能力。d,天然状态osugt91c1催化底物reba的c19
‑
羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，生成rebd的反应示意图，新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)可进行同样的正常目标催化反应，且不产生副产物。
40.表3天然状态osugt91c1、新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)催化在底物c13
‑
羟基(r1)和c19
‑
羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基(正常酶促反应)的动力学参数
41.图7利用新酶1和新酶2催化获得的甜菊糖苷底物reb e，进一步利用糖基转移酶 ugt76g1在c13
‑
羟基或(和)c
‑
19羧基方向继续添加3号葡萄糖基，获得甜菊糖苷d和 m；
42.a,以新酶1(his93trp)和新酶2(phe379ala)催化获得的甜菊糖苷底物reb e(不产生副产物)的基础上，再利用糖基转移酶ugt76g1转化形成reb d和reb m的反应示意图。方框显示两个新酶不发生副反应，只在c13
‑
羟基或(和)c
‑
19羧基方向正常添加2号葡萄糖基，形成甜菊糖苷e(reb e)；然后糖基转移酶ugt76g1接力，继续催化在c13
‑
羟基或 (和)c
‑
19羧基方向添加3号葡萄糖基，形成甜菊糖苷d和m(reb d和reb m)的过程。 b,利用新酶1(his93trp)和新酶2(phe379ala)催化获得的甜菊糖苷底物reb e(不产生副产物)，进一步利用糖基转移酶ugt76g1催化从reb e到reb d和reb m的转化过程。在液相图从上至下的反应条件依次为：加0.03mg/ml的糖基转移酶ugt76g1反应0小时作为对照，0.03mg/ml糖基转移酶ugt76g1反应2小时和18小时，0.15mg/ml糖基转移酶ugt76g1反应2小时和18小时。
43.图8新酶2(phe379ala)去除第1
‑
14位氨基酸后的截短体的sds
‑
page分析；
44.新酶2(phe379ala)和新酶2去除第1
‑
14位氨基酸后的截短体的sds
‑
page的比较分析。m,marker；1
‑
3，新酶2的ni柱洗脱样品；4，新酶2的截短体凝胶过滤层析上样前样品；5
‑
9，新酶2的截短体的凝胶过滤层析洗脱样品，根据新酶2及其截短体在sds
‑
page 上的位置，可明显看出新酶2的截短体比新酶2的分子量小。
45.图9天然状态osugt91c1、新酶2去除第1
‑
14位氨基酸后的截短体催化在底物rubu 的c13
‑
羟基(r1)和(或)c19
‑
羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基，形成β(1
‑
2)糖苷键正常酶促反应的对比；
46.天然状态的osugt91c1(a)、新酶2去除第1
‑
14位氨基酸后的截短体(b)与rubu反应的液相分析比较。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.25mg/ml酶反应0小时作为对照，0.05mg/ml酶反应2小时和18小时，0.25mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1在rubu的c13
‑
羟基(r1)和c19
‑
羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基的产物随时间和酶量的增加而增多，而新酶2截短体具有同样的酶促催化反应和能力。 c,天然状态osugt91c1和新酶2截短体可进行同样催化在底物rubu的c13
‑
羟基(r1)和 c19
‑
羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基的正常目标反应，生成reb e的反应示意图，进一步验证第1
‑
14位氨基酸的冗余性，可以完全去除或改变。
具体实施方式
47.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
48.一、天然状态osugt91c1蛋白表达载体的构建
49.1、获取osugt91c1的氨基酸序列(ncbi reference sequence:xp_015629141.1)，根据蛋白表达系统的要求对osugt91c1编码密码子进行优化和合成。发明人根据大肠杆菌的表达体系优化后的编码密码子如下。由于密码子的兼并性，密码子优化的选择可有多种。
50.为了防止通过替换osugt91c1的非重要氨基酸序列，达到规避本专利权利要求的目的，本专利认为只要翻译后的蛋白氨基酸序列和osugt91c1的氨基酸序列相同度在50％及以上，则认为属于osugt91c1。
51.不管是在osugt91c1的氨基酸序列还是空间结构上，改变同第93和379位氨基酸等效的位点或其他位点(由于氨基酸冗余性的原因，通过去除第1
‑
14位的一个或任意个氨基酸，导致第93和379位氨基酸不一定一直是第93和379位的编号)，达到消除osugt91c1 副反应的目的，都属于本专利的权利要求。
52.osugt91c1的氨基酸序列(加粗的氨基酸是本专利进行改动的氨基酸位点，划线部分是人为添加的氨基酸序列，其中le是为了方便连接进入大肠杆菌表达载体pet21b， hhhhhh(6个组氨酸标签)是为了方便后期的纯化)：
53.mdsgysssyaaaagmhvvicpwlafghllpcldlaqrlasrghrvsfvstprnisrlp pvrpalaplvafvalplprveglpdgaestndvphdrpdmvelhrrafdglaapfseflgt acadwvivdvfhhwaaaaalehkvpcammllgsahmiasiadrrleraetespaaagqg rpaaaptfevarmklirtkgssgmslaerfsltlsrsslvvgrscvefepetvpllstlrgkpi tflglmpplhegrredgedatvrwldaqpaksvvyvalgsevplgvekvhelalglelag trflwalrkptgvsdadllpagfeertrgrgvvatrwvpqmsilahaavgaflthcgwns tieglmfghplimlpifgdqgpnarlieaknaglqvarndgdgsfdregvaaairavaveee sskvfqakakklqeivadmacheryidgfiqqlrsykdlehhhhhh
54.osugt91c1密码子优化后的核苷酸序列(划线序列为上述人为添加氨基酸序列的编码区)：
55.atggatagcggttatagtagcagttatgccgcagccgccggcatgcatgttgtgattt gcccgtggctggcctttggtcatctgctgccgtgcttagacctggcccagcgtctggcc agccgtggtcaccgtgttagctttgtgagcaccccgcgtaatatcagccgtctgccgcc ggttcgtccggcattagccccgctggtggcatttgtggccttaccgctgccgcgtgttga gggtctgcctgatggcgccgaaagtaccaacgacgtgccgcatgaccgcccggatatgg tggagctgcatcgtcgcgcctttgatggtctggcagccccgtttagcgagtttctgggc acagcctgcgccgattgggtgatcgttgacgtgtttcatcactgggcagccgcagccgc cctggaacataaagttccgtgcgcaatgatgctgctgggtagcgcccacatgattgcca gcattgccgatcgtcgcctggaacgcgcagagaccgaaagcccggcagcagcaggtca aggtcgtcctgccgcagccccgacctttgaagtggcccgcatgaaactgatccgtacca aaggtagtagcggcatgagcctggccgaacgctttagcctgaccctgagccgcagtagc ctggtggttggtcgcagttgtgtggaattcgagccggaaacagtgccgctgctgagca ccctgcgcggcaaaccgatcacctttctgggcctgatgccgccgttacatgaaggccgt cgtgaagatggtgaagatgccacagtgcgttggctggatgcacagccggccaaaagcg ttgtgtacgttgccctgggtagcgaagttcctctgggtgtggaaaaggtgcacgaactg gcactgggtctggaactggccggtacccgcttcctgtgggccttacgtaaacctaccgg tgttagcgatgccgatctgctgccggcaggttttgaggaacgtacccgtggtcgcggtg ttgtggcaacacgctgggttccgcagatgagcattctggcccatgccgccgtgggtgcc tttctgacccattgtggctggaatagcaccatcgaaggcctgatgttcggccatcctctg atcatgctgcctatcttcggtgatcagggtccgaacgcacgcctgattgaagcaaagaa tgccggtctgcaggtggcacgtaacgatggcgacggtagcttcgatcgtgaaggcgttg ccgccgcaattcgcgccgttgcagttgaagaagagagcagcaaggtgttccaggccaa agccaaaaaactgcaggagatcgtggccgatatggcatgccatgagcgctacatcgatg gcttcatccagcagctgcgcagctataaagatctcgagcaccaccaccaccaccac
56.2、对合成得到的osugt91c1编码区用表1所列的引物进行扩增，扩增片段的5’和3’端将分别带上nde i和xho i的限制酶位点。
57.表1 pet21b
‑
osugt91c1的引物序列
[0058][0059][0060]
3、用nde i和xho i对pet21b表达载体和步骤2的osugt91c1编码区扩增片段进行双酶切，将osugt91c1编码区用t4连接酶连接进pet21b载体的nde i和xho i酶切位点之间，组成在大肠杆菌可表达糖基转移酶osugt91c1的表达载体pet21b
‑
osugt91c1。
[0061]
4、将连接产物全部转入100μl e.coli dh5α感受态细胞中，挑取平板上的阳性单克隆菌落接种于10ml的lb培养基中，200rpm 37℃培养12
‑
16小时后提取质粒，测序验证表达质粒的正确性，完成天然状态osugt91c1糖基转移酶表达载体的构建。
[0062]
二、为了消除添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应，改变两个氨基酸位点，构建新酶1(his93trp)和新酶2(phe379ala)的表达载体
[0063]
1、以天然状态pet21b
‑
osugt91c1为模板，设计两个新酶his93trp和phe379ala所使用的定点突变引物如表2。
[0064]
表2突变体引物序列如下：(下划线部分表示突变位点)
[0065][0066]
2、用ddh2o溶解表2的引物，稀释引物浓度为10μm。用两对突变引物分别以pet21b
‑
osugt91c1为模板进行pcr扩增，体系同为：dntp 4μl，5
×
ps buffer 10μl，上下游引物各2μl，模板1μl(约10ng)，pcr扩增酶primer star 0.5μl，剩余用ddh2o补齐至50μl。混匀后用pcr扩增，扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性30s，69℃ (新酶1(his93trp))退火30s或68℃(新酶2(phe379ala))退火30s，72℃延伸8 min，扩增20个循环，72℃再延伸10min，最后4℃保存。
[0067]
3、从上述扩增产物各取出10μl进行琼脂糖胶验证pcr的扩增效果，剩余的40μl体系里各加1μl dpni酶，37℃孵育1
‑
2小时后取10μl分别转入100μl e.coli dh5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激2min，再冰浴3min后加入新鲜lb 300μl，200rpm 37℃摇床孵育1小时后，分别取150μl均匀涂布于amp抗性的固体lb平板上，37℃静置培养过夜。
[0068]
4、挑取两个平板上的单克隆菌落接种于10ml的lb培养基中，200rpm 37℃培养12
‑ꢀ
16小时后提取质粒，dna测序验证两个突变位点his93trp和phe379ala的正确性，其氨基酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
[0069]
三、天然状态osugt91c1和新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)的诱导表达和纯化
[0070]
1、将对应的表达质粒转化至e.coli bl21(de3)表达菌株，第二天挑取单克隆接种于10 ml新鲜的lb培养基中，200rpm 37℃培养过夜后加入终浓度为8％的甘油保种，该菌种
可在
‑
80℃长期保存。
[0071]
2、挑取上一步保存的e.coli bl21(de3)甘油菌接种于含amp 50μg/ml的100ml新鲜 lb培养基中，200rpm 37℃过夜培养。第二天以1％的接种比例接种于含amp 50μg/ml的 1l新鲜lb培养基，180rpm 37℃培养至od600＝1.0后，菌液降温至16℃，添加终浓度为0.5mm的iptg，160rpm 16℃
–
20℃诱导表达18小时。
[0072]
3、完成诱导表达后，4000rpm离心15min弃上清，收集菌体。菌体用重悬缓冲液(20 mm tris
‑
hcl buffer ph 7.8,0.5m nacl,30mm imidazole)重悬后，用高压破碎仪在1000bar 压力下反复破碎3次。13500rpm 4℃离心60min，离心后的上清上样到nta
‑
ni柱，用上述重悬缓冲液洗去非特异性结合的杂蛋白，带组氨酸标签的目的蛋白可被洗脱缓冲液(20 mm tris
‑
hcl buffer ph 7.8,0.5m nacl,250mm imidazole)洗脱下来。洗脱下来的蛋白进一步置换到20mm hepes buffer ph 7.2,50mm nacl里，经液氮速冻后，可长期保存于
‑
80℃。上述步骤可纯化得到天然状态的osugt91c1、新酶1、新酶2，并通过sds
‑
page检测纯度(图2)。
[0073]
四、天然状态osugt91c1、新酶1(his93trp)和新酶2(phe379ala)的酶活性测定
[0074]
1、酶促产物分析，表明两个新酶已经消除了添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应
[0075]
(1)以osugt91c1的底物stb(steviolbioside，cas 41093
‑
60
‑
1)，reb e (rebaudioside e,cas 63279
‑
14
‑
1)为实施例，天然状态的osugt91c1可分别在底物stb、 reb e上催化添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应(图3)，而两个新酶1 (his93trp)，新酶2(phe379ala)不会发生上述副反应，不产生副产物。
[0076]
(2)副反应的实施例反应条件如下：在20℃
‑
40℃，200μl反应体系包括：1mmudp
‑
glucose,20mm tris
‑
hcl缓冲液ph 7.2，浓度分别为0.15mg/ml(1
×
)和0.75mg/ml(5
×
) 的酶样品(天然状态或者新酶1(his93trp)，新酶2(phe379ala))，0.3mm stb或reb e。通过加入酶样品启动反应，分别于0，2，18小时取样60μl，与等体积的正丁醇混合涡旋振荡，终止反应并萃取对应的酶促反应产物，室温17000rpm离心10min，室温静置1min，取上层正丁醇的萃取相50μl真空干燥后，用等体积的25％乙腈重悬后，利用hplc检测酶促产物。本实施例所列的反应条件不唯一，只要能使osugt91c1发生酶促反应，都可得到同样的结果。检测手段也不唯一，只要能区分每个酶促产物，可得到相同的检测结果。天然状态的osugt91c1催化副反应的底物不唯一，包括但不限于对以下甜菊糖苷底物发生副反应，stb(steviolbioside，cas 41093
‑
60
‑
1)，reb e(rebaudioside e，cas 63279
‑
14
‑
1) 等，只要在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向存在1号和2号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基 (3号葡萄糖基指与1号葡萄糖基形成β(1
‑
3)糖苷键的葡萄糖基)，就可发生在对应的 c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应(图3)。
[0077]
(3)比较天然状态osugt91c1和新酶1(his93trp)，新酶2(phe379ala)针对stb 的副反应产物，可见新酶1和新酶2无副产物生成，已完全消除添加6号葡萄糖(或4号葡萄糖基)的副反应(图4)。天然状态的osugt91c1催化副反应的底物不唯一，包括但不限于对以下甜菊糖苷底物发生副反应，stb(steviolbioside，cas 41093
‑
60
‑
1)，reb e (rebaudioside e，cas 63279
‑
14
‑
1)等，只要在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向存在1号和2号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基(3号葡萄糖基指与1号葡萄糖基形成β(1
‑
3)糖苷键的葡萄糖基)，就可发生在
reb a(rebaudioside a,cas 58543
‑
16
‑
1)等甜菊糖苷底物，只要在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向添加 2号葡萄糖基的正常反应。
[0086]
4、两个新酶在消除副反应的前提下，通过荧光转化的方法，测定新酶1和新酶2催化在甜菊糖苷底物添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1
‑
2)糖苷键)正常反应的速度
[0087]
新酶1(his93trp)和天然状态osugt91c1的活性相当，新酶2(phe379ala)是天然状态osugt91c1活性的2倍以上(表3)。
[0088]
表3天然状态osugt91c1、新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)催化在底物 c13
‑
羟基(r1)和c19
‑
羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基(正常酶促反应)的动力学参数
[0089][0090]
(1)该测定直接利用商品化的糖基转移酶活性试剂盒完成，实施例使用promega公司的udp
‑
glo
tm
glycosyltransferase assay试剂盒，其他可用于糖基转移酶反应速度检测方法可得到同样结果。promega公司的udp
‑
glo
tm
glycosyltransferase assay试剂盒用于检测以 udp
‑
glucose为糖基供体的葡萄糖基转移酶反应速度，osugt91c1原始酶及本发明涉及的两个突变新酶均适用。
[0091]
在葡萄糖基转移酶的作用下，糖基供体udp
‑
glucose将葡萄糖转移给底物后生成udp。该检测方法将生成udp等物质的量(1:1)转化为atp，atp可使荧光素酶发出定量的荧光，因此通过测定荧光量可检测酶促糖基转移反应生成udp的量。当生成udp在0
‑
25μm浓度范围内，产生的荧光强度和udp的摩尔浓度成线性关系。根据udp浓度和荧光强度对应关系的标准曲线，计算udp的生成量，可转化为糖基转移酶的催化反应速度。
[0092]
(2)配制udp不同浓度的一系列溶液，根据上述转化的反应，测定对应的荧光强度。天然状态osugt91c1及本发明涉及的两个新酶，以不同底物检测各种催化反应的速度及酶动力学常数等信息，用于评价本发明的新酶1(his93trp)和新酶2(phe379ala)在促进添加2号葡萄糖基正常反应上的效果。利用rubu(rubusoside，cas 64849
‑
39
‑
4)、s13g (steviol
‑
13
‑
o
‑
monoglucoside，cas 60129
‑
60
‑
4)及reb a(rebaudioside a,cas 58543
‑
16
‑
1) 为底物分别检测新酶1和新酶2在c13
‑
羟基，c19
‑
羧基添加2号葡萄糖基的催化能力，并和天然状态osugt91c1的催化能力进行比较。天然状态的osugt91c1及新酶1，新酶2 催化在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的底物不唯一，包括但不限于，rubu(rubusoside，cas 64849
‑
39
‑
4)、s13g(steviol
‑
13
‑
o
‑
monoglucoside，cas60129
‑
60
‑
4)及reb a(rebaudioside a,cas 58543
‑
16
‑
1)等甜菊糖苷底物，只要在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方
向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13
‑
羟基或c
‑ꢀ
19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应。
[0093]
(3)天然状态osugt91c1与新酶1(his93trp)和新酶2(phe379ala)针对不同底物的酶动力学常数表3所示，可见新酶1(his93trp)和新酶2(phe379ala)在消除添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的前提下，新酶1(his93trp)不明显影响添加2号葡萄糖基的正常反应，新酶2(phe379ala)对添加2号葡萄糖基的正常反应有两倍以上的增强效应。
[0094]
5、新酶1和新酶2无副反应的发生，可催化完成在甜菊糖苷底物c13
‑
羟基或(和)c
‑ꢀ
19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应，生成包括reb e(rebaudioside e，cas 63279
‑ꢀ
14
‑
1)的一系列甜菊糖苷产物。在此条件下，利用糖基转移酶ugt76g1在c13
‑
羟基或(和) c
‑
19羧基方向继续添加3号葡萄糖基，则可获得甜菊糖苷d和m(rebaudioside d，cas63279
‑
13
‑
0和rebaudioside m，cas 1220616
‑
44
‑
3)(图7)。
[0095]
五、新酶1(his93trp)、新酶2(phe379ala)的氨基酸序列具有冗余性，可以去除或改变第1
‑
14位的任一氨基酸。
[0096]
以新酶2(phe379ala)为实施例，对新酶2去除第1
‑
14位的全部氨基酸 (mdsgysssyaaaag)得到新酶2截短体，该截短体仍能正常表达、纯化，并显示出在甜菊糖苷底物c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的活性。
[0097]
1、为了验证第1
‑
14位氨基酸(mdsgysssyaaaag)的冗余性，在新酶2 (phe379ala)的表达载体上构建去除第1
‑
14位的全部氨基酸(mdsgysssyaaaag)(新酶2截短体)的表达载体
[0098]
(1)以新酶2(phe379ala)的表达质粒为模板，设计去除第1
‑
14位的全部氨基酸的截短体的引物如表4。
[0099]
表4突变体引物序列如下：
[0100][0101][0102]
(2)用ddh2o溶解表4的引物，稀释引物浓度为10μm。用去除1
‑
14
‑
f和去除1
‑
14
‑
r 的一对引物分别以新酶2(phe379ala)的表达质粒为模板进行pcr扩增，体系同为：dntp4μl，5
×
ps buffer 10μl，上下游引物各2μl，模板1μl(约10ng)，pcr扩增酶primerstar 0.5μl，剩余用ddh2o补齐至50μl。混匀后用pcr扩增，扩增程序：98℃预变性2 min，98℃变性30s，69℃退火30s，72℃延伸8min，扩增20个循环，72℃再延伸 10min，最后4℃保存。
[0103]
(3)从上述扩增产物各取出10μl进行琼脂糖胶验证pcr的扩增效果，剩余的40μl 体系里各加1μl dpni酶，37℃孵育1
‑
2小时后取10μl分别转入100μl e.coli dh5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激2min，再冰浴3min后加入新鲜lb 300μl，200rpm37℃摇床孵育1小时后，分别取150μl均匀涂布于amp抗性的固体lb平板上，37℃静置培养过夜。
[0104]
(4)挑取两个平板上的单克隆菌落接种于10ml的lb培养基中，200rpm 37℃培养 12
‑
16小时后提取质粒，dna测序验证新酶2截短体的表达质粒，成功去除了第1
‑
14位的全部氨基酸，除了第1
‑
14位氨基酸被去除，其余位点氨基酸序列同seq id no.2维持一致。
[0105]
2、新酶2(phe379ala)去除第1
‑
14位的全部氨基酸后截短体的诱导表达和纯化
[0106]
(1)将对应的表达质粒转化至e.coli bl21(de3)表达菌株，第二天挑取单克隆接种于 10ml新鲜的lb培养基中，200rpm 37℃培养过夜后加入终浓度为8％的甘油保种，该菌种可在
‑
80℃长期保存。
[0107]
(2)挑取上一步保存的e.coli bl21(de3)甘油菌接种于含amp 50μg/ml的100ml新鲜lb培养基中，200rpm 37℃过夜培养。第二天以1％的接种比例接种于含amp 50μg/ml 的1l新鲜lb培养基，180rpm 37℃培养至od600＝1.0后，菌液降温至16℃，添加终浓度为0.5mm的iptg，160rpm 16℃
–
20℃诱导表达18小时。
[0108]
(3)完成诱导表达后，4000rpm离心15min弃上清，收集菌体。菌体用重悬缓冲液 (20mm tris
‑
hcl buffer ph 7.8,0.5m nacl,30mm imidazole)重悬后，用高压破碎仪在 1000bar压力下反复破碎3次。13500rpm 4℃离心60min，离心后的上清上样到nta
‑
ni 柱，用上述重悬缓冲液洗去非特异性结合的杂蛋白，带组氨酸标签的目的蛋白可被洗脱缓冲液(20mm tris
‑
hcl buffer ph 7.8,0.5m nacl,250mm imidazole)洗脱下来。洗脱下来的蛋白进一步置换到20mm hepes buffer ph 7.2,50mm nacl里，经液氮速冻后，可长期保存于
‑ꢀ
80℃。上述步骤可纯化得到新酶2的截短体，并通过sds
‑
page检测纯度(图8)。由图8 可见，根据新酶2及其截短体在sds
‑
page上的位置，新酶2的截短体比新酶2的分子量小；同时当新酶2去除第1
‑
14位氨基酸的截短体可以进行正常的表达和纯化。由于新酶1 和新酶2具有同样的第1
‑
14位氨基酸，对新酶2完全去除第1
‑
14位氨基酸的实施例，显示第1
‑
14位氨基酸具有冗余性。同理，新酶1的第1
‑
14位氨基酸也具有冗余性。
[0109]
3、新酶2的截短体不影响在甜菊糖苷底物的c13
‑
羟基和c
‑
19羧基两个方向添加第2 号葡萄糖基的正常反应，进一步显示第1
‑
14位氨基酸在新酶1和新酶2中的冗余性。
[0110]
(1)以甜菊糖苷底物rubu(rubusoside,cas 64849
‑
39
‑
4)为实施例，天然状态的 osugt91c1可在底物rubu的c13
‑
羟基、c19
‑
羧基两个方向添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1
‑
2)糖苷键)(正常反应)(图9中a)，新酶2的截短体同样可在底物rubu的 c13
‑
羟基、c19
‑
羧基两个方向添加2号葡萄糖基(图9中b)。
[0111]
(2)实施例的反应体系如下：在20℃
‑
40℃，200μl反应体系包括：1mm udp
‑ꢀ
glucose,20mm tris
‑
hcl缓冲液ph 7.2，浓度分别为0.05mg/ml(1
×
)和0.25mg/ml(5
×
)的酶样品(天然状态或者新酶2截短体)，0.3mm底物rubu。通过加入酶样品启动反应，分别于0，2，18小时取样60μl，与等体积的正丁醇混合涡旋振荡，终止反应并萃取对应的酶促反应产物，室温17000rpm离心10min，室温静置1min，取上层正丁醇的萃取相50μl 真空干燥后，用等体积的25％乙腈重悬后，利用hplc检测酶促产物。本实施例所列的反应条件不唯一，只要能使osugt91c1发生酶促反应，都可得到同样的结果。检测手段也不唯一，只要能区分每个酶促产物，可得到相同的检测结果。
[0112]
(3)天然状态的osugt91c1和新酶2截短体催化在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向添加2 号葡萄糖基的正常反应的底物不唯一，包括但不限于，rubu(rubusoside，cas 64849
‑
39
‑ꢀ
4)、s13g(steviol
‑
13
‑
o
‑
monoglucoside，cas 60129
‑
60
‑
4)及reb a(rebaudioside a,cas58543
‑
16
‑
1)等甜菊糖苷底物，只要在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13
‑
羟基或c
‑
19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应。