一种含油污染物降解菌株ZT2、微生物菌剂和应用的制作方法

一种含油污染物降解菌株zt2、微生物菌剂和应用
技术领域
1.本发明涉及微生物修复技术领域，具体涉及一种含油污染物降解菌株zt2、微生物菌剂和应用。


背景技术：

2.含油污泥在我国已被列入《国家危险废物名录》中的含油废物类，国家要求必须对含油污泥进行无害化处理，实现资源化回收利用。含油污泥的减量化处理与资源化利用能力不仅制约着企业的生存与发展，同时也存在极大的环境污染隐患。目前含油污泥处理主要采用的是化学热洗法、萃取分离法、生物处理法、焚烧法等，但对于成分相对复杂的含油污泥，尤其是稠油污泥，传统化学热洗法清洗得不干净、不彻底，减量化效果差；萃取分离法处理成本高，萃取剂回收再利用效率不高；焚烧法成本较高、二次污染严重、一次性投资较大。目前，上述化学热洗、萃取等处理方法均具有一定的局限性，而微生物降解含油污泥具有安全性高、无二次污染、成本低、环境友好等优点，被认为是处理含油污泥的一种经济环保的方法，因此如何筛选获得高效石油降解菌株是利用生物法处理含油污泥的关键。
3.中国专利申请201810115869.9公开了一株含油污泥中石油烃类的高效降解菌jn6及其应用，该菌株为丛毛单胞菌属comamonas sp.。所述的具有石油烃类降解功能的菌株jn6用途为以降解石油烃类的方式进行含油污泥的治理，该细菌以单一菌株30天内对含油污泥中总石油烃(tph)的降解率为62.16％，该细菌对石油污染物的最适降解条件为15-40℃、ph值7-11。中国专利申请201810115860.8公开一株含油污泥中石油烃类的高效降解菌jn4及其应用，该菌株为施氏假单胞菌属pseudomonas stutzeri。所述具有石油烃类降解功能的菌株jn4用途为以降解石油烃类的方式进行含油污泥的治理。该细菌30天内对含油污泥中总石油烃(tph)的降解率为71.05％，并对n-c10～n-c30具有明显的降解能力，通过gc-ms分析表明，该菌株对环烷烃萘烷、茚烷、高雄烃的降解能力较强，对石油污染物的最适降解条件为25-40℃、ph值5-11。中国专利申请201710022605.4公开了一株克雷伯菌属(klebsiella sp.)细菌cgmcc13201，该细菌可有效降解含油污泥、含油泥砂等被原油污染土壤中的原油。中国专利申请201410072228.1公开了本发明涉及一种含油污泥中石油降解菌，该菌株为从渤海油田含油污泥中分离出的谷氨酸棒杆菌corynebacteriumglutamicum。其保藏编号cgmcc8647，经过试验证实，rs1对饱和烃的降解率较高，达20.74％，该细菌30d内对含油污泥中总石油烃(tph)的降解率为39.69％，该细菌对石油的最适降解条件为37℃、盐度0.5％～5％、ph6～8。
4.然而上述所提及的降解菌对于含油污染物的降解范围有限，对于含油污泥，特别是稠油污泥化学精细热洗处理技术处理后的残余稠油污泥并未没有体现出很好地进行降解，因此，亟需寻找到更好的降解含油污染物的微生物菌株。


技术实现要素：

5.为了改进目前现有的微生物对于含油污染物降解范围的有限性，本发明的目的在
于提供一种用于降解含油污染物的微生物特基拉芽孢杆菌zt2，其能够有效的降解稠油污泥化学精细热洗处理技术处理后的残余稠油污泥。
6.本发明的另一个目的在于提供一种含有上述特基拉芽孢杆菌zt2的微生物菌剂。
7.本发明的再一个目的在于提供上述微生物及其微生物菌剂在降解修复含油污染物中的应用。
8.本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
9.一种特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2，该特基拉芽孢杆菌zt2已在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年1月11日，该菌种保藏编号为cgmcc no.17158，分类命名为bacillus tequilensis。
10.根据本发明的一些具体实施方案，上述特基拉芽孢杆菌zt2的16s rdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.本发明所述特基拉芽孢杆菌zt2的菌落形态为：浅白色，圆形，半透明，光滑，湿润，边缘整齐，革兰氏阴性杆菌。根据本发明的一些具体实施方案，上述特基拉芽孢杆菌zt2对石油烃类的降解条件为10-30℃，ph值7-8，优选ph值8。
12.另一方面，本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有上述特基拉芽孢杆菌zt2，并且还可以添加其他常规的辅助成分，例如滑石粉、吐温等，该微生物菌剂的制备方法能够通过常规试验获得。
13.再一方面，本发明还提供了上述特基拉芽孢杆菌zt2在降解修复含油污染物中的应用。
14.根据本发明的一些具体实施方案，上述含油污染物包括含油污泥、被原油污染的水体、以及原油污染物。
15.根据本发明的一些具体实施方案，上述含油污泥包括稠油污泥化学精细热洗处理技术处理后残余的稠油污泥，优选为低含油的稠油污泥。
16.根据本发明的一些具体实施方案，上述应用包括以下步骤：步骤一，将特基拉芽孢杆菌zt2接种至培养基进行培养，制成菌悬液；步骤二，将菌悬液与含油污染物混合，适当时间后重复接种，然后保存适当时间，完成降解修复。
17.根据本发明的具体实施方案，步骤一中，所述培养基为未添加琼脂的pda(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基。
18.根据本发明的具体实施方案，步骤一中，所述特基拉芽孢杆菌zt2接种至培养基进行培养的条件为30℃、180r/min，震荡3天。
19.根据本发明的具体实施方案，步骤二中，将菌悬液与含油污染物混合13-15天后进行重复接种。
20.根据本发明的一些具体实施方案，所述未添加琼脂的pda培养基的配置原料包括：每1000ml水中含有马铃薯200g，葡萄糖20g。
21.根据本发明的一些具体实施方案，所述含油污染物来自辽河油田。
22.根据本发明的一些具体实施方案，所述含油污染物的ph值为8-9(土：水＝1:5)。
23.根据本发明的一些具体实施方案，上述应用包括以下步骤：步骤一，挑取特基拉芽孢杆菌zt2接种至pda培养基(不加琼脂)中进行培养，30℃、180r/min震荡3天制成菌悬液；
步骤二，将同批次的含油污泥作为一个处理收集在容器中，向其中加入所述菌悬液300ml进行翻拌，2周后进行重复接种，同时设置不加菌剂的对照处理；步骤三，试验期间每两周搅拌一次(采用人工搅拌)，以提供微生物降解石油所需要的氧气。实验过程中，根据含泥砂原油的干湿情况适当地加入部分水，以保持实验过程中，含泥砂原油处于潮湿状态，有大雨等天气盖上塑料箱上盖，试验开始的第一个月每半个月测定一次土壤总石油烃含量、含水率，从第二个月起每月测定一次土壤总石油烃含量、含水率，统计结果。
24.根据本发明的一些具体实施方案，收集该含油污染物的容器体积为40cm
×
55cm
×
6cm。
25.本发明还进一步提供了上述特基拉芽孢杆菌zt2在降解修复含油污染物中的应用。
26.本发明的有益效果：
27.1、本发明的特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2源于辽河油田当地含油污泥，该菌株进入土生菌群中占据一定生态位，有效促进石油烃类的降解。
28.2、本发明通过特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2单菌株降解稠油污泥，可达到稠油污泥减量化效果。室内试验中，接种特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)菌株的稠油污泥中总石油烃含量21天的降解率为17.69％。室外试验，接种特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)菌株的稠油污泥中总石油烃含量52天的降解率为50.59％。该菌种在土生菌种中可占据一定的生态位，促进石油烃类的降解，进一步降低稠油精细热洗稠油污泥化学精细热洗处理技术处理后的污泥中总石油烃的含量，处理成本较低，应用效果好，经济效益及社会效益显著。
29.3、本发明特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2是以单一的菌种实现较为优异的含油污泥中石油烃类的降解，减少混合菌剂制备过程中各菌株分别活化并按比例混合的复杂步骤，易于控制含油污泥石油烃类降解的最佳反应条件，易于联合其他方法对含油污泥中的石油烃类物质进一步去除。
附图说明
30.图1为本发明实施例1中驯化后的菌株zt2平板培养基生长状况。
31.图2为本发明实施例1中获得的特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2形态。
32.图3为本发明实施例1中特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2的电镜图。
33.图4为本发明实施例3中特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2在不同ph下对含油污泥中石油烃类的降解曲线。
34.图5为本发明实施例4中特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2在不同温度下对含油污泥中石油烃类的降解曲线。
35.本发明的特基拉芽孢杆菌zt2微生物保藏信息如下：
36.保藏日期：2019年1月11日；
37.保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)；
38.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
39.保藏编号：cgmcc no.17158；
40.分类命名：特基拉芽孢杆菌bacillus tequilensis。
具体实施方式
41.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明/的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
42.实施例1特基拉芽孢杆菌zt2的筛选与鉴定
43.(一)材料准备
44.1土壤材料
45.从辽河油田某地取石油污染土壤，散碎处理，4℃保存。
46.2培养基：
47.无机盐富集培养基(1l)：k2hpo4·
3h2o 1g，kh2po
4 1g，mg2so4·
7h2o 0.5g，nh4no
3 1g，cacl
2 0.02g，fecl3痕量，柴油3，ph 7.2-7.4。
48.pda培养基(1l):马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂18～20g；蒸馏水1000ml；自然ph值。
49.降解培养基(1l)：(nh4)2so
4 0.5g，nano
3 0.5g，cacl
2 0.02g，mgso
4 0.2g，kh2po
4 1.0g，nah2po4·
h2o 1.0g，ph 7，含泥砂原油50g。
50.(二)菌株的分离筛选与驯化
51.在以柴油为唯一碳源的无机盐富集培养基中加1％(w/v)石油油污染土壤或渣油，30℃摇床培养3d，取富集液1ml接种相同新鲜培养基，相同条件下培养3d，如此连续富集培养4次。第二次培养以后，能观察到培养液中有大量微生物生成，呈悬浊状态。
52.富集培养基梯度稀释后分别在pda培养基进行平板培养3天，培养基表面有大量微生物菌落生成。平板长出菌落后，用接种环挑取适量的颜色、形态各不同的单菌落，反复划线分离纯化，直到得到单一的菌落。统一编号，于4℃斜面保存。
53.驯化试验用油泥样品为待处理油泥样品，含油率20％。土壤样品散碎处理，4℃下密封备用。分离纯化所获得的菌种用接种针接种至已灭菌的装有200ml降解用液体培养基的500ml三角瓶中，30℃、180rpm摇床培养，培养14天。培养结束后分别取0.1ml进行平板培养基培养，观察其生长状况。经高含油培养基驯化培养的菌种在pda培养基上有大量菌株生长(图1)，说明经富集分离筛选出的菌株能够在以高浓度石油为碳源的培养基内生长。
54.委托青岛正信检测分析有限公司进行dna鉴定及形态学鉴定。上述菌株zt2的菌落形态为：如图2，浅白色，不规则，湿润、扁平、边缘不齐，革兰氏阳性杆菌。细菌形态见扫描电镜图3。
55.上述菌株的16s ribosomal rna基因序列特征，采用分析法将序列与数据库进行比对分析，发现该菌株属于特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)，其dna序列表如序列表所示。
56.实施例2辽河油田某含油污泥的降解修复试验
57.降解试验用稠油污泥样品于2018年5月14日采集于某处理厂处理过程中的含泥砂原油，土壤风干散碎研磨后密封备用。降解试验将分离纯化所获得的菌种zt2用接种针接种至已灭菌的装有100ml降解用液体培养基的250ml三角瓶中，并设置不接种微生物的培养基作为对照组(ck)，30℃、180rpm摇床培养，培养21天，每个处理重复三次。干燥后用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量。该细菌对稠油污泥降解效果良好，培养21天后，ck
组总石油烃含量5.40
±
0.31％，接种zt2菌株的稠油污泥中总石油烃含量4.45
±
0.04％，21天降解率为17.69％。
58.实施例3特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)在不同ph值下对含油污泥中石油烃类的降解效果
59.2018年7月23日采集于某处理厂处理过程中的稠油污泥，土壤风干、散碎、研磨后袋密封备用。将100ml降解培养基加入250ml锥形瓶中，用naoh或hcl调节降解液体无机盐降解培养基的初始ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，灭菌后用接种针接种实施例1中分离纯化所获得的菌种zt2，于30℃，180rpm的恒温摇床振荡培养14天，干燥后采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量，计算降解率。在不同ph条件下菌株特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)对含油污泥中的石油烃类的降解效果如图4所示。
60.未接种微生物的对照处理(ck)土样中含油率为7.19
±
0.36％，在ph为7-8的试验范围内，对石油均有较好的降解效果，降解率为15.11％－16.73％，ph为8的条件下降解效果最佳。
61.实施例4特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)在不同温度下对含油污泥中石油烃类的降解效果
62.2018年7月23日采集于某处理厂处理过程中的稠油污泥，土壤风干、散碎、研磨后装袋密封备用。将100ml降解培养基加入250ml锥形瓶中，用naoh或hcl调节降解液体无机盐降解培养基的初始ph至7.0，灭菌后用接种针接种实施例1中分离纯化所获得的菌种zt2，分别设置摇床温度为10℃、20℃、30℃、40℃，180rpm转速振荡培养14天后，干燥后采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量，计算降解率。在不同温度条件下菌株特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)对含油污泥中的石油烃类的降解效果如图5所示。未接种微生物的对照处理(ck)土样中含油率为7.24
±
0.14％，zt2最佳培养温度为10-30℃，降解率为12.69-19.73％。
63.实施例5特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)修复实际含油污泥
64.在以上实施例的基础上，将特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)用于修复实际含油污泥，实验具体步骤如下：
65.(1)供试含油污泥：2018年8月3日，在辽河油田某含泥砂原油回收处理现场，将某批次处理后的稠油污泥放入相同的塑料箱内，体积为40cm
×
55cm
×
6cm，向其中加入微生物菌剂，设置不加菌剂的对照处理。供试油泥样品ph为8.4(土：水＝1:5)。
66.(2)菌株特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)菌悬液制备：
67.挑取特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2接种至pda培养基(不加琼脂)中进行培养，30℃、180r/min震荡3天用于试验。每个处理中加入300ml菌液后进行翻拌。2周后进行重复接种。
68.试验期间每两周搅拌一次(采用人工搅拌)，以提供微生物降解石油所需要的氧气。实验过程中，根据含泥砂原油的干湿情况适当地加入部分水，以保持实验过程中，含泥砂原油处于潮湿状态，有大雨等天气盖上塑料箱上盖。试验开始的第一个月每半个月测定一次土壤总石油烃含量(土壤总石油烃含量实际就是含油量，因为采集的样品为湿样，直接测定的数值受土壤含水的影响较大，需要计算干含油进行各个样品的比对)、含水率，从第二个月起每月测定一次土壤总石油烃含量、含水率。
69.8月3日第一次取样时取3组含泥砂原油样品，其含油量(含油量(干)＝土壤总石油烃含量/(1-含水率)*100％)在2.18-2.96％之间，但试验中发现取样时表层与底层的稠油污泥含油量之间误差较大。因此8月17日每组的含油量作为每组菌株的初始值，计算添加石油降解52天(10月8日)后的降解率，结果如表1所示：
70.表1
[0071][0072]
经过52天后，对照组含油率由2.05％降低至1.38％，降解率达32.35％。说明土生菌具有一定的降解效果。添加特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)zt2后，含油率2.28％的稠油污泥降解至1.13％，降解率达到50.59％。添加该降解功能菌后对稠油污泥的降解起到促进作用。供试稠油污泥样品ph为8.4(土：水＝1:5)，且10℃-30℃降解速度较快，与所述的降解温度10-30℃、ph为7-8的最佳降解条件相符。