黑水虻肠道微生物在制备防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及到黑水虻肠道微生物在制备防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂中的应用。


背景技术：

2.鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)是一种革兰氏阴性细菌，可感染哺乳动物和家禽，是引起人畜食物中毒、肠道感染的重要病原菌，全球每年因鼠伤寒沙门氏菌引发的感染超过2000万人。同时鼠伤寒沙门氏菌也是畜牧养殖生产中最为常见的致病菌之一，鼠伤寒沙门氏菌感染通常会引起畜禽剧烈的炎症反应甚至死亡，给畜牧养殖业造成巨大的经济损失。
3.黑水虻，中文学名亮斑扁角水虻，长期以来，黑水虻在处理餐厨垃圾和养殖场畜禽粪便中发挥了重要作用，然而其肠道功能性微生物的种类和作用并未得到充分的重视。迄今为止，未见有关黑水虻肠道微生物在制备防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂中的应用的报道。


技术实现要素：

4.针对上述不足，本发明的目的是提供黑水虻肠道微生物在制备防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂中的应用。本发明发现：将黑水虻肠道微生物移植到c57/bl6j小鼠肠道中，能够显著缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的小鼠采食量和体重减轻，降低小鼠肝脏和脾脏炎症。因此，本发明提供黑水虻肠道微生物在制备防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂中的应用对于解决沙门氏菌感染造成的人畜健康问题具有重要意义。
5.为达上述目的，本发明采取如下技术方案：
6.本发明提供黑水虻肠道微生物在制备防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂中的应用。
7.进一步地，上述制剂包括包括药物制剂或组织工程产品制剂。
8.进一步地，药物制剂包括内用药物制剂或外用药物制剂；其中，内用药物制剂包括口服制剂或注射剂；外用药物制剂包括贴剂或涂抹制剂。
9.一种防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂，该制剂的有效成分为黑水虻肠道微生物。
10.进一步地，本发明中黑水虻肠道微生物可采取现有技术进行提取，也可采用如下方法进行提取：
11.将黑水虻幼虫卵孵化后接种于麦麸基质中，于环境温度为25
‑
30℃和环境湿度为75～85％下培养；于黑水虻幼虫期第8天收集幼虫，称重，经灭菌的pbs清洗后取出完整肠道，置于预冷的细菌保存液中(比如10％甘油pbs溶液)；用灭菌剪刀小心的剪碎肠道组织，并置于磁力搅拌器中搅拌5分钟，使肠道细菌溶解于细菌保存液中，然后过滤掉肠道组织，滤液经微生物计数后，分装保存在低温环境中，备用。
12.综上所述，本发明具有以下优点：
13.1、本发明首次发现将黑水虻肠道微生物移植到c57/bl6j小鼠肠道中，能够显著缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的小鼠采食量和体重减轻，降低小鼠肝脏和脾脏炎症。因此，本发明提供黑水虻肠道微生物在制备防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂中的应用对于解决沙门氏菌感染造成的人畜健康问题具有重要意义。
附图说明
14.图1为本发明中黑水虻肠道微生物移植及鼠伤寒沙门氏菌攻毒对小鼠鼠采食和体重的影响结果；
15.图2为黑水虻肠道微生物移植及鼠伤寒沙门氏菌攻毒对小鼠肝脏指数、细菌移位、炎症的影响结果；
16.图3为黑水虻肠道微生物移植及鼠伤寒沙门氏菌攻毒对小鼠脾脏炎症的影响结果。
具体实施方式
17.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
18.因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例
20.1.黑水虻幼虫饲养及肠道微生物分离、保存
21.黑水虻幼虫卵孵化后接种于麦麸基质中，控制环境温度在25
‑
30℃、环境湿度在80％左右；于幼虫期第8天收集幼虫，称重60g，经灭菌的pbs清洗后取出完整肠道，置于120ml预冷的细菌保存液中(10％甘油pbs溶液)。用灭菌剪刀小心的剪碎肠道组织，并置于磁力搅拌器中搅拌5分钟，使肠道细菌溶解于细菌保存液中，然后用6层灭菌纱布过滤掉肠道组织，滤液经微生物计数后，分装保存在
‑
80℃环境中，备用。
22.2.黑水虻肠道微生物移植c57/bl6j小鼠
23.选取选24只6周龄spf级c57bl/6雄性小鼠，饲养于仲恺农业工程学院健康养殖创新研究院动物房，室温24℃，自由采食与饮水。将24只小鼠随机分成4组，每组6只，适应环境3天后开展实验。每天上午灌服黑水虻肠道微生物1次，每次灌服100μl，连续灌服10天。灌服10天后开展鼠伤寒沙门氏菌攻毒实验，攻毒后4天屠宰小鼠，每天记录采食量和体重变化，具体分组如下：
[0024][0025]
3.鼠伤寒沙门氏菌攻毒小鼠模型构建
[0026]
(1)挑取鼠伤寒沙门氏菌划线于lb琼脂平扳，37℃生化培养箱培养18h；
[0027]
(2)挑取单菌落接种于5ml lb液体培养基中，37℃，250r/min，摇床震荡l0 h；
[0028]
(3)吸取500μl菌悬液转接至50ml lb液体培养基中，37℃，250r/min，床震荡3h左右；
[0029]
(4)5000r/min离心3min，去掉上清，加入10ml无pbs重悬细菌，调整菌悬液浓度为108cfu/ml，每只小鼠灌胃200微升鼠伤寒沙门氏菌菌悬液。
[0030]
4.数据分析
[0031]
所有结果均表示为平均值
±
标准误，采用sas 9.2单因素方差分析，并进行了tukey多重比较检测差异，当p<0.05时认为有统计学意义，p<0.01为差异极显著。
[0032]
5.实验结果
[0033]
5.1.黑水虻肠道微生物移植可显著缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的小鼠采食量和体重减轻。
[0034]
如图1所示，其中，图1中a图为实验周期内小鼠采食量变化；b图为攻毒前10天小鼠总采食量；c图为攻毒后4天小鼠总采食量；d图为实验周期内小鼠体重变化；e图为攻毒前小鼠体重变化；f图为攻毒后小鼠体重变化。本实验发现：移植100μl、106cfu/ml黑水虻肠道微生物，可以显著缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的小鼠采食量(图1a
‑
c)和体重减轻(图1d
‑
f)。
[0035]
5.2.黑水虻肠道微生物移植可显著缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的小鼠肝脏炎症和细菌移位。
[0036]
如图2所示，其中，图2中a图为肝脏形态学图片；b图为肝脏指数；c图为肝脏he染色(100x)；d图为肝脏枯否氏细胞数目；e图为肝脏组织中沙门氏菌分离培养；f图为肝脏沙门氏菌计数。本实验发现：移植100μl、106cfu/ml黑水虻肠道微生物，可以显著降低肝脏指数(图2a
‑
b)，减少肝脏kupffer细胞的数量(图2c
‑
d)。肝脏组织中沙门氏菌分离培养结果也表明，黑水虻肠道微生物移植可显著减少鼠伤寒沙门氏菌感染移位至肝脏(图2e
‑
f)，同样肝脏炎症基因il
‑
1β、tnfα、il
‑
6、mcp1等mrna水平也显著降低(图2g)。
[0037]
5.3.黑水虻肠道微生物移植可显著缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的脾脏肿大。
[0038]
如图3所示，其中，图3中a图为脾脏形态学图片；b图为脾脏指数；c图为脾脏he染色(100x)；d图为脾脏白髓面积；e图为脾脏炎症基因和巨噬细胞marker基因鉴定。本实验发现：移植100μl、106cfu/ml黑水虻肠道微生物，可以显著降低脾脏指数(图3a
‑
b)，显著增加脾脏白髓面积(图3c
‑
d)，降低脾脏巨噬细胞表面抗原基因的f4/80的表达(图3e)。
[0039]
综上所述，本发明首次发现将黑水虻肠道微生物移植到c57/bl6j小鼠肠道中，能够显著缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的小鼠采食量和体重减轻，降低小鼠肝脏和脾脏炎症。因此，本发明提供黑水虻肠道微生物在制备防治鼠伤寒沙门氏菌感染的制剂中的应用对于解决沙门氏菌感染造成的人畜健康问题具有重要意义。
[0040]
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。