植物提取组合物、其制备方法及应用与流程

1.本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种植物提取组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物节律又称生物钟，是指从单细胞到动植物再到人类，所有生命活动均按一定时间顺序、周而复始的规律性发生变化的节律。生物钟对生物体的行为和生理的调控起着至关重要的作用。哺乳动物中生物节律调控能量代谢、dna损伤和修复以及调节免疫细胞功能等多方面生理活动。
3.生物钟的分子机制，目前最受认可的是生物节律运行的正、负反馈环路机制。正负反馈环路的主要核心生物钟基因为clock、bmal1、per和cry基因，其中正向环路主要由clock和bmal1两种转录因子组成，而负向环路主要由per和cry因子组成。clock和bmal1这两个转录因子组成异二聚体，与其它生物钟基因及钟控基因上游的启动子结合，促进其转录，同时per和cry因子合成后在细胞质内结合成异二聚体，转运到细胞核内，负反馈抑制clock/bmal1的转录作用，从而实现了生物节律正负反馈的调控机制。
4.作为皮肤细胞的角质细胞、黑色素细胞、成纤维细胞中也存在独立生物钟系统。生物钟蛋白质不仅在培养的人体细胞中表达，而且还在人体皮肤生物组织中表达，并通过此对皮肤功能产生影响。目前认为对生物节律形成有重要作用的因素是光和时间，而光老化是导致皮肤衰老的主要原因。紫外线辐射会引起dna损伤，氧化应激和炎症，并抑制皮肤中的免疫系统，共同促进皮肤衰老。多种证据表明bmal1的下调和缺失会伴随着ros产生和dna损伤，其中dna损伤是衰老的主要诱因。joo等用uv辐射hacat细胞，造成dna损伤的同时可以导致bmal1的mrna和蛋白质水平下调，恢复它的表达又会伴随dna修复，说明通过恢复节律可以调节dna损伤和修复，从而减缓衰老进程。
5.除了对皮肤衰老方面的影响，生物节律还可以调控免疫系统，其在不同水平对免疫组织、细胞、免疫因子等具有调控作用。有研究表明在一天中的不同时期，外周淋巴细胞和部分炎症因子的表现具有明显的节律性。用光照紊乱构建的慢性实验性时差模型显示，给予lps刺激时，紊乱组较非紊乱模型小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症因子水平明显上升。
6.另外，免疫因子可以反向调节中枢和外周生物钟来调控生物钟系统，如多种炎症因子可影响机体生物节律。采用tnf
‑
α处理3t3成纤维细胞后发现，时钟基因per1、per2、per3的表达受到抑制(cavadini,et al.tnf
‑
αsuppresses the expression of clock genes by interfering with e
‑
box
‑
mediated transcription)。而ifn
‑
α处理培养hepg2后，可以显著降低clock和bmal1的蛋白表达水平(koyanagi,et al.alteration of intrinsic biological rhythms during interferon treatment and its possible mechanism)。刘晓晶通过体外研究表明小鼠腹腔巨噬细胞在给予lps刺激后2h，bmal1、clock、per1和cry1表达明显下降。同时，小鼠实验表明结肠炎组bmal1和clock的表达均较对照组降低。另外，结肠炎患者肠道bmal1蛋白水平下降，lps刺激后raw264.7细胞bmal1蛋白表达下降(刘晓晶.生物钟基因和炎症相互作用共同参与炎症性肠病发病的机制探究)。
7.栝楼(trichosanthes kirilowii maxim)为葫芦科、栝楼属多年生攀缘草本植物。栝楼的不同部位均存在显著的药用价值，包括栝蒌实/瓜蒌(果实)、瓜蒌皮(果皮)、瓜蒌子(种子)、栝楼根/天花粉(根)。栝楼根为栝楼的干燥根，《神农本草经》载其“味苦，寒。主治消渴，身热，烦热，大热，补虚，安中，续绝伤。”《中国药典》概括其功效为清热泻火、生津止渴、消肿排脓。栝楼根的化学成分主要为氨基酸、糖类成分、蛋白质、多肽、多种酶、皂苷、多糖类化合物等，其药理作用主要是增强免疫力、抗癌、抗病毒、降血糖等。现代药理学研究表明，天花粉能够促进人体产生免疫球蛋白，从而可提高人体的免疫力。
8.鹅不食草为菊科石胡荽属植物鹅不食草(centipeda minima(l.)a.br.et aschers.)的干燥全草。鹅不食草系常用辛温解表药，其味辛，性温，归肺、肝经，具有发散风寒，通鼻窍，止咳功效，从始载至今已有千余年临床用药实践。现代药理研究表明鹅不食草具有广泛的药理作用，包括抗过敏性鼻炎、抗肿瘤、抗过敏、抗炎、抗诱变等。
9.掐不齐(kummerowia striata(thunb.)schindler)为豆科鸡眼草属植物的全草。始载于《救荒本草》，又名人字草、鸡眼草、斑珠科、公母草、牛黄黄、红花草等。掐不齐味淡性凉，具有清热解毒、健脾利湿之功效。掐不齐的主要活性成分为黄酮类和葡萄糖苷，如木犀草素，芹菜素、槲皮素等。研究表明掐不齐乙醇提取物可以下调tnf
‑
α，il
‑
1β、il
‑
6、no和cox
‑
2等炎症介质的表达，同时促进ho
‑
1的释放而发挥一定的抗炎作用。
10.现有技术中并未发现有研究文献或者专利报道植物提取物在促进炎症修复的同时，并对时钟基因具有调控作用的研究。本发明将文献报道的具有抗炎效果的栝楼根提取物、鹅不食草提取物、掐不齐提取物以一定比例复配后，并辅以特定的工艺制备，所得的植物提取组合物可以通过抑制炎症因子的表达促进炎症修复，并对时钟基因bmal1和per1具有明显的调整作用，对uvb诱导hacat细胞形成的dna损伤具有修复作用，达到改善生物节律紊乱的效果。
11.目前在化妆品技术领域，针对生物节律的产品主要集中在调节生物钟基因的表达。本发明为免疫系统与生物钟之间的关系研究提供了重要的基础研究资料，同时为开发具有时钟基因调节效果的植物提取产品提供了一个崭新思路。


技术实现要素：

12.鉴于目前免疫系统与生物钟之间的关系研究较少，未有报道植物提取物在促进炎症修复的同时可以调控生物钟基因的表达。本发明提供一种能够改善生物节律紊乱的植物提取组合物，其可以在促进炎症修复的同时，调节生物钟基因bmal1和per1的表达，修复uvb诱导hacat细胞形成的dna损伤，并具有改善皮肤弹性的效果。
13.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
14.一种具有促进炎症修复、改善生物节律紊乱的植物提取组合物，其特征在于，所述组合物由以下质量比的组分组成：栝楼根提取物：鹅不食草提取物：掐不齐提取物的质量比为(0.5
‑
4)：(1
‑
3)：(1
‑
4)。
15.作为优选，所述栝楼根提取物：鹅不食草提取物：掐不齐提取物的质量比为(1
‑
4)：(1
‑
2)：(1
‑
2)。
16.进一步优选，所述栝楼根提取物：鹅不食草提取物：掐不齐提取物的质量比为1：2：2。
17.进一步优选，所述栝楼根提取物：鹅不食草提取物：掐不齐提取物的质量比为1：1：1。
18.本发明还提供了一种植物提取组合物的制备方法，包括以下步骤：
19.(1)将干燥的栝楼根、鹅不食草、掐不齐粉碎，过40
‑
80目筛，按照一定比例混合均匀；
20.(2)混合的植物原材料中，加入提取溶剂，搅拌提取，4c滤纸过滤得初滤液；
21.(3)初滤液减压浓缩得浓缩液；
22.(4)利用活性炭和澄清剂对上述浓缩液进行除杂后，离心，上清液经膜过滤得提取物半成品；
23.(5)将提取物半成品与多元醇按一定比例混合后，膜过滤，即得所述植物提取组合物。
24.作为优选，所述步骤(2)中，提取溶剂为50
‑
90％乙醇；
25.所述步骤(2)中，提取溶剂的用量为植物原材料的10
‑
40倍；
26.所述步骤(2)中，提取温度为20
‑
50℃，搅拌转速为300
‑
600rpm，提取时间为2
‑
5h。优选的，所述提取溶剂为75％乙醇。
27.作为优选，所述步骤(3)中，减压浓缩的温度为50
‑
70℃，减压浓缩比例为2
‑
10:1。
28.作为优选，所述步骤(4)中，按质量百分比，活性炭用量为浓缩液的0.05
‑
1％，澄清剂用量为浓缩液的1
‑
5％；
29.所述澄清剂包括ztc
‑ⅱ
型、ztc
‑ⅲ
型、101型中的一种或几种。优选的，所述澄清剂为ztc
‑ⅱ
型。
30.作为优选，所述步骤(5)中，多元醇与提取物半成品质量比为5
‑
20:1；
31.所述多元醇包括己二醇、丙二醇、1,3
‑
丙二醇，双丙甘醇或丁二醇中的一种或多种。优选的，所述多元醇为双丙甘醇。
32.本发明另一方面，提供上述植物提取组合物在制备促进炎症修复的组合物中的应用。
33.本发明还提供上述植物提取组合物在制备改善生物节律紊乱的组合物中的应用。
34.上述组合物为药物或化妆品。
35.本发明还提供了上述植物提取组合物在制备具有促进炎症修复、改善生物节律紊乱的化妆品中的应用。在皮肤护理化妆品中的应用，所述皮肤护理化妆品包括但不限于霜剂、乳液、化妆水、凝胶剂、面膜、软膏。
36.本发明将文献报道的具有抗炎效果的栝楼根提取物、鹅不食草提取物、掐不齐提取物以一定比例复配后，并辅以特定的工艺制备，制得所述植物提取组合物。
37.本发明提供的植物提取组合物具有促进炎症修复效果，表现为对lps诱导raw264.7细胞中炎症反应中no的生成具有抑制作用。
38.本发明提供的植物提取组合物具有改善生物节律紊乱的效果，表现为：
39.(1)对uvb诱导hacat细胞形成的dna损伤具有修复作用，其中因紫外线引起的dna损伤是衰老的主要诱因，表明其可以在某种程度上防护因紫外线引起的皮肤老化；
40.(2)促进生物钟基因bmal1的表达，降低per1的表达，可以有效调节bmal1和per1的表达使其恢复成接近没有uvb刺激下的正常表达量；
41.(3)具有改善皮肤弹性的功效，减缓因光老化(其可引起生物节律紊乱，最终在临床上表现为皮肤老化)导致的皮肤衰老。
42.本发明提供的植物提取组合物，取材于栝楼根提取物、鹅不食草提取物、掐不齐提取物，所述3种植物药用历史悠久，因此，本发明药用经验丰富、副作用少、安全性高。
43.目前在化妆品技术领域，针对生物节律的产品主要集中在调节生物钟基因的表达。本发明创新性地发现所述植物提取组合物在促进炎症修复与调控时钟基因间具有某种关联性，为免疫系统与生物钟之间的关系研究提供了重要的基础研究资料，同时为开发具有时钟基因调节效果的植物提取产品提供了一个崭新思路。
附图说明
44.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
45.图1为本发明制备的植物提取组合物的抗炎测试结果图。
46.图2为组合物7对hacat细胞时钟基因bmal1和per1的表达量结果图。
47.图3为组合物7对uvb诱导的dna修复测试结果图。
48.图4为本发明制备的含组合物7、对比例4的基础凝胶对皮肤弹性的改善测试结果图。
具体实施方式
49.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
50.实施例1制备本发明各比例植物提取组合物和对比例组合物
51.在本发明组合物和对比例的制备工艺：
52.(1)将表1中的比例取适量干燥的栝楼根、鹅不食草、掐不齐粉碎，过40
‑
80目筛，按照一定比例混合均匀；
53.(2)混合的植物原材料中，加入25倍75％乙醇，500rpm，25℃提取3h，4c滤纸过滤得初滤液；
54.(3)初滤液于55℃减压浓缩至原质量的1/3得浓缩液；
55.(4)加入活性炭0.5％，搅拌均匀，静置30min后，加入ztc
‑ⅱ
型澄清剂2％，放置30min后，离心、过膜，得提取物半成品；
56.(5)将提取物半成品与双丙甘醇按1:8混合后，膜过滤，即得到本发明植物提取组合物。
57.表1所示为本发明植物组合物1
‑
10及对比例1
‑
3中各组合物的组成比例(栝楼根提取物：鹅不食草提取物：掐不齐提取物的组成比例以质量计)。根据表1并采用上述方法制备各组合物及对比例，并对其进行功效测试。
58.表1
[0059][0060][0061]
实验例2 raw264.7细胞上清no分泌量的检测：
[0062]
raw264.7细胞用dmem培养基(含10％fbs、1％双抗)，在37℃、5％co2条件下常规培养。取对数生长期细胞，制备细胞悬液，以2
×
105cells/500μl/well细胞接种于24孔板培养。细胞培养24h后加入不同浓度的组合物及对比例制得的组合物和100ng/mllps共处理24h。收取上清液低温离心后，griess法检测培养液上清中no分泌量。用dpbs缓冲液清洗raw264.7细胞后，补充培养基后以mtt法检测细胞活力。
[0063]
实验结果如图1所示，25
‑
100μg/ml浓度范围内，组合物2、3、4、7对lps诱导raw264.7细胞释放no具有不同程度的抑制作用，且呈现剂量依赖性，说明所述实施条件下的组合物具有抗炎效果。在同一浓度下，组合物效果整体优于对比例，尤其是相对于无抗炎效果的对比例1，其中以组合物7效果最优，组合物2次之。
[0064]
实验例3生物钟调节基因bmal1和per1表达量测试：
[0065]
将hacat细胞用不含血清的dmem培养基培养24h后，以pbs进行冲洗。将少量覆盖pbs的hacat细胞暴露在uvb(12.5mj/cm2)照射后，加入100μg/ml的待测样品，于37℃培养24h。同时设置不采用uvb照射和不采用所述组合物处理的正常对照组、不加所述组合物仅采用uvb照射的模型组。
[0066]
对处理后的细胞，使用rna提取试剂盒从细胞中提取rna，分别使用bmal1和per1基
因的pcr引物通过实时荧光定量pcr技术测定bmal1、per1基因的表达量。
[0067]
实验结果如图2所示，与对照组相比，hacat细胞受到uvb辐射损伤后，生物钟基因bmal1表达量上调，per1表达量降低。所述浓度下，组合物2、3、4、7可以明显促进bmal1的表达，降低per1的表达，bmal1和per1的表达量几乎可以恢复成没有uvb刺激下的正常表达量。
[0068]
实验例4彗星试验(单细胞凝胶电泳试验)：
[0069]
将hacat细胞用不含血清的dmem培养基培养24h后，以pbs进行冲洗。将少量覆盖pbs的hacat细胞暴露在uvb(12.5mj/cm2)照射后，加入100μg/ml的待测样品，于37℃培养8h。
[0070]
制备单细胞悬浮液，将其与低熔点琼脂糖混合后，涂布在cometslides
tm
载玻片上。将负载细胞的载玻片在4℃的裂解液中处理1h。将载玻片浸入电泳溶液中于50v下进行凝胶电泳，然后用蒸馏水和70％乙醇冲洗。待低熔点琼脂糖完全干燥后，用荧光染料green染色，并于荧光显微镜下观察dna损伤程度。
[0071]
实验结果如图3所示，结果显示受到辐射后的hacat细胞dna出现拖尾现象，即dna受损较严重。组合物7(50
‑
100μg/ml)处理后，拖尾程度有明显的改善，表明所述本发明植物组合物对uvb刺激引起的dna损伤具有修复能力，达到改善时钟节律紊乱的效果。
[0072]
实验例5皮肤弹性测试：
[0073]
受试者清洗双手及面部后，使用纸巾擦干皮肤水分，受试者进入测试环境(恒温恒湿环境：温度22
±
2℃，环境湿度50
±
5％rh)后，最少需休息等待20min方可进入测试。受试区域为面部颧骨部位，左、右面部随机分为样品涂抹侧和对照侧(测量区域面积为3cm
×
3cm)。
[0074]
采用接触式多参数功效性皮肤测试仪antsci callegari soft
‑
plus的弹性测试探头，测试健康人左右两侧颧骨处弹性值(值越大，说明皮肤弹性越好)，测量区域内不同位置测量3次，每次测量间隔3min，记录初始时t0数据。
[0075]
受试者使用含2％组合物7和对比例4制得的基础凝胶样品，样品的涂抹需完全覆盖测量区域，一天2次，持续28天。分别采集14天、28天时的皮肤弹性数据。
[0076]
所述基础凝胶的配方如下：
[0077]
本发明各组合物和对比例制得的植物提取物，2％；edta二钠，0.02％；卡波姆(carbopol 940polymer)，0.5％；raysoncare bhc(辛酰羟肟酸、1,2
‑
己二醇、丁二醇)，0.8％；naoh，适量；水补至100％。(上述均为质量百分比)
[0078]
实验结果：
[0079]
如图4所示，健康人颧骨处涂抹含有2％所述提取物(组合物7)的基础凝胶，皮肤弹性值随着时间变化，呈现出增长趋势，皮肤弹性在28d时较0d具有显著性差异(p<0.05)，说明所述提取物具有改善皮肤弹性的效果。
[0080]
健康人颧骨处涂抹含有2％所述提取物(组合物1
‑
6，8
‑
10)的基础凝胶，皮肤弹性值随着时间变化，呈现出增长趋势，其性能结果与组合物7接近，此处不再赘述。
[0081]
而采用涂抹含有2％所述提取物(对比例4)的结果显示，皮肤弹性值随着时间变化，基本无变化，说明对比例4制备的提取物不具有改善皮肤弹性的效果。另外，对比例1
‑
3的测试方法与性能结果与对比例4效果相当，此处不再赘述。
[0082]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述
特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本技术的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。