用于疫苗的高密度微突出物阵列贴片的制作方法

本发明涉及用于递送疫苗的微突出物阵列贴片(map)，尤其是聚合物高密度微突出物阵列贴片(hd
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map)在向患者递送疫苗中的用途，其中递送的疫苗剂量小于肌肉内注射递送的疫苗剂量(剂量节省型)，同时提供相当或更优异的免疫原性。


背景技术：

本说明书中对任何在先的公开内容(或由其衍生出的信息)或任何已知内容的引用不是并且也不应被视为承认或认可或任何形式的暗示在先的公开内容(或由其衍生出的信息)或已知内容构成本说明书所涉及的努力领域中公知常识的一部分。大多数疫苗接种仍然使用1853年发明的针头和注射器进行肌肉内注射。特别是在资源贫乏的国家，需要更有效的疫苗递送方法来实现剂量减少、廉价的、热稳定的、可自行给药的和无疼痛的疫苗接种。已经开发了用于将疫苗和药物递送到皮肤中的贴片，例如用疫苗以干法涂覆的硅微突出物皮肤贴片(fernando等，2018年)。由于皮肤具有高浓度的抗原呈递细胞，因此它是递送疫苗的理想部位(fernando，2010年)。研究表明在15μg的单剂量下观察到用硅贴片产生的免疫应答与用常规针头和注射器肌肉内注射(im)疫苗接种获得的免疫应答相似。存在各种微突出物阵列/微针阵列以及通过这些阵列施用疫苗的方法。在研发新的疫苗递送技术时的考虑因素之一是能够制造全球接种所需的百万剂量的能力。成本是考虑因素之一并且在成本方面阵列给药必须比针头和注射器给药更便宜或可相比较。已经研究了溶解型针微阵列(rouphael 2017年，hirobe 1995年)，但是这些溶解型针贴片是否能够在无菌条件下以与针头和注射器相当的数量和成本大量生产是可疑的。溶解型微针的另一个缺点是每次临床疫苗接种最少需要20分钟至6小时(取决于针头的设计)，以溶解在皮肤中。如此长的停留时间将显著地减慢大规模疫苗接种。相反，用固体惰性合成聚合物制成的贴片可以廉价地大量生产。用疫苗薄层将疫苗以干法涂覆到聚合物上，该疫苗薄层在施加后2分钟内迅速溶解在皮肤中。已经开发了将疫苗直接放置到阵列微突出物上的自动涂覆方法，使得实现了疫苗涂覆贴片的大量生产。当使用高密度微突出物阵列将疫苗递送到皮肤中存在的抗原呈递细胞(apc)时，在一些临床前模型例如小鼠中观察到与常规的针头和注射器肌肉内注射相比增强的免疫原性和剂量减少。使用干法涂覆的疫苗微突出阵列皮肤贴片在人中的剂量降低尚未得到证实。研究表明，与肌肉内注射相比，在人体中通过将液体流感疫苗经由中空微针阵列递送到皮肤，可以实现剂量减少高达5倍(van damme vaccine 2009 27p454)。剂量的减少将使得疫苗剂量在诸如因高需求而抗原供应受到限制的流行性疾病的情况下具有更大的可用性。此外，如果所需的抗原剂量减少，那么对于资源贫乏的国家来说，昂贵的疫苗诸如抗宫颈癌疫苗可以变得更实惠。需要这样的疫苗接种装置和方法，其中疫苗是稳定的并且可以以减少的剂量施用而具有与针头和注射器相同的功效。此外，需要一种用于疫苗接种的装置，该装置可以在
gmp条件下以低成本大量生产，从而避免重构并增加免疫原性的启动(onset)。除微突出物阵列贴片(map)剂量节省并且以非常经济的成本易于大量制造之外，map还具有其它优点。map干法涂覆疫苗通常比需用针头和注射器注射的液体疫苗更热稳定。


技术实现要素：

在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面试图提供一种刺激人的免疫应答的方法，该方法包括向人施用涂覆在微突出物阵列贴片(map)上的疫苗剂量的步骤。在一个实施方式中，map包括基底和从由合成聚合物制成的基底延伸的多个固体无孔突出物，其中至少一个突出物包括过渡到用疫苗以干法涂覆的末端部分的未涂覆的支撑部分。在一个实施方式中，在基底上突出物的长度为约200μm至300μm，宽度为约100μm至约120μm，突出物的密度为约1000个突出物/cm2至约5000个突出物/cm2并且map的重量在0.1克至0.6克之间。在一个实施方式中，map由合成聚合物制成。在一个实施方式中，合成聚合物是液晶聚合物。在一个实施方式中，向人施用该组合物提供了针对因人暴露于抗原来源而引起的感染的保护性免疫。在一个实施方式中，人是49岁至64岁。在一个实施方式中，人是至少65岁。在一个实施方式中，剂量是选自由0.5μg剂量、1μg剂量、2μg剂量、2.5μg剂量、3μg剂量、4μg剂量、5μg剂量、6μg剂量、7μg剂量、8μg剂量、10μg剂量、15μg剂量、20μg剂量、25μg剂量和30μg剂量组成的组的至少一个剂量。在一个实施方式中，剂量是选自由2.5μg剂量、5μg剂量、10μg剂量和15μg剂量组成的组的至少一个剂量。在一个实施方式中，疫苗剂量包括一种或更多种流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是血细胞凝集素流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是甲型流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是乙型流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是丙型流感抗原。在一个实施方式中，该方法还包括向人施用至少一个后续剂量的疫苗的步骤。在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面寻求提供一种刺激人类群体中的免疫应答的方法，该方法包括向人类群体施用疫苗剂量的步骤，该疫苗剂量被干法涂覆在微突出物阵列贴片(map)上并插入群体中的人的皮肤中，其中在施用疫苗后至少8天所测量的人类群体中的血清转化率为至少85％。在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面寻求提供一种刺激人类群体中的免疫应答的方法，该方法包括向人类群体施用疫苗剂量的步骤，该疫苗剂量被干法涂覆在微突出物阵列贴片(map)上并插入群体中的人的皮肤中，其中在施用疫苗后至少8天测量的人类群体中的血清保护率为至少95％。在一个实施方式中，疫苗剂量包括一种或更多种流感抗原。
在一个实施方式中，流感抗原是血细胞凝集素流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是甲型流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是乙型流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是丙型流感抗原。在一个实施方式中，剂量包括在2.5μg至15μg之间的血细胞凝集素流感抗原。在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面寻求提供一种刺激人类群体中的免疫应答的方法，该方法包括向人类群体施用疫苗剂量的步骤，该疫苗剂量被干法涂覆在微突出物阵列贴片(map)上并插入群体中的人的皮肤中，其中，根据施用疫苗后至少8天测量的结果，人类群体中的几何平均滴度(gmt)与相同剂量疫苗的肌肉内注射的gmt相比大至少六倍。在一个实施方式中，根据施用疫苗后至少8天测量的结果，人类群体中的gmt与相同剂量疫苗的肌肉内注射的gmt相比大约6倍至约10倍。在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面寻求提供用于刺激人的免疫应答的装置，该装置包括涂覆在微突出物阵列贴片(map)上的疫苗剂量。在一个实施方式中，map包括基底和从由合成聚合物制成的基底延伸的多个固体无孔突出物，其中至少一个突出物包括过渡到用疫苗以干法涂覆的末端部分的未涂覆的支撑部分。在一个实施方式中，在基底上突出物的长度为约200μm至300μm，宽度为约100μm至约120μm，突出物的密度为约1000个突出物/cm2至约5000个突出物/cm2并且map的重量在0.1克至0.6克之间。在一个实施方式中，map由合成聚合物制成。在一个实施方式中，合成聚合物是液晶聚合物。在一个实施方式中，向人施用该组合物提供了针对因人暴露于抗原来源而引起的感染的保护性免疫。在一个实施方式中，人是49岁至64岁。在一个实施方式中，人是至少65岁。在一个实施方式中，剂量是选自由0.5μg剂量、1μg剂量、2μg剂量、2.5μg剂量、3μg剂量、4μg剂量、5μg剂量、6μg剂量、7μg剂量、8μg剂量、10μg剂量、15μg剂量、20μg剂量、25μg剂量和30μg剂量组成的组的至少一个剂量。在一个实施方式中，剂量是选自由2.5μg剂量、5μg剂量、10μg剂量和15μg剂量组成的组的至少一个剂量。在一个实施方式中，疫苗剂量包括一种或更多种流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是血细胞凝集素流感抗原在一个实施方式中，流感抗原是甲型流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是乙型流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是丙型流感抗原。在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面寻求提供用于刺激人类群体中的免疫应答的装置，该装置包括疫苗剂量，该疫苗剂量被干法涂覆到微突出物阵列贴片(map)上，该微突出物阵列贴片被配置为插入到群体中的人的皮肤中，使得人类群体中的血清转化率是
在施用疫苗后至少8天时所测量的血清转化率的至少85％。在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面寻求提供用于刺激人类群体中的免疫应答的装置，该装置包括疫苗剂量，该疫苗剂量被干法涂覆到微突出物阵列贴片(map)上，该微突出物阵列贴片被配置为插入到群体中的人的皮肤中，使得人类群体中的血清转化率是在施用疫苗后至少8天时所测量的血清转化率的至少95％。在一个实施方式中，疫苗剂量包括一种或更多种流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是血细胞凝集素流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是甲型流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是乙型流感抗原。在一个实施方式中，流感抗原是丙型流感抗原。在一个实施方式中，剂量包括在2.5μg至15μg之间的血细胞凝集素流感抗原。在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面寻求提供用于刺激人类群体中的免疫应答的装置，该装置包括疫苗剂量，该疫苗剂量被干法涂覆在微突出物阵列贴片(map)上并插入群体中的人的皮肤中，使得，根据施用疫苗后至少8天的测量的结果，人类群体中的gmt与相同剂量疫苗的肌肉内注射的gmt相比大至少六倍。在一个实施方式中，根据施用疫苗后至少8天的测量的结果，人类群体中的gmt与相同剂量疫苗的肌肉内注射的gmt相比大约六倍至约十倍。应认识到，本发明的宽泛形式以及其相应的特征可以以结合和/或独立方式使用，并且提到单独的宽泛形式并不意味着是限制性的。此外，应认识到，可以使用该系统或装置来执行该方法的特征，并且可以使用该方法来实现该系统或装置的特征。
附图说明
现在将结合附图描述本发明的不同的实施例和实施方式，其中：图1a是聚合物微突出物阵列贴片的照片。图1b是利用喷墨涂覆方法涂覆有疫苗的聚合物阵列的微突出物的照片。图1c是微突出物阵列施加器的照片。图1d是利用施加器将微突出物阵列施加到前臂的照片。图2是涂覆有疫苗的微突出物阵列的扫描电子显微镜照片。图3a和图3b是实施例中描述的研究a和研究b的设计流程图。图4a是对于5μg剂量疫苗按μg表示的血细胞凝集素对时间的标绘图。图4b是对于15μg剂量疫苗按μg表示的血细胞凝集素对时间的标绘图。图5是血细胞凝集素抑制滴度与几种疫苗制剂的标绘图，其中名称np是指微突出物阵列真皮内给药，im是指肌肉内注射。图6是研究a中几种疫苗制剂的第1天血细胞凝集素抑制滴度与第22天血细胞凝集素抑制滴度的标绘图，其中名称np是指微突出物阵列真皮内给药，im是指肌肉内注射。图7是研究a的血细胞凝集素抑制滴度与时间的标绘图。图8是研究a在第22天的微量中和滴度的标绘图。图9是研究第1天(接种前)、第4天、第8天、第22天和第61天b部分受试者的血细胞凝集素抑制(hai)滴度的标绘图。受试者b用以下疫苗接种：a/singapore/gp1908/2015h1n1
以15μg ha/剂量、10μg ha/剂量、5μg ha/剂量或2.5μg ha/剂量通过hd
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map施加至手掌前臂(map
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fa
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15，map
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fa
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10，map
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fa
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5，map
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fa
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2.5)的方式递送；未涂覆的hd
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map(map
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fa
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0)；a/singapore/gp1908/2015h1n1以15μg ha/剂量通过hd
‑
map施加至上臂(map
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ua
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15)；或im作为四价疫苗的组分(im
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qiv
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15)注射。符号表示几何平均滴度(gmt)，误差条表示95％置信区间。图10是b部分受试者在用以下疫苗接种后第1天(接种前)和第22天的微量中和滴度的标绘图：a/singapore/gp1908/2015h1n1以15μg ha/剂量、10μg ha/剂量、5μg ha/剂量或2.5μg ha/剂量通过hd
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map施加至手掌前臂(map
‑
fa
‑
15，map
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fa
‑
10，map
‑
fa
‑
5，map
‑
fa
‑
2.5)的方式递送；未涂覆的hd
‑
map(map
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fa
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0)；a/singapore/gp1908/2015h1n1以15μg ha/剂量通过hd
‑
map施加至上臂(map
‑
ua
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15)；或作为四价疫苗的组分(im
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qiv
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15)im注射。柱表示gmt，符号表示个体受试者的滴度，误差条表示95％置信区间。图11a是ha特异性fcr
‑
结合抗体的第22天与第1天中点elisa滴度的标绘图，图11b是ha特异性fcr
‑
结合抗体的中点滴度第22天与第1天的倍数变化的标绘图。通过elisa测量与可溶性二聚重组fcγriii结合的对a/singapore/gp1908/2015单价纯化收获物特异性的抗体。符号表示第1天之前和第22天免疫后的个体应答，其中水平线表示中值响应(media response)(a)；具有误差条的柱表示带有四分位距的中值(b)。图12是唾液样本中流感特异性iga滴度的标绘图。受试者用以下任一种接种：15μg的a/singapore/gp1908/2015h1n1通过hd
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map分别递送到手掌前臂(map
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fa
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15)或上臂(map
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ua
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15)，或作为四价疫苗的组分(im
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qiv
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15)im注射或未包被的hd
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map(map
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fa
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0)。测量四个时间点：接种前(第1天)、第4天、第8天和第22天。每组在每个时间点的吸光度值被平均并且与第1天进行比较，绘制与接种前(第1天)相比的倍数变化。符号表示来自每组所有受试者的平均值，误差条表示95％置信区间。图13a至图13f是接种前和接种后记忆细胞(mbc)频率的标绘图。通过流式细胞仪在冷藏保存的pmbc样本中评估ha特异性mbc的频率。对样本进行活的cd19 、igd
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b细胞的门控并且基于与a/michigan/2015单独结合或以与a/new caledonia/1999或稳定的h1n1干细胞探针组合的方式结合来确定特异性。图13a和图13b是a/michigan/2015h1n1；图13c和图13d是a/new caledonia/1999；图13e和图13f是h1干细胞。结果在图13a、图13c和图13e中表示为第1天和第22天探针结合细胞的频率，其中符号代表第1天免疫之前和第22天免疫之后的个体应答，以及水平线表示中值响应，而第22天与基准线相比的倍数变化如图13b、图13d和图13f所示，其中柱表示中值倍数变化，误差条表示具有四分位距的中值。
具体实施方式
在一个宽泛的形式中，本发明的一个方面涉及用于递送疫苗的微突出物阵列贴片，尤其是聚合物高密度微突出物阵列在向患者递送疫苗中的用途，其中递送的疫苗剂量小于肌肉内注射递送的疫苗剂量(剂量节省型)，同时提供相当或更优异的免疫原性。本发明的装置和方法还提供了疫苗的热稳定性、易用性、可接收性以及避免疫苗的重构。流感在年龄65岁以上的成人中引起显著的发病率和死亡率并且需要提高在该年龄段中的疫苗覆盖率、免疫原性和有效性的策略。目前对于该群体的iiv需要化学佐剂如mf59或高剂量的抗原(例如60μg ha每株每剂量)以获得令人满意的免疫应答。map递送中观
察到的增强的免疫原性表明hd
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map提供了用于增加疫苗剂量的替代方法。此外，与标准制剂相比，map上疫苗的异常热稳定性将消除对冷链的依赖，并且减少由于可能的链偏移(could
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chain excursions)而造成的疫苗浪费。更稳定的疫苗也将不需要使贴片过载来补偿在疫苗保质期内丧失的效力。使用本发明的装置和方法可以增加疫苗剂量的数量，该疫苗剂量可以在一个季节或在大流行病中从最初疫苗制造设备生产，因为每剂量所需的抗原量将减少。由于从tiv制剂向qiv制剂的转变和大流行病疫苗生产依赖于剂量节省策略的实施，季节性流感生产的全球能力在2013年和2015年之间下降。剂量节省和快速启动保护性免疫对于许多具有全球健康重要性的疫苗，例如灭活脊髓灰质炎病毒疫苗或黄热病疫苗也将是一种有价值的属性，其中使用受到长期供应约束或成本限制。这些疫苗通常在低资源环境中需要，其中本发明的其它关键属性例如热稳定性、易用性、可接收性和避免重构也是有益的。本发明的装置和方法包括一种微突出物阵列贴片(map)，其中贴片具有宽度(width)w和广度(breadth)b，并且突出物经由间隔分开。突出物可以以阵列的形式提供，该阵列由微突出物沿正方形或矩形排列的规则迭代限定，但是也可以使用突出物的其它排列例如突出物的环状排列，该环状排列与旋转喷涂一致。为了进一步提高或增强靶向精度，可以将基板(substrate)设计成使得待涂覆的部件(features)位于距旋转中心点的辐射线上或位于同心圆上或位于连续的螺旋上。基板可以被设计成使得每个圆弧上的部件间隔被设计成与给定半径的电机的整数个步进相匹配。每个突出物包括用于穿透生物受试者的组织的尖端，并且突出物通常具有从基底到尖端逐渐变细的轮廓(图1a至图1d)。微突出物阵列可被划分成区域，使得不同的疫苗抗原或其它物质如赋形剂可以被涂覆在每个区域中。例如，微突出物阵列可以分成一半或分成四个相等的象限，其中可以施用不同的疫苗抗原或其它物质如赋形剂。这些区域可以具有相等数量的微突出物或不相等数量的微突出物。在其它实施方式中，一些微突出物可能未涂覆。微突出物阵列的突出物密度可以为1000个/cm2至7500个/cm2或1500个/cm2至7500个/cm2或1500个/cm2至5000个/cm2或1500个/cm2至2500个/cm2或2000个/cm2至7500个/cm2或2000个/cm2至5000个/cm2或2000个/cm2至4000个/cm2或2000个/cm2至3000个/cm2或2500个/cm2至7500个/cm2或2500个/cm2至5000个/cm2或2500个/cm2至4000个/cm2或2500个/cm2至3000个/cm2或3000个/cm2至7500个/cm2或3000个/cm2至5000个/cm2或3000个/cm2至4000个/cm2或4000个/cm2至7500个/cm2或来自4000个/cm2至5000个/cm2或5000个/cm2至7500个/cm2。本发明的施加器通常用于将高密度微突出物阵列投射(project)到皮肤中。这样的高密度阵列是具有足够尺寸和密度的微突出物阵列，使得可以手动施加的力不足以克服皮肤的弹性。突出物通常分开在10μm至200μm之间，在30μm至150μm之间，在50μm至120μm之间，更通常在70μm至100μm之间，导致贴片具有在10个突出物/mm2至1000个突出物/mm2之间并且更典型地为在1000个突出物/mm2至3000个突出物/mm2之间。突出物的长度可以是100μm至700μm或100μm至600μm或100μm至500μm或100μm至400μm或100μm至300μm或100μm至250μm或100μm至200μm或150μm至700μm或150μm至600μm或150μm至500μm或150μm至400μm或150μm至300μm或150μm至250μm或150μm至200μm或200μm至700μm或200μm至600μm或200μm至500μm或200μm至400μm或200μm至300μm或200μm至250μm或225μm至700μm或225μm至600μm或225μm至500μm或225μm至400μm或225μm至300μm或225μm至
250μm或250μm至700μm或250μm至600μm或250μm至500μm或250μm至400μm或250μm至300μm。突出物可以具有一个或多个台阶肩部(step shoulders)(不连续部)。在提供不连续部的情况下，这通常定位成使得至少一个不连续部到达真皮，突出物的穿透停止，尖端延伸到真皮层中。典型地，不连续部位于距尖端的端部在50μm至200μm处，在50μm至190μm之间，在50μm至180μm之间，在50μm至170μm之间，在50μm至160μm之间，在50μm至150μm之间，在50μm至140μm之间，在50μm至130μm之间，在50μm至120μm之间，在50μm至110μm之间，在50μm至100μm之间，在50μm至90μm之间，在50μm至80μm之间，在60μm至200μm处，在60μm至190μm之间，在60μm至180μm之间，在60μm至170μm之间，在60μm至160μm之间，在60μm至150μm之间，在60μm至140μm之间，在60μm至130μm之间，在60μm至120μm之间，在60μm至110μm之间，在60μm至100μm之间，在60μm至90μm之间，在60μm至80μm之间，在70μm至200μm处，在70μm至190μm之间，在70μm至180μm之间，在70μm至170μm之间，在70μm至160μm之间，在70μm至150μm之间，在70μm至140μm之间，在70μm至130μm之间，在70μm至120μm之间，在70μm至110μm之间，在70μm至100μm之间，在70μm至90μm之间，在70μm至80μm之间，在80μm至200μm处，在80μm至190μm之间，在80μm至180μm之间，在80μm至170μm之间，在80μm至160μm之间，在80μm至150μm之间，在80μm至140μm之间，在80μm至130μm之间，在80μm至120μm之间，在80μm至110μm之间，在80μm至100μm之间，在80μm至90μm之间，在90μm至200μm处，在90μm至190μm之间，在90μm至180μm之间，在90μm至170μm之间，在90μm至160μm之间，在90μm至150μm之间，在90μm至140μm之间，在90μm至130μm之间，在90μm至120μm之间，在90μm至110μm之间，在90μm至100μm之间，在100μm至200μm处，在100μm至190μm之间，在100μm至180μm之间，在100μm至170μm之间，在100μm至160μm之间，在100μm至150μm之间，在100μm至140μm之间，在100μm至130μm之间，在100μm至120μm之间，在100μm至110μm之间。不连续部可以提供用于使药物/疫苗/赋形剂更多地负载到微突出物上。微突出阵列可以由任何合适的材料制成，包括但不限于金属、硅、聚合物和塑料。聚合物和塑料是优选的材料，包括但不限于液晶聚合物。一些实施方式的微突出物阵列的总质量为大约0.3gm。微突出阵列可以具有贴片的总体微弱凸形形状，以改善与皮肤的机械接合并且减轻高速波纹应用的影响：“高速/低质量”的系统。微突出物阵列可以具有小于1克，或小于0.9克或小于0.8克或小于0.7克，或小于0.6克或小于0.5克或小于0.6克，或小于0.5克或小于0.4克或小于0.3克或小于0.2克或小于0.1克或小于0.05克的质量。微突出物阵列可以具有约0.05克至约2克，或约0.05克至约1.5克或约0.05克至约1.0克或约0.05克至约0.9克，或约0.05克至约0.8克或约0.05克至约0.7克或约0.05克至约0.6克或约0.05克至约0.5克或约0.05克至约0.4克，或约0.05克至约0.3克或约0.05克至约0.2克，或约0.05克至约0.1克或约0.1克至约1.0克或约0.1克至约0.9克，或约0.1克至约0.8克或约0.1克至约0.7克，或约0.1克至约0.6克或约0.1克至约0.5克或约0.1克至约0.4克，或约0.1克至约0.3克，或约0.1克至约0.2克的质量。在施加器/微突出物系统的一个实施方式中，阵列的质量为约0.3克，阵列由施加器以约20m/s至26m/s的速度投射。在一些实施方式中，可以将多于一个的涂层施加到相同的突出物上。例如，如果层依次溶解，不同的涂层可以被施加在一个或多个层中，以提供用于在相同的时间或不同的时间递送到对象内的组织的相同或不同的材料。在本发明的装置和方法中使用的抗原的量包括用于提供免疫应答所需的量。剂量
可以是0.1μg剂量，0.5μg剂量，1μg剂量，2μg剂量，2.5μg剂量，3μg剂量，4μg剂量，5μg剂量，6μg剂量，7μg剂量，8μg剂量，9μg剂量，10μg剂量，15μg剂量，20μg剂量，25μg剂量和30μg剂量。剂量可以在约1μg至约100μg之间，在约1μg至约75μg之间，在约1μg至约50μg之间，在约1μg剂量到约25μg之间，在约1μg至约15mg之间，在约1μg至约10μg之间，在约1μg至约5μg之间，在约2.5μg至约100μg之间，在约2.5μg至约75μg之间，在约2.5μg至约50μg之间，在约2.5μg剂量到约25μg之间，在约2μg至约15μg之间，在约2.5μg至约10μg之间，在约2.5μg至约5μg之间，在约5μg至约100μg之间，在约5μg到约75μg之间，在约5μg到约50μg之间，在约5μg剂量到约25μg之间，在约5μg到约15μg之间，在约5μg到约10μg之间，在约10μg到约100μg之间，在约10μg到约75μg之间，在约10μg到约50μg之间，在约10μg剂量到约25μg之间，在约10μg到约15μg之间，在约15μg至约100μg之间，在约15μg到约75μg之间，在约15μg到约50μg之间，在约15μg剂量到约25μg之间，在约20μg到约100μg之间，在约20μg到约75μg之间，在约20μg到约50μg之间，在约20μg剂量到约25μg之间的范围内。每个剂量可以包括多种抗原或多种物质。在优选实施例中，微突出物阵列的微突出物通过无菌打印头型装置涂覆，该无菌打印头型装置快速提供小液滴，该小液滴在微突出物上快速干燥。在优选的实施方式中，诸如疫苗制剂的涂层在微突出物的顶部快速干燥，以增加可以被递送的疫苗的量(图2)。无菌打印头装置可以按顺序地或以交替的方式将多个液滴递送到微突出部。当使用较小剂量的疫苗时，与常规的针头和注射器肌肉内(im)注射相比，本发明的装置和方法利用map疫苗递送至皮肤提供了相当或更优异的抗体滴度。因此，本发明的装置和方法利用map疫苗递送到皮肤提供了与常规的针头和注射器肌肉内(im)注射相比减少多倍剂量。本发明的装置和方法提供了与im注射相比在1.1倍至100倍或1.1倍至50倍或1.1倍至25倍或1.1倍至20倍或1.1倍至15倍或1.1倍至10倍或1.1倍至5倍或1.5倍至100倍或1.5倍至50倍或1.5倍至25倍或1.5倍至20倍或1.5倍至15倍或1.5倍至10倍或1.5倍至5倍或2倍至100倍或2倍至50倍或2倍至25倍或2倍至20倍或2倍至15倍或2倍至10倍或2倍至5倍或3倍至100倍或3倍至50倍或3倍至25倍或3倍至20倍或3倍至15倍或3倍至10倍或3倍至5倍或4倍至100倍或4倍至50次或4倍至25倍或4倍至20倍或4倍至15倍或4倍至10倍或4倍至5倍或5倍至100倍或5倍至50次或5倍至25倍或5倍至20倍或5倍至15倍或5倍至10倍之间的疫苗减少。map疫苗递送优于针头和注射器的其它优点是：由于疫苗是干法涂覆在map上的，因此其更耐高温，并且也不会留下有害废物。当被干法涂覆在hd
‑
map上贮存在至高40℃的温度下时，流感疫苗稳定至少12个月。这在难以维持冷链的资源贫乏国家尤其有帮助。另一优点是map微突出物对于肉眼来说是不可见的，因此在给害怕针头的人和儿童接种疫苗时将是非常有价值的。hd
‑
map中较高密度的微突出物在疫苗接种期间在皮肤中诱导较高危险信号，这可能导致物理佐剂(physical adjuvantation)和增强免疫原性。与在同一时间点测量的常规针头和注射器im注射相比，本发明的装置和方法利用map疫苗递送至皮肤提供了更高的抗体几何平均滴度(gmt)。本发明的装置和方法提供了与im注射相比在gmt方面在2倍至500倍或2倍至100倍或2倍至50倍或2倍至25倍或2倍至20倍或2倍至15倍或2倍至10倍或2倍至5倍或5倍至500倍或5倍至100倍或5倍至50倍或5倍至25倍或5倍至20倍或5倍至15倍或5倍至10倍或10倍至500倍或10倍至100倍或10倍至50倍或10倍至25倍或10倍至20倍或10倍至15倍或20倍至500倍或20倍至100倍或20倍至50倍或20倍
至25倍或50倍至500倍或50倍至100倍之间的增加。与常规的针头和注射器im注射相比，利用map疫苗递送到皮肤在疫苗接种后抗体的检测发生得更快。本发明的装置和方法在采用相对低剂量的抗原的群体中提供对传染性病原体(例如流感)的保护性免疫应答。血清应答是指hai抗体滴度增加至少四倍，其中疫苗接种后最小滴度为40。血清保护是指在疫苗接种前滴度小于40的受试者之间达到疫苗接种后hai最小滴度为40。抗ha抗体应答的血清转化率定义为每组中具有保护性接种后滴度≥1:40的受试者的比例。血清保护率是疫苗接种前hai滴度＜1:10并且疫苗接种后≥1:40的受试者的百分比。然而，如果初始滴度为≥1:10，则需要在疫苗接种后抗体量增加至少四倍。在本发明的另一方面，提供了如本文所要求保护的组合物、方法或用途，其中通过施用本发明的组合物所产生的免疫应答以剂量依赖性的方式在大多数老年人受体中诱导功能性(hai)抗体。在某些实施方式中，组合物将在7天或14天或28天之后诱导滴度大于约50的中和抗体应答。在其它实施方式中，组合物将在7天或14天或28天之后诱导滴度大于约100的中和抗体应答。在其它实施方式中，组合物将在7天或14天或28天之后诱导滴度大于约150的中和抗体应答。在其它实施方式中，组合物将在7天或14天或28天之后诱导大于约200的中和抗体应答。因此，在本发明的一个方面，提供了如本文所要求保护的组合物、方法或用途，其中通过在群体中施用组合物所产生的免疫应答满足或超过以下标准之一：
·
血清转化率大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％或大于85％、大于90％、大于95％或大于99％。
·
血清保护率大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％或大于85％、大于90％、大于95％或大于99％。
·
在疫苗接种之后中和抗体滴度平均增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大。当提到施用于人的疫苗组合物的量时，“有效量”是指当施用于受试者时其量足以产生治疗效果的组合物的量或剂量(例如，足以刺激受试者的免疫应答的量，足以提供受试者保护性免疫的量)。疫苗组合物可以单独施用或作为与常规赋形剂的混合物施用，该赋形剂例如药学上或生理学上可接收的有机或无机载体物质，其不会与疫苗组合物发生有害反应。稳定疫苗组合物的物质可以用于疫苗组合物中。虽然常规疫苗可能含有佐剂来增强免疫应答，但本发明的制剂优选在没有佐剂的情况下使用。施用于受试者的剂量和频率(单剂量或多剂量)可以根据各种因素而变化，包括例如在暴露于抗原之后的感染之前：受试者的健康状况、体重、人体质量指数和饮食或与健康相关的问题。其它治疗方案或药剂可以与本发明的方法和组合物、蛋白质或多肽组合使用。该组合物可以以单剂量或多剂量例如至少两个剂量施用于人。当对受试者施用多剂量时，第二剂量或第三剂量可以在初始剂量后的数天(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天)、数周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周)、数月(例如1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月)或数年(例如1年、2年、3年、4
年、5年、6年、7年、8年、9年、10年)被施用。例如，在施用包括融合蛋白的组合物的第一剂量后约7天、约14天或约28天可以施用组合物的第二剂量。在本文中范围可以表达为从约一个特定值和/或到约另一个特定值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当数值被表示为近似值时，通过使用有关的前题，其应被理解为，该特定值形成了另一方面。还应理解的是，每个范围的端值相对于另一端值都是重要的(significant)并且独立于另一个端值。实施例实施例1试验对象和研究设计总共二百一十名(210)健康受试者(年龄为18岁至50岁，bmi为18kg/m2至30kg/m2)被招募用于该研究，其中至少30％是男性并且至少30％是女性。a部分：六十名(60)健康受试者(4个组：15名/组)；b部分：一百五十名(150)健康受试者(7个组：20名/组，加上2个组：5名/组，进行皮肤穿刺活组织检查)。研究设计如图3a和图3b所示。除这些组之外，在b部分研究中，另外10名受试者被招募进行疫苗接种部位的活组织检查。下面描述的实施例分为两部分进行。该研究是在nucleus network私人有限公司(pty ltd)(melbourne，vic)进行的两部分随机化、部分双盲、安慰剂对照试验。主要目的是与递送大致相同剂量a/sing ha蛋白的四价季节性流感疫苗(qiv)的未包被hd
‑
map和im注射相比来测量由hd
‑
map递送的a/singapore/gp1908/2015h1n1(a/sing)单价疫苗的安全性和耐受性。试验结果为：与每株15μg ha标准剂量的a/sing的im给药相比，以4个剂量水平的a/sing评估对hd
‑
map施用于前臂的免疫应答，以及通过附加的测定法以及通过hd
‑
map给药部位的穿刺活组织检查来评估局部皮肤应答来评估免疫应答的进一步测量。在所有实验中，一旦受试者接种疫苗，在接种前(第1天)和接种后(第4天、8天、22和61天)采集其血液进行分析。由4个组每组各15名受试者组成的第一部分(a)接种下列之一：1)没有任何抗原的map对照组(a
‑
map
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fa
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0)施加于手掌前臂；2)map a/singapore/gp1908/2015[h1n1]，每剂量15μg血细胞凝集素[ha]，施加于前臂(a
‑
map
‑
fa
‑
15)；3)15μg相同的h1n1 ha抗原肌肉内注射(im)到三角肌(a
‑
im
‑
asing15)；4)含有15μg相同h1n1 ha抗原的四价疫苗2017/18(seqirus
tm
；美国)，与附加的3株流感抗原肌肉内注射(im)到三角肌(a
‑
im
‑
qiv
‑
15)中。在实验的第一部分中，通过elisa和血细胞凝集素抑制(hai)试验测量第1天、第22天的抗体应答。在评估(a)部分研究结果之后进行实验的第二部分(b)。研究的第二部分由7个组每组各20名受试者组成。五个组接种a/singapore/gp1908/2015(h1n1)，其利用map按递减剂量(15μg、10μg、5μg、2.5μg和0μg的ha)将a/singapore/gp1908/2015(h1n1)施加于前臂(分别为map
‑
fa
‑
15、map
‑
fa
‑
10、map
‑
fa
‑
5、map
‑
fa
‑
2.5和map
‑
fa
‑
0)。一个附加的组利用map将15μg ha接种在覆盖三角肌的上臂中(map
‑
ua
‑
15)。最后一组接种含有15μg相同的h1n1 ha抗原的quad 2018(seqirus
tm
；澳大利亚)肌肉内注射(im)到三角肌中(im
‑
qiv
‑
15)。利用血细胞凝集素抑制(hai)试验和病毒微量中和试验(vmn)(仅第1天和第22天)测量在疫苗接种后第1天(接种前)、第4天、第8天、第22天和第61天的抗体应答。在疫苗接种后第1天、第4天、第8天、第22天还采集唾液。利用elisa分析唾液样本来确定流感抗原特异性分泌型iga。
缩写：a/sing＝裂解灭活的a/singapore/gp1908/2015(h1n1)病毒的血细胞凝集素。im 15μg quad＝含有15μg的a/sing ha抗原的quad 2018疫苗(seqirus
tm
；澳大利亚)肌肉内注射(im)到三角肌中。sd＝标准偏差；n＝北，e＝东，s＝南，w＝西实施例2微突出物阵列贴片(map)在本研究中所使用的map是10mm
×
10mm的正方形，其包含大约3136个微突出物，密度为5000/cm2。每个微突出物在基底上的长度为约250μm，宽度为约120μm，并且逐渐变细到小于25μm的尖端(图2)。使用“直接喷射”工艺164(vaxxas私人有限公司，澳大利亚)将疫苗无菌地施加于163个经γ辐照(≥25kgy，steritech，澳大利亚)的hd
‑
map的尖端，使得各个液滴沉积到每个突出物的顶端上。生产hd
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map用于递送两种不同剂量(2.5μg和5.0μg)的a/sing(称作2.5μg hd
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map和5μg hd
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map)以及未涂覆的hd
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map(安慰剂)。涂覆后，hd
‑
map被放置于铝制医药容器(amcor，英国)中，箔密封，并且在2℃至8℃下用干燥剂贮存直到使用。抗原涂覆的hd
‑
map在制造6个月内使用。用手持弹簧装置施加器将map施加到皮肤上，该手持弹簧装置施加器以20m/s
±
2m/s的速度射出贴片，微突出物穿透表皮和真皮，平均深度为约125μm。合成聚合物map通过注射模塑制造。聚合物材料的选择基于聚合物形成微突出物的能力、聚合物能有效渗透皮肤的硬度，合适的聚合物延展性、与γ辐照灭菌的材料相容性以及当与皮肤组织接触时合成聚合物的生物相容性。实施例3疫苗cgmp灭活的裂解流感a/singapore/gp1908/2015(h1n1)，(ivr
‑
180a)病毒疫苗从澳大利亚seqirus私人有限公司(单价联合收获(monovalent pooled harvest)(mph))购得。为了确保血细胞凝集素(ha)抗原在map涂覆过程中以及随后的贮存中保持效力，向疫苗溶液添加稳定赋形剂磺丁醚
‑
β
‑
环糊精(sulphobutyl ether beta cyclodextrin)(sbecd，cydex pharmaceuticals，美国堪萨斯州)与map一起使用。将4.8mg/ml ha与小体积40％w/v sbecd溶液(在冲洗用水中，baxter)混合，以达到2％w/v的具有a/singapore的sbecd溶液(涂覆溶液)。对于单价a/singapore im注射剂，用经ph测试的无菌生理盐水稀释抗原制剂。对于四价疫苗im注射剂，使用可商购的疫苗。在研究的第一部分中，使用来自美国seqirus
tm
的四价流感疫苗2017
‑
2018(northern hemisphere)。对于b部分，使用四价流感疫苗2018(southern hemisphere)。quadrivalent northern hemisphere 2017/18疫苗含有标称15μg的各个下列裂解的灭活病毒类型的ha：a/singapore/gp1908/2015(h1n1)，ivr
‑
180a；a/hong kong/4801/2014(h3n2)，nymc x
‑
263b；b/phuket/3073/2013bvr
‑
1b；以及b/brisbane/46/2015。quad southern hemisphere 2018疫苗含有标称15μg的各个下列裂解的灭活病毒类型的ha：a/michigan/45/2015(h1n1)pdm09样病毒(a/singapore/gp1908/2015(ivr
‑
180a))；a/singapore/infimh
‑
16
‑
0019/2016(h3n2)样病毒(a/singapore/infimh
‑
16
‑
0019/2016(ivr
‑
186))；b/phuket/3073/2013样病毒(b/phuket/3073/2013(bvr
‑
1b))；以及
scientific)封闭。将板在37℃孵育1小时，然后用pbst洗涤。添加fcγriiia val 158胞外域生物素二聚体(0.1μg/ml)并且在37℃孵育1小时，然后用pbst洗涤。利用1:10000稀释的链霉亲和素
‑
hrp(thermofisher scientific)和3,3
′
,5,5
′‑
四甲基联苯胺底物(sigma
‑
aldrich，美国)的显影来检测抗体
‑
fcγriiia复合物。用0.16m h2so4终止反应，在450nm处测量吸光度。利用拟合曲线(4参数对数回归)和graphpad prism(graphpad software，美国)测量给出的半峰信号(half
‑
maximal signal)(ec50)的血清浓度。实施例5唾液iga在第1天、第4天、第8天、第22天从map
‑
fa
‑
0组、map
‑
fa
‑
15组、map
‑
ua
‑
15组和im
‑
qiv
‑
15组的受试者中采集唾液样本。受试者咀嚼唾液采集器(sarstedt，france)的棉签大约1分钟。随后进行离心，上清液(唾液)在
‑
80℃贮存。通过elisa检测流感特异性iga。具体而言，将在4mg/ml bsa中在pbs(pbsa)中连续稀释的唾液样本添加到nunc maxisorp板(thermofisher scientific，美国)中，该nunc maxisorp板预先用a/singapore/gp1908/2015ha mph(60μl/孔，按2μg/ml浓度)涂覆过夜并且用pbsa封闭。利用hrp
‑
1偶联的山羊抗人多克隆iga(pa1
‑
74395，thermofisher scientific，美国)和abts 232底物(sera
‑
care，美国)检测a/sing ha特异性iga的存在。用1％sds终止反应，在405nm处测量吸光度。实施例6记忆b细胞在第1天和第22天从map
‑
fa
‑
0组、map
‑
fa
‑
15组、map
‑
ua
‑
15组和im
‑
qiv
‑
15组的受试者中采集外周血单核细胞(pbmc)并且冷藏保存并且贮存在液氮237中直到使用。用作a/michigan/45/2015、a/new caledonia/20/1999和稳定的h1n1干结构域(stem domain)的流式细胞术探针的重组ha蛋白如先前报道的那样衍生(23)。通过与sa
‑
pe、sa
‑
apc或sa
‑
ax488(thermofisher scientific)偶联的ha探针共染色，在冷藏保存的人pbmc中鉴定ha特异性b细胞。用于表面染色的单克隆抗体包括：cd19
‑
ecd(j3
‑
119)(beckman coulter，美国)、igm
‑
buv395(g20
‑
127)、cd21
‑
buv737(b
‑
ly4)、igd
‑
cy7pe(ia6
‑
2)、igg
‑
bv786(g18
‑
145)(bd 243biosciences，美国)、cd14
‑
bv510(m5e2)、cd3
‑
bv510(okt3)、cd8a
‑
bv510(rpa
‑
t8)、cd16
‑
bv510(3g8)、cd10
‑
bv510(hi10a)、cd27
‑
bv605(biolegend，美国)和iga
‑
vio450(rea1014)245(miltenyi，美国)。与sa相互作用的背景b细胞通过用sa
‑
bv510(bd 246biosciences)染色排除。使用aqua live/dead胺活性染料(thermofisher scientific)评估细胞活力。利用配置为检测18种荧光染色剂的bd fortessa采集样本并且利用flowjo软件9.5.2版本(treestar，美国)进行分析。实施例7t细胞的流式细胞术利用landry等(24)描述的方法的修饰来评估cd4 t细胞和cd8 t细胞产生的细胞因子。解冻pbmc，以1.5
×
106/孔铺板并且静置6小时。洗涤后，用a/sing mph刺激pbmc持续20小时(20μg/ml)或用跨越a/sing ha序列(mimotopes私人有限公司，澳大利亚)的重叠合成肽库(17个氨基酸长度与11个氨基酸重叠，5μg/ml)刺激pbmc持续6小时。仅培养基和佛波酯/离子霉素(pma/ionomycin)分别用作阴性和阳性对照。在孵育结束前5小时添加golgi阻
断剂(莫能菌素和brefeldin a)。用表面染色剂live/dead aqua(为了活力)、抗cd3 bv785、抗cd4 fitc、抗cd8 apc/cy7(全部来自生物烯烃)标记细胞，然后用抗ifn
‑
γax647、抗tnf
‑
αbv421和抗il
‑
2pe(全部来自biolegend)固定、渗透和标记细胞。在最后洗涤步骤的24小时内在becton dickinson lsr fortessa x20上分析样本。获得大约500000个结果(events)，并且在利用spice(http://exon.niaid.nih.gov/spice)软件分析背景减除值(background
‑
subtracted values)之前，最初使用flowjo(以获得每个细胞因子的百分比正值)分析原始数据。实施例8热稳定性涂有a/sing的hd
‑
map贮存在2℃至8℃，25℃
±
2℃/60％
±
5％相对湿度(rh)和40℃
±
2℃/60％
±
5％rh保持12个月。在指定的时间点，利用20℃至28℃的水浴超声处理在1ml洗脱缓冲液(0.041％w/w羟丙甲纤维素，0.0295％w/w海藻糖二水合物)中从hd
‑
map中洗脱涂层并且通过酶免疫分析法确定ha的效力(bodle等，2003)。实施例9统计分析利用t检验(student
′
s t
‑
test)在组之间比较hai滴度和mn滴度的倍数增加。利用具有连续性校正的皮尔逊卡方检验(pearson
′
s chi
‑
square test)(sas 9.4版本，sas institute inc.，美国)在组之间比较血清保护或血清转化的受试者的比例。由于这是早期研究，对于adcc和记忆b细胞应答试验，不调整探索性效力分析，利用kruskal wallis非参数检验(多次比较无校正)和dunn’s多次比较后检验(dunn’s multiple comparison post
‑
tests)比较所有组。利用wilcoxon秩和检验(wilcoxon rank sum test)进行第1天和第22天由cd4

细胞所产生的细胞因子的组内比较。结果稳定性为了在临床制造之前获得稳定性数据，进行glp稳定性研究：测试将5μg和15μg ha a/sing负载于hd
‑
maps上。选择该负载范围以支撑用于研究的ha a/sing负载范围。每hd
‑
map以5μg和15μg涂覆有a/sing抗原在2℃至8℃或40℃贮存至少12个月时是稳定的(图4)。血清学反应图5示出a部分中的受试者在第1天、第4天、第8天、第22天和第61天的hai抗体的几何平均滴度(gmt)。上述数据证明，通过map递送到皮肤的2.5μg诱导的hai滴度与通过利用针头和注射器本身或作为四价疫苗的一部分递送的15μg a/singapore ha诱导的hai滴度在统计学上无差异。与15μg剂量通过肌肉内方式递送到人体中相比，当使用map时抗原的剂量减少了6倍。剂量降低到2.5μg以下并且仍然保持与肌肉内注射相当的抗体滴度是可行的。虽然在用于map的小鼠模型中已经示出剂量减少，但这在人类中是首次示出。在第22天时间点观察到在疫苗接种的组之间无统计学显著差异。图6是研究a中几种疫苗制剂在第1天与第22天的血细胞凝集素抑制滴度的标绘图。图7是研究a的血细胞凝集素抑制滴度对时间的标绘图。图8是研究a的第22天微量中和滴度的标绘图。
[0125]
表1中示出hai gmt、血清保护率和血清转化率以及gmt滴度的倍数增加，其示出b部分在血清保护率、血清转化率和gmt的倍数增加方面血细胞凝集素抑制对疫苗接种响应
高于疫苗接种前水平。表1
*表示p 442＜0.05和**表示p＜0.01，通过t检验(student
′
s t
‑
test)(倍数增加和gmt)与im
‑
qiv
‑
15组相比较并且利用具有443连续性校正的皮尔逊卡方检验比较血清转化或血清保护的受试者的比例。b部分中的受试者在第1天、第4天、第8天、第22天和第61天的hai抗体的几何平均滴度(gmt)如图9所示。在接收未涂覆hd
‑
map的受试者中，hai滴度没有增加。在通过hd
‑
map或im接收疫苗的受试者中，滴度在第4天没有增加超过基准线，但是第8天在map
‑
fa
‑
10组(gmt 437，254
‑
751 95％ci)、map
‑
ua
‑
15组(gmt 243，133
‑
442 95％ci)和map
‑
fa
‑
15组(gmt 219，112
‑
427 95％ci)中gmt最高。第8天gmt滴度从基准线的增加(map
‑
fa
‑
10p＝0.0002，map
‑
ua
‑
15p＝0.0167，map
‑
fa
‑
15p＝0.0384)明显高于im
‑
qiv
‑
15组(gmt 83，42
‑
161 95％ci)。滴度在所有活性组中持续增加直到第22天，并且保持显著高于im
‑
qiv
‑
15组、在第22天map
‑
fa
‑
10组和map
‑
ua
‑
15组(分别p＝0.0011和p＝0.0201)、在第61天map
‑
fa
‑
10组和map
‑
ua
‑
15组中(p＝0.0062和p＝0.0277)。map
‑
fa
‑
2.5组中的gmt(接收1/6标准剂量ha的受试者)与im
‑
qiv
‑
15组中的gmt在任何时间点上(第4天p＝0.4034；第8天p＝0.7449；第22天p＝0.9312，第61天p＝0.7297)无显著差异。此外，在第22天hai 405gmt在map
‑
fa
‑
15组(gmt 320，161
‑
638 95％ci)和map
‑
ua
‑
15组(gmt 368，198
‑
683 95％ci)中相似，表明施用hd
‑
map的位点不影响随后的抗体应答。与im
‑
qiv
‑
15组(1.0)相比(分别为p＝0.0069和p＝0.0095 431)，第8天在map
‑
fa
‑
10组和map
‑
ua
‑
15组430(分别为22.6和18.4)中gmt的429倍增加显著更高，表明与im注射相比抗体应答更迅速。在map
‑
ua
‑
15组中在第22天和第61天从基准线的432倍变化保持显著更高433(分别p＝0.0240和p＝0.0265)。在接收由hd
‑
map递送的疫苗的a部分的受试者中观察到的hai滴度与b部分的相应的组的hai滴度在任何时间点上无显著差异(即a
‑
map
‑
fa
‑
15与map
‑
fa
‑
15相比，所有p值均＞0.4180)，表明抗体递送和诱导的一致性。由a部分和b部分中im
‑
qiv
‑
15诱导的gmt在第4天、第8天、第22天也无显著差异，但在第61天部分a中的gmt更高
(p＝0.0320)。在第1天(疫苗接种前)和第22天对来自所有b部分受试者的血清样本进行mn试验。与hai抗体一样，在接收疫苗的所有治疗组中，滴度从第1天增加到第22天(图10)。第22天map
‑
fa
‑
10组和map
‑
ua
‑
15组中的mn滴度明显高于im
‑
qiv
‑
15组(分别为p＝0.0005和p＝0.0096)。与hai结果一样，第22天mn gmt在map
‑
fa
‑
2.5组(1/6剂量)(gmt 5,301,2,509
‑
11,196 95％ci)与im
‑
qiv
‑
15组(gmt 3,880 1,924
‑
7,824 95％ci)相似(图10)。在第1天和第22天测定能介导adcc的ha特异性fcr结合抗体的滴度。疫苗递送后，中点滴度在map
‑
fa
‑
15组、map
‑
fa
‑
0组、map
‑
ua
‑
15组和im
‑
qiv
‑
15组(分别为p＜0.001，p＜0.001，p＝0.002)显著增加，但在map
‑
fa
‑
0组(p＞0.99)无显著增加(图x3a)。在第22天这三个活性组的中点滴度之间无显著差异(对于全部比较而言p＞0.99)，当结果表示为从基准线的倍数变化时，由于组内变化的程度也无差异(图11)。通过在第1天、第4天、第8天、第22天从map
‑
fa
‑
0组、map
‑
fa
‑
15组、map
‑
ua
‑
15组和im
‑
qiv
‑
15组受试者中采集的样本中进行elisa测定唾液中的流感特异性iga。第1天在任何一组中的滴度无显著增加。然而，第8天map
‑
fa
‑
15组和map
‑
ua
‑
15组比基准线增加1.92倍和1.57倍，而相同时间点的map
‑
fa
‑
0组(1.01倍)无增加以及im
‑
qiv
‑
15组增加1.22倍。iga滴度在第22天恢复到接近基准线的水平(图12)。利用荧光标记的重组ha的基于流式细胞术测定法来评估免疫后ha特异性b细胞的频率和特异性。在用qiv或活性hd
‑
map(map
‑
fa
‑
15p＜0.0001，map
‑
ua
‑
15p＜0.0001和im
‑
qiv
‑
15p＜0.0001，但并非安慰剂组(map
‑
fa
‑
0p＜0.0001))免疫后第22天，与ha
‑
michigan探针结合的记忆b细胞(mbc)的频率提高。在第22天ha
‑
michigan
‑
特异性mbc的频率在三个疫苗接种组中无显著差异(对于全部比较而言p＞0.99)。利用与a/new caledonia/99探针的结合来评估h1n1交叉反应性，仅小部分a/michigan/15
‑
结合细胞显示ha的交叉反应性识别。在第1天和第22天之间在map
‑
fa
‑
15组(p＜0.0001)和map
‑
ua
‑
15(p＜0.0001)组中的频率显著增加，im
‑
qiv
‑
15组中的频率增加程度较小(p＝0.0522)。同样，在第22天疫苗接种组中mbc频率无差异(对于全部比较而言p＜0.99)。用结合ha颈部结构域探针(ha
‑
stalk domain probe)的交叉反应性b细胞观察到类似的模式。第1天到第22天map
‑
fa
‑
15组(p＝0.006)和im_qiv
‑
15组(p＝0.468)从有显著的扩展。map
‑
ua
‑
15组中的扩增未达到显著性，可能是由于组内变异性(p＝0.167)。在第22天活性hd
‑
map组和im组之间的颈部反应性mbc频率无差异(对于全部比较而言p＞0.99)。图13a至图13f通过分析在第1天和第22天从map
‑
fa
‑
0组、map
‑
fa
‑
15组、map
‑
ua
‑
15组以及im
‑
qiv
‑
15组的受试者中收获pbmc中的流感特异性cd4 和cd8 t细胞所产生的ifn
‑
γ、il
‑
2和tnf
‑
α的频率来评估t细胞应答。用a/sing mph或跨越a/sing ha序列的536个重叠肽刺激pbmc。与第1天相比，在第22天在map
‑
fa
‑
15组、map
‑
ua
‑
15组和im
‑
qiv
‑
15组但并非map
‑
fa
‑
0组中在用肽体外刺激后，cd4 细胞产生ifn
‑
γ、il
‑
2或tnf
‑
α的的总频率增加(图8a)。尤其地，第22天与第1天相比对于map
‑
fa
‑
15组(p＝0.0002)、map
‑
ua
‑
15组(p＝0.0045)和im
‑
qiv
‑
15组(p＝0.0110)表达全部三种细胞因子(ifn
‑
γ，tnf
‑
α和il
‑
2)的多功能cd4 t细胞的丰度显著增加。map
‑
fa
‑
15组(p＝0.0008)、map
‑
ua
‑
15组(p＝0.0003)和im
‑
qiv组(p＝0.0012)中产生tnf
‑
α和il
‑
2的cd4 细胞也有显著增加。map
‑
fa
‑
15组还显示单独表达tnf
‑
α
(p＝0.0053)以及表达tnf
‑
α与ifn
‑
γ(p＝0.0013)的cd4 细胞显著增加(图8a)。当map
‑
fa
‑
15组、map
‑
ua
‑
15组和im
‑
qiv
‑
15组相互比较时，在第22天产生任何细胞因子组合的cd4 t细胞的比例在统计学上无显著差异(对于全部比较而言p>0.0565)。与用重叠肽相比，在用a/sing mph刺激后疫苗接种前和疫苗接种后产生细胞因子的cd4 细胞的总频率更高，推测是由于mph制剂中存在更多的抗原决定簇。与肽刺激相比，a/sing mph刺激似乎诱导更多的单独产生tnf
‑
α的cd4 细胞。然而，当map
‑
fa
‑
15组、map
‑
ua
‑
15组和im
‑
qiv
‑
15组相互比较时，在第22天产生各种细胞因子组合的cd4 t细胞的比例统计学上无任何显著差异(对于全部比较而言p>0.0515)。还测量了第1天和第22天cd8 t细胞对肽库和a/sing mph的应答，但是与cd4 应答相比较弱。考虑到用于再刺激的抗原(灭活的、裂解的a/sing mph和17个氨基酸肽)的性质有利于刺激和检测cd4 t细胞，弱cd8 t细胞应答并不令人惊奇。本研究证明map剂量在临床上是节省的。hd
‑
map的安全性和反应原性特征与利用相似h1n1抗原a/california/7/2009(3，18)的硅纳米贴片观察到的那些特征非常相似，并且疫苗接种后7天红斑仍然存在的事实也与真皮内(id)递送流感疫苗一致。在hd
‑
map施用于前臂的上臂或掌面后，发现hai或mnt应答无差异。就血清保护和血清转化的受试者的比例而言，在本研究中由hd
‑
map递送诱导的hai应答与先前用针头和注射器id注射灭活流感疫苗(iiv)所见的应答类似。然而，除非用局部佐剂咪喹莫德(tlr7激动剂(34))预处理id注射位点，否则在用id注射iiv中没有观察到如在早期第8天时间点更高的hai滴度所表明的用hd
‑
map递送观察到的更快速的抗体应答。通过使用hd
‑
map递送季节性流感疫苗或旅行疫苗在疫苗接种后较快达到较高滴度，这对疫苗接种者是有益的，并且如果其显示应用于抗大流行性流感株的疫苗和在暴发应对中所使用的疫苗，将是特别有价值的。为了限制流行性流感和大流行性流感的后果，需要诱导比当前季节性疫苗更宽泛的保护性和更持久的免疫力的流感疫苗。研究暗示adcc介导的抗体识别的抗原决定簇比由中和抗体结合的抗原决定簇更保守，并且可能有助于保护抵抗异源菌株。用adcc诱导抗体的潜力遵循对hai和mn数据的类似应答模式，与im注射相比，在用hd
‑
map接种的组中观察到的滴度略高。识别ha颈部的b细胞和历史性h1n1 ha探针的频率在hd
‑
map肌肉内注射(im)接种后也增加到相似的程度。与im注射相比，数个hd
‑
map组在疫苗接种后第8天、第22天和第61天显示出统计学上更高的应答，并且1/6剂量诱导的抗体水平与全剂量im所诱导的抗体水平相当。合成聚合物map疫苗接种对受试者是安全和可接受的。map可以将裂解灭活的a/singapore/gp1908/2015(h1n1)病毒抗原(2.5μg ha)递送至人皮肤，可以达到与常规15.0μg ha im疫苗产生的ha特异性抗体应答相当的ha特异性抗体应答。该6倍剂量的减少意味着可以降低疫苗的成本，并且特别是当抗原的可利用性是一个限制因素时，如在大流行病的情况下，可以获得更多的疫苗。此外，降低昂贵的疫苗如抗宫颈癌疫苗的成本将有助于资源贫乏的国家容易地获得这些昂贵的疫苗，只要这些剂量降低对于除了流感疫苗之外的大多数其它疫苗是可能的。map递送低至2.5μg ha诱导与im qiv(15μg ha/剂量)相似的hai和mnt滴度。第8天用map递送的血清转化率和血清保护率更高。在前臂和上臂施用map时没有区别。map具有优
异的高温稳定性。除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书以及随后的权利要求书中术语“包括(comprise)”以及变型形式例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应理解为意指包括所述整数或整数组或步骤，但不排除任何其它整数或整数组。除非另有说明，否则本文所用术语“大约”是指
±
20％。本领域技术人员将认识到，许多变型形式和修改将变得显而易见。对本领域技术人员而言变得显而易见的全部这样的变型形式和修改都应当被认为落入前面所描述的本发明宽泛示出的精神和范围之内。