遗传修饰动物细胞的改进方法与流程

遗传修饰动物细胞的改进方法
1.本技术是申请号为201480052400.5的发明名称为“遗传修饰动物细胞的改进方法”的中国专利申请的分案申请，原申请是2014年09月23日提交的pct国际申请pct/us2014/057030于2016年03月23日进入中国国家阶段的申请。
2.相关申请
3.本技术要求2013年9月23日提交的标题为“improved methods of cell transduction”的美国临时申请no.61/881,259的权益，其整体通过引用并入本文。
4.本技术中引用的每个申请、专利和论文，以及每个申请、专利和论文中引用的每个文献或参考(包括每个授权专利公诉期间；“申请引用文献”)，未决美国专利申请10/961,814(下文中wilson
‘
814)、未决美国专利申请13/475,700(下文中vera
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700)、未决美国专利申请13/493,768(下文中vera
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768)、未决美国专利申请11/952,848(下文中wilson
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848)、未决美国专利申请14/313,702(下文中welch
‘
702)，以及对应于和/或要求这些申请和专利中任意的优先权的每一个pct和外国申请或专利，以及每个申请引用文献中引用或参考的每个文献，均明确地通过引用并入本文。
技术领域
5.本发明涉及通过降低细胞和遗传修饰剂(genetic modification agent)之间的距离以提高遗传修饰的效率和/或减少遗传修饰剂的使用来遗传修饰动物细胞的改进方法。


背景技术：

6.遗传修饰的细胞通常是指经历了通常被称为转导的过程之后的经转导细胞。可以利用多种技术进行转导，以允许基因修饰剂进入细胞。这样的遗传修饰剂包括使用病毒载体、电穿孔或提高细胞渗透性的化学试剂。转染和转化是将遗传物质插入细胞的常见方式。
7.在病毒载体的情况下，有多种使用的类型，并且这样的类型可以包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或者甚至纳米工程物质。在电穿孔的情况下，使细胞暴露于电压，其允许基因修饰剂(如质粒)进入细胞。主要的挑战是提高细胞转导的效率。效率提高可以包括增加给定细胞群中经转导细胞的数目或者减少在遗传上改变给定群中给定数目的细胞所需的遗传修饰剂的量。
8.慢病毒提供了与细胞转导相关的优势和问题的很好的实例。慢病毒主要是用于向体外系统中引入基因产物的研究工具。使用高通量形式的rna干扰技术，进行了大规模协作努力来使用慢病毒阻断特定基因的表达。短发夹rna(shrna)的表达降低了特定基因的表达，因此使得研究者能够检查模型系统中给定基因的必要性和作用。这些研究可以是开发旨在阻断基因产物以治疗疾病的新药的前驱。
9.在t细胞疗法领域，新兴的应用是在体外从遗传上改变t细胞以产生嵌合抗原受体(car)，其赋予转导t细胞对靶抗原的特异性，通常是对于靶抗原之单克隆抗体的特异性。以这种方式，可产生大量cart细胞以用于t细胞疗法。car t细胞的转导还可赋予细胞增强的
活化信号、扩增、细胞因子的产生以及效应子功能。这种方法有很大的潜力来以意义深远的方式改善患者特异性癌症疗法。在采集患者的t细胞后，对细胞进行遗传工程以表达特异性针对患者肿瘤细胞上之抗原的car，然后输注回患者，car t细胞在患者中识别并杀伤呈递靶抗原的癌细胞。
10.本发明的目的是改进转导过程，其通过增加所述过程完成后被转导的任何给定群大小的细胞的量，减少用于所述过程中的基因修饰剂的量，和/或降低所述过程的成本和复杂性来实现，特别地，其涉及转导t细胞。
11.t细胞培养和/或t细胞转导过程中一个常见步骤是使用抗体染色的磁珠从较大的混合群中选择目标细胞亚群。例如，可以从白细胞群中选择细胞亚群(如干t细胞(stem t cell))。一旦识别抗体的细胞亚群与珠结合，将整个群从装置中移出并且使其流经磁场，由此通过磁场捕获珠，从而从主群中分离附着至珠的细胞亚群。如果可以消除对使用流动系统分离亚群的需求以有利于在不需要液体流动的静态装置中进行所述过程，则将发生显著的工艺简化。


技术实现要素：

12.公开了本发明的某些实施方案，其改进了分离细胞亚群和/或转导动物细胞的过程。
13.在本发明的一个实施方案中，公开了用于减少转导细胞所需之遗传修饰剂的量的方法，其通过将动物细胞和培养基放置在包含由可透气、不可透液体材料构成的细胞生长表面的装置中的过程来实现，其中所述动物细胞以超过最大细胞浓度(细胞/毫升)的浓度驻留(reside)在培养基中，可以通过使用静态细胞培养方法在培养基高度为0.3cm的常规组织培养瓶中培养动物细胞获得所述最大细胞浓度，从而减小了任何给定细胞和任何给定遗传修饰剂之间的距离。
14.在另一个实施方案中，公开了用于减少转导细胞所需的遗传修饰剂的量的方法，其通过将动物细胞和培养基放置在包含由可透气、不可透液体材料构成的细胞生长表面的装置中的过程来实现，其中所述动物细胞以超过最大细胞浓度的浓度驻留在培养基中，可以通过使用静态细胞培养方法在培养基高度为0.3cm的常规组织培养瓶中培养动物细胞获得所述最大细胞浓度。在这种升高的浓度下，以细胞的初始生存力为参考点，将遗传修饰剂添加到装置中，允许遗传修饰剂转导细胞一段时间，在此期间，细胞生存力不降低到低于初始生存力的给定百分比。
15.在本发明的另一个实施方案中，公开了用于减少转导动物细胞之遗传修饰剂的使用的方法，其通过将培养基和动物细胞放置在包含由可透气材料构成的细胞生长表面的装置中来实现，其中培养基中动物细胞的浓度超过最大细胞浓度，可以通过使用静态细胞培养方法在培养基高度为0.3cm的瓶中培养所述细胞获得所述最大细胞浓度。在这种升高的浓度下，以培养基的初始葡萄糖浓度为参考点，将遗传修饰剂添加到装置中并且允许遗传修饰剂转导细胞一段时间，在此期间，培养基的葡萄糖浓度不降低到低于初始葡萄糖浓度的特定百分比或最小葡萄糖浓度。
16.在本发明的另一个实施方案中，公开了用于转导细胞的方法，其通过将培养基、动物细胞和遗传修饰剂添加到包含由可透气、不可透液体材料构成的生长表面的装置中来实
现，其中细胞浓度为3百万至2千万个细胞/毫升培养基，并且其中培养基与可透气、不可透液体材料接触，然后允许经过一段时间，在此期间，遗传修饰剂起作用以转导至少一部分细胞。
17.在本发明的另一个实施方案中，公开了用于转导细胞的方法，其通过提高可透气细胞培养装置中每毫升培养基中的细胞浓度来实现，所述装置包含第一细胞浓度的细胞，培养基处于第一培养基高度，并且培养基处于第一培养基体积，所述第一细胞浓度为细胞量除以第一培养基体积，所述第一培养基高度由当细胞生长表面处于水平位置时培养基的最上面位置与培养基的最下面位置之间的距离定义；从装置中移出一部分第一培养基体积，在装置中留下第二培养基体积，由此在移出一部分第一培养基体积之后，细胞处于第二细胞浓度，所述第二细胞浓度大于所述第一细胞浓度，培养基为第二培养基高度，所述第二培养基高度由当细胞生长表面处于水平位置时所述培养基的最上面位置与所述培养基的最下面位置之间的距离定义；以及将遗传修饰剂添加到装置中，允许经过一段时间，由此遗传修饰剂起作用以转导至少一部分细胞。可以进行后续步骤以扩增转导细胞群的大小，其通过向装置中添加一定体积的培养基，并且当所述装置定向成使得至少一部分细胞驻留在细胞生长表面上，并且细胞生长表面以水平位置定向，且适合细胞培养的环境气体与可透气、不可透液体材料接触时，允许用培养基培养细胞一段时间。
18.在本发明的另一个实施方案中，公开了从较大群中分离细胞亚群的方法，其中将细胞群、培养基和包被(coat)的磁珠添加到包含可透气、不可透液体材料的装置中，允许细胞亚群附着至磁珠一段时间，使装置内的珠暴露于磁场，移出培养基和细胞群，而磁珠由于磁场驻留在装置中，从而从较大的细胞群中分离细胞亚群。
19.在本发明的另一个实施方案中，公开了从较大群中分离细胞亚群的方法，其中将细胞群、培养基和包被的磁珠添加到包含可透气、不可透液体材料的装置中，允许细胞亚群附着至磁珠一段时间，使装置内的珠暴露于磁场，移出培养基和细胞群，而磁珠由于磁场驻留在装置中，从而从较大的细胞群中分离细胞亚群。然后使用本文所述的任何方法转导装置中的细胞。
附图说明
20.图1示出了包含细胞和培养基之非可透气的细胞培养装置的截面。
21.图1a示出了包含细胞、培养基和遗传修饰剂之非可透气的细胞培养装置的截面。
22.图2示出了包含细胞和培养基之可透气的细胞培养装置的截面。
23.图2a示出了包含细胞和培养基之可透气的细胞培养装置的截面。
24.图2b示出了包含细胞、培养基和遗传修饰剂之可透气的细胞培养装置的截面。
25.图2c示出了包含细胞、培养基和遗传修饰剂之可透气的细胞培养装置的截面。
具体实施方式
26.通过将图1和图1a中示出的常规方法与图2、图2a、图2b和图2c中示出的新方法进行比较来最好地理解本发明对于遗传修饰动物细胞有利的一个实施方案。图1示出了常规静态细胞培养装置10(例如瓶)的截面图，所述装置具有不透气的细胞生长表面20。在该实例中，培养基30通常以0.3cm的高度驻留在100cm2的细胞生长表面之上。因此，30ml培养基
驻留在100cm2的细胞生长表面之上，得到培养基与细胞生长表面积的比为0.3ml/cm2。根据一般认识，细胞40(以圆圈表示)通常以不大于2百万个细胞/ml的浓度驻留，因此最多6千万个细胞驻留在装置中(即，2百万个细胞/ml乘以30ml培养基)。因此，在100cm2的装置细胞生长表面上，一旦细胞被重力吸引到细胞生长表面，它们以60万个细胞/cm2的表面密度(即，6千万个细胞除以100cm2的表面积)驻留。图2示出了可透气装置100(例如，wilson
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814、vera
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700、vera
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768、wilson
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848、welch
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702中描述的以及市售装置)的截面图，所述装置提倡和/或允许培养基以远超常规装置的高度驻留，并且允许细胞以比常规培养装置高的表面密度驻留。在本实例中，细胞40(以圆圈表示)处于静态培养状态，并且被重力吸引到由可透气、不可透液体的细胞生长表面160构成的装置底部。培养基130以10cm的高度驻留在可透气、不可透液体之具有100cm2细胞生长表面积的细胞生长表面160之上，得到1000ml的培养基体积以及10ml/cm2的培养基体积与细胞生长表面积的比。在2百万个细胞/ml的细胞浓度下，20亿个细胞存在于装置中。细胞以2千万个细胞/cm2的表面密度驻留，是图1的常规瓶中表面密度的33倍(即，2千万个细胞/cm2除以60万个细胞/cm2)，尽管具有2百万个细胞/毫升的相同浓度。
27.以下描述示出了图2的可透气装置中如何可以减少基因修饰剂和细胞之间的距离，从而提高转导效率。图1a示出了在向培养基添加遗传修饰剂50(以加号( )表示)后图1的常规瓶装置的截面。在本实例中，遗传修饰剂的量与细胞的量为一比一的比。鼓励技术人员认识到，比可以是任何期望的比，而不仅仅是本示例性实施方案中描述的一比一的比。遗传修饰剂具有比细胞低的比重，并且其比重防止它们如细胞那样被重力吸引到装置的底部。图2a示出了在培养基从其10cm的第一高度降低到1cm的第二高度后，图2可透气装置的截面图，因此细胞浓度从其2百万/ml的第一细胞浓度增加到其2千万/ml的第二细胞浓度。换言之，细胞浓度增加10倍(即，2百万/ml到2千万/ml)。重要的是，这是常规装置的2百万/ml浓度的10倍。图2b示出了在向培养基添加遗传修饰剂150(以加号( )表示)后图2a的可透气装置。在本实例中，遗传修饰剂的量与细胞的量为一比一的比。在本实例中，由于图2可透气装置中浓缩的细胞/ml为图1常规瓶装置中的10倍，因此相对于常规瓶装置，随着培养基高度降低，降低可透气装置中的任何给定遗传修饰剂和任何给定细胞之间距离的能力与细胞浓度增加成比例。换言之，随着培养基高度的降低，遗传修饰剂与细胞之间的距离降低。因此，任何给定的遗传修饰剂更有可能通过布朗运动与细胞接触。提高的接触频率增加了任何给定遗传修饰剂转导细胞的概率。
28.为了进一步提高转导效率，可能有利的是使细胞离开其静止位置，这是培养基的静态以及作用于细胞以使其向装置底部运动的重力的结果。图2c示出了处于遍及培养基分布状态的细胞，其可以通过使培养基运动离开静态并且进入在装置内强制运动的非静态来实现。这可以是简单的通过手移动装置，例如摇动或回荡(swirling)装置，但是优选地通过使用任意数量的更受控的机制(包括使用定轨振荡器、振荡板，或者振动、混合或搅拌培养基的任何机制或方法)使装置或培养基运动来获得一致性。换言之，通过使培养基进入强制运动状态(与允许细胞被重力吸引到装置底部的静态相反)，细胞离开底部并且进入遍及培养基分布的状态。在遍及培养基分布的状态下，细胞甚至更有可能与遗传修饰剂接触。
29.在可透气装置中，在其中细胞以其增加的浓度在培养基中并且在遗传修饰剂存在的情况下一段时间后，细胞群可以从转导状态转入细胞培养状态。因此，培养基可以恢复到
更高高度或者可从细胞洗去遗传修饰剂并且将细胞重悬在一个或更多个可透气装置中以用于群扩增。
30.本发明转导方法相对于常规转导方法有很多优点。细胞和遗传修饰剂之间距离的降低增加了任何给定时间内接触的概率。随着接触的增加，可以提高遗传改变的细胞的比例。另外，与常规方法相比，为了获得相等的遗传改变细胞群的比例，可以使用较少量的遗传修饰剂。另外，可以减少进行细胞转导过程的持续时间。鼓励技术人员认识到，优选地，可透气装置的壁是刚性的以确保当移动装置时不干扰细胞，因为当培养基从其第一高度减少到其第二高度时，如果操作或移动装置，则可能发生干扰。这样的话可能使细胞离开其在细胞生长表面的静止位置并且进入培养基，由此在培养基高度降低期间细胞可能损失。换言之，当移出培养基时，细胞优选地在装置表面上的静止位置。可透气装置优选地不是常规细胞培养袋，因为细胞培养袋不是刚性的，当操作袋时细胞从袋壁上的静止状态运动进入在培养基中分布的状态。
31.细胞可以以升高的浓度保持在可透气装置中的持续时间取决于细胞代谢。基于在t细胞培养实验中获得的知识，当细胞静止在细胞生长表面上，通过降低培养基高度(即，体积)使细胞浓度增加到至多4百万个细胞/ml时，完成遗传修饰过程之前的持续时间优选地不超过24小时。换言之，在从其第一高度降低到其第二高度后，培养基高度在其降低状态下优选持续不超过48小时的时段。当细胞在细胞生长表面上静止，通过降低培养基高度(即，体积)使细胞浓度增加超过4百万个细胞/ml并且至多8百万个细胞/ml时，完成遗传修饰过程之前的持续时间优选地不超过24小时。当细胞在细胞生长表面上静止，通过降低培养基高度(即，体积)使细胞浓度增加超过8百万个细胞/ml并且至多1600万个细胞/ml时，完成遗传修饰过程之前的持续时间优选地不超过12小时。当细胞在细胞生长表面上静止，通过降低培养基高度(即，体积)使细胞浓度增加超过1600万个细胞/ml并且至多3200万个细胞/ml时，完成遗传修饰过程之前的持续时间优选地不超过6小时。
32.之前的实例示出了当遗传修饰剂的量与细胞的量的比与常规非可透气静态装置中的比相同时，如何在可透气装置中通过临时增加细胞浓度使效率提高，其中细胞生长表面由可透气、不可透液体材料构成。还可以使用这种方法来减少实现与常规装置允许的相同的转导效率所需的遗传修饰剂的数量。在这种情况下，转导效率是指遗传修饰的细胞群的百分比。在实践中，例如，为了实现与常规非可透气静态细胞培养装置(例如，瓶)中获得的相同的转导效率，可以以与常规装置所需成反比地减少可透气装置中遗传修饰剂与细胞的比。例如，在感染剂(如病毒载体)是遗传修饰剂的情况下，可以按照常规静态装置(例如，瓶)中细胞浓度与静态可透气装置(例如或者所引用的相关申请中描述的任何可透气装置)中细胞浓度的比来减少感染剂与感染目标的比(通常也称为感染复数或moi)。例如，在与图1至图2c相关的之前讨论中，其中可透气装置中的细胞是瓶中浓度的10倍，如果遗传修饰剂是病毒载体，可以减少病毒载体(例如，慢病毒)的数目。这可用于降低工艺成本。例如，如果瓶中的moi是5，则可透气装置中的moi可以小于5并且可以不削弱转导效率。
33.为了实施本发明，并不需要进行将细胞培养到高表面密度(即，细胞/cm2)然后降低培养基高度以增加细胞浓度的第一步骤。可以简单地以一定方式使细胞和培养基运动到具有由可透气材料构成的细胞生长表面的装置中，以使得细胞浓度超过常规培养装置(如瓶)和依赖于瓶的常规方法的细胞浓度。优选地，细胞浓度超过2百万个细胞/ml，包括3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30及更多。鼓励技术人员认识到，浓度未必是精确的整数，例如5，而可以是任何数值，优选地为大于2百万个细胞/ml的浓度范围。优选地，细胞浓度超过2百万个细胞/ml并且不超过3千万个细胞/ml，更优选地超过3百万个细胞/ml并且至多2千万个细胞/ml，甚至更优选地超过4百万个细胞/ml并且至多2千万个细胞/ml，最优选地超过5百万个细胞/ml并且至多2千万个细胞/ml。但是，技术人员应认识到，范围不限于此，例如1千万个细胞/ml至2千万个细胞/ml也在本发明的范围内。目标是相对于在细胞培养装置中进行的之前的转导方法，提高每毫升培养基中细胞靶标的数目，从而降低任何给定细胞和任何给定转导剂和给定细胞之间的距离。
34.一个关键方面是允许细胞通过培养基上表面的气体
‑
培养基界面以外的表面获得氧气。优选地细胞通过细胞驻留在其上的表面获得氧气。细胞驻留在可透气不可透液体的细胞生长表面上，环境气体可以与可透气表面的相对侧接触。所需的环境气体仅与可透气材料被动接触。换言之，如果细胞不仅仅依赖于气体
‑
培养基界面递送氧气，则将是有利的。以这种方式，细胞不依赖于其距离气
‑
液界面(如果存在一个的话)的距离获得氧气。还可能有利的是构建其中完全消除了气
‑
液界面的装置和方法，只要壁(优选细胞接触的壁)是可透气的即可。
35.本发明中转导过程可以发生的持续时间不受细胞浓度的限制，其将使对于培养基的代谢要求与细胞浓度的增加成比例。作为一个实例，以约500,000个细胞/cm2的浓度，以11cm的培养基高度(11ml/cm2的培养基体积与表面积的比)开始，在可透气装置中培养t细胞，并且允许在不进料的情况下培养以扩增群大小，持续至多11天的时间段，直到细胞达到约3百万/ml的峰浓度(peak concentration)。在该时间点，在多至额外两天内生存力不降低超过约3
‑
5％。因此，鼓励技术人员认识到，尽管细胞群增加，细胞消耗培养基的营养物质持续长的时间段。因此，预期细胞可以以非常高的浓度驻留在培养基中，在至少一天内大幅超过3百万/ml，而不显著丧失生存力。由于在一天中可以完成多次转导方案以及在几个小时内完成多次转导方案，因此有机会在这样的细胞浓度下转导细胞群：其超过1)使用常规静态培养方法和静态细胞培养装置(如瓶的那些)可获得的细胞浓度，或2)利用静态可透气细胞培养装置(如wilson
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814、wilson
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848、wilson 700、vera
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768、welch
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702和/或
tm
的那些)使用高表面密度静态细胞培养方法可获得的细胞浓度。对于转导过程，以下描述了如何确定合适的细胞浓度以及进行转导的一个实例，其中理想的是在24小时内完成该过程。这样的过程可以包括：
36.步骤a.允许细胞以超过瓶的细胞浓度的细胞浓度驻留，优选地超过约2百万/ml，例如之前描述的那些，包括3百万/ml、4百万/ml、5百万/ml、6百万/ml等。测量葡萄糖消耗，并且确定直到葡萄糖剩余大于约50mg/dl，更优选地为或大于80mg/dl，最优选地为或大于100mg/dl的时间量。或者，可以测量细胞群的初始生存力，并且确定直到初始生产力降低一定的百分比，优选不大于20％，更优选不大于10％，甚至更优选不大于5％，最优选完全不降低的时间量。因此，优选的是选择转导过程开始时的细胞浓度，所述细胞浓度在不超过24小时的时间段内符合优选的葡萄糖和/或生存力条件。鼓励技术人员认识到，在优选状态下，任何起始细胞浓度都是可接受的，只要在整个转导时间段内保持优选的葡萄糖消耗和/或优选的生存力值即可。因此，在起始细胞浓度和持续时间之间会有权衡。
37.步骤b.向其中驻留有细胞的培养基添加遗传修饰剂。遗传修饰剂的量与细胞的量的比可以是被发现相对于在常规细胞浓度极限(例如，瓶和其他静态非可透气培养装置和过程的典型极限2百万个细胞/ml)内进行的转导提高转导效率的任何比。优选地，所述比为1或更大，更优选地，1至5，最优选地，1至2。通过提高细胞浓度以及提供1的比，随着与常规细胞浓度下相比细胞和转导剂彼此更接近，预期被转导细胞的百分比增加。如果关心转导剂的成本或可用性，相对于常规方法，提高的细胞浓度以及所导致的细胞和遗传修饰剂之间更接近的距离允许该比降低到低于1，预期与例为1时的常规方法的百分比类似百分比的细胞将被转导。无论目的是增加转导细胞的数目还是减少遗传修饰剂的使用，所述方法并不需要强迫混合遗传修饰剂和细胞，但是如果其增加了转导细胞的数目或最小化了遗传修饰剂的使用，则可以这样做。
38.可透气装置的一个主要优点是允许培养基以非常规培养基高度驻留的能力，而细胞通过装置壁(优选上面驻留细胞的细胞生长表面)来获得氧气运送途径。优选地，细胞被重力吸引到与环境气体接触的可透气、不可透液体的细胞生长表面。当使用可透气不可透液体的材料时，无孔硅酮(silicone)由于其高氧气传输能力是优选的。可以使用wilson
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814、vera
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700、vera
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768、vera
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700和/或wilson
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848的装置和方法将细胞群从少量扩增到大量。其后，可以使用vera
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700和/或welch
‘
702的方法和装置浓缩细胞。然而，不同于其中在移出培养基以将细胞以超过2百万个细胞/毫升培养基的非常规高浓度放置在装置内后，立即从装置移出细胞的vera
‘
700方法，细胞可以保留在装置中并且所述装置还可以充当进行下一转导步骤的转导装置。或者，可以将细胞从其存在的任何装置移出并且添加到可透气装置中，由此可以进行高细胞浓度下的转导步骤。主要优点是产生高细胞浓度的能力，优选地，所述浓度在之前描述的范围内。
39.鼓励技术人员认识到，提高转导效率的过程可以体现为任意数目的步骤，其包括：
40.a)将动物细胞添加至具有可透气不可透液体之生长表面的装置，
41.b)允许细胞在第一细胞浓度和第一培养基高度下被重力吸引到生长表面，
42.c)任选地允许细胞量扩增到第二细胞浓度，
43.d)将培养基从第一高度降低到更低的第二高度，从而产生第三细胞浓度，所述第三细胞浓度超过所述第一细胞浓度和所述第二细胞浓度，
44.d)添加一定量的遗传修饰剂，优选地以之前描述的与细胞量的任何比，
45.e)允许转导一段时间，优选地其中细胞生存力或葡萄糖浓度保持在优选极限之内，
46.f)添加更多培养基以使培养基高度升高到新水平，
47.g)培养细胞以扩增经转导细胞群的量。
48.鼓励技术人员认识到，不一定要培养细胞。例如，提高转导效率的过程可以简化为：
49.a)将动物细胞和培养基添加到具有可透气不可透液体之生长表面的装置中，
50.b)允许细胞在第一细胞浓度和第一培养基高度下被重力吸引到生长表面，所述第一细胞浓度超过在静态组织培养瓶中培养动物细胞时的可能细胞浓度，或者任选地仅选择在之前确定的优选范围内的细胞浓度，
51.c)添加一定量的遗传修饰剂，优选地以之前描述的与细胞量的任何比，
52.d)允许转染一段时间，优选地，其中细胞生存力和/或葡萄糖浓度保持在优选极限之内。
53.t细胞培养和/或t细胞转导过程中的一个常见步骤是使用包被的磁珠来从较大的混合细胞群中选择目标细胞亚群。覆盖层(coating)通常是与细胞结合的抗体。在允许目标细胞亚群与珠附着一段时间后，使整个细胞群和培养基流动通过磁场，由此通过磁场捕获珠，从而从混合群中分离附着至珠的细胞亚群。如果可以消除对使用流动系统分离亚群的需求以有利于在静态装置中进行该过程，则将发生显著的工艺简化。如果静态装置能够以比常规方法更有效的方式转导包被的珠靶向的亚群，则将发生甚至更大的工艺简化。
54.通过使用可透气装置，获得了改进的工艺，所述可透气装置以之前描述的任何方式(包括任何引用的相关申请中的那些)配置，向所述可透气装置中添加混合细胞群、培养基和包被的珠。珠和细胞可以如静态培养方法那样被重力吸引到可透气材料，或者如果选择迫使珠和细胞运动以旨在增加接触，则可以通过混合培养基的常规方法(例如，摇动或搅拌所述装置)来使装置中的培养基处于非静态，以增加细胞与珠的接触。无论如何，在其中细胞与珠彼此附着的给定时间段后，使珠暴露于磁场，从而在装置内捕获珠。移出培养基和未附着至珠的细胞，从而在装置内留下期望的细胞亚群。
55.在其中细胞亚群是阳性选择(即，附着至珠的细胞是期望亚群)之一的情况下，然后可以通过任何之前描述的方法转导它们。在其中细胞亚群是阴性选择(即，附着至珠的细胞不是期望亚群)之一的情况下，可以通过任何之前描述的方法转导移出的群(即，未附着至珠的群)。在其中待使用相同的装置进行转导的阴性选择的情况下，在移出未附着至珠的群后，可以终止磁场，可以从装置中移出珠，并且可以将未附着至珠的细胞群添加回装置中，由此可以通过任何之前描述的方法转导该群。可以使用本发明(包括所引用的相关专利)描述的任何方法进行额外的步骤以培养细胞，然后任选地将珠与细胞分离(如果期望这样的话)。
56.在一个优选实施方案中，珠包被有与干t细胞(如cd45ra、c62l和ccr7)结合的抗体。在另一个优选实施方案中，珠包被有与调节性t细胞(如cd4

、cd25 bright和cd127 low)结合的抗体。优选地，混合细胞群是白细胞群。
57.在一个优选实施方案中，通过与可透气材料支持物接触的磁体产生磁场，可透气材料支持物与可透气细胞生长表面接触。优选地，磁体的表面与可透气细胞生长表面平行。更优选地，磁体的表面与细胞生长表面平行并且在0.5英寸内、甚至更优选在0.3英寸内、并且最优选在0.2英寸内。
58.术语转导不限于本文的使用，并且广义地定义为包括依赖于与细胞接触的遗传修饰剂之细胞的任何形式的遗传修饰。优选地，可透气装置未通过半透膜(如透析膜)区域化(compartmentalize)。换言之，装置优选地不具有至少部分地由半透膜界定的其中驻留细胞的独立室。优选地，装置的底部由可透气细胞生长表面构成，所述可透气细胞生长表面是平面并且当培养基高度正在降低和/或正在培养动物细胞时是水平状态。优选地，在整个细胞培养过程和/或转导过程中，可透气材料与培养基接触。优选地，可透气材料与环境气体以及可透气材料支持物(例如，在wilson
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814中如[0136]段描述)接触。
[0059]
还鼓励技术人员认识到，培养基高度可以是远大于一般认识的高度，例如，在wilson
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814中如在实施例1和表1中描述的。还鼓励技术人员认识到，wilson
‘
814的实施例1
和表1表明培养基高度可以是超过一般认识的2.0cm的任何高度，不仅包括3.02cm、5.09cm、10.20cm、15.31cm和20.39cm的高度，还包括任何中间高度，例如2.5cm、3.03cm、4.0cm、15.32cm等，因为随着根据实施例1和表1增加培养基，依然获得了优点。升高的培养基高度的益处进一步描述在vera
‘
700中，如在vera
‘
700的实施例9、实施例11以及多个其他实施例中描述的。从vera
‘
700，可以确定例如，从细胞表面密度为1,000,000个细胞/cm2，培养基高度为10cm和细胞浓度为100,000个细胞/ml扩增细胞是一个有效过程。当患者与患者之间扩增率的变化性很大时，从细胞表面密度为3,000,000个细胞/cm2，培养基高度为10cm和细胞浓度为300,000个细胞/ml扩增细胞可能是一个好的选择，并且期望产生比常规方法高的表面密度以有助于确保细胞足够紧密地通讯以用于开始扩增。然而，vera
‘
700中还表明低细胞表面密度是有益的。
[0060]
技术人员还应认识到本发明确定了范围和包括在范围内的数值。这还适用于引用的相关申请，特别是wilson
‘
814和vera
‘
700。另外，技术人员应知道，细胞培养实验均不依赖于vera
‘
700中的纤连蛋白、其片段、或其混合物。
[0061]
技术人员还应认识到，如vera
‘
700中描述的，通过从任何数目的非常规低细胞表面密度到任何数目的非常规高细胞表面密度的细胞扩增所获得的益处。例如，vera
‘
700描述了多个实施例，包括实施例14中的car t扩增，当转导和扩增car t细胞群时，其可能对本发明有益。
[0062]
还鼓励技术人员认识到，vera
‘
700(例如vera’700的图22a、图22b、图22c和图22c周围以及相关正文)中描述的降低培养基高度的方法可能有利于本发明中降低培养基高度。
[0063]
本领域技术人员将认识到，可以对本公开内容进行多种修改而不脱离本文描述的本发明的精神。因此，并未旨在将本发明的范围限制为描述的实施方案和实施例。相反，本发明的范围由所附权利要求及其等同方案来解释。