一种类器官成型装置的制作方法

1.本实用新型涉及生物医疗技术领域，更具体地，涉及一种类器官成型装置。


背景技术：

2.类器官是一种基于3d体外细胞培养系统，建立的与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型。这些3d体外培养系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间，细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。其特征必须包含一种以上与来源器官相同的细胞类型；应该表现出来源器官所特有的一些功能；细胞的组织方式应当与来源器官相似。类器官技术应用领域广泛，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验。
3.类器官制备的典型方法首先要分离出相应的种子细胞，例如肿瘤中的肿瘤干细胞或者是正常组织来源的多能干细胞，然后将它们培养在一个生物相容性良好的材料上如基质胶或者手工挤出点样工艺。培养的同时培养基中需要添加生长因子和小分子等，以激活或者抑制参与类器官形成所依赖的特定信号通路，制备不同的类器官需使用不同的添加物组合，经过一段时间的培养形成球形细胞团簇。但是传统方法是采用培养皿直接进行培养，这样细胞是自发组成团簇的，形成团簇的细胞初始数量是不受控制的，所以形成的类器官大小也是不一致的，且位置随机，如图1所示；更麻烦的是细胞成型团簇后是悬浮培养与生长，这就很难进行针对性的分析，或者是进行统一、批量化的药物筛选工作。为解决上述问题，目前有一种方法是采用注射器点样来得到比较大阵列的样品液滴，以保证各个样品液滴大小均匀，如中国专利cn109613294a就公开了一种高通量液滴阵列微流体点样液体样品进样装置，但是采用这种注射器点样的方法，细胞会因为自身重力的原因沉降在注射器的底部，从而造成初期的样品液滴细胞浓度较高，而后期的样品液滴细胞浓度较低，这样明显的浓度差异，如图2所示；如果细胞初量不统一对后期的药物评价也无法客观对比。


技术实现要素：

4.为克服现有采用注射器点样方法得到类器官培养的细胞悬液样品液滴时，细胞会因为自身重力的原因沉降在注射器的底部，从而造成初期的样品液滴细胞浓度较高，而后期的样品液滴细胞浓度较低，这样明显的浓度差异的缺陷，本实用新型提供一种类器官成型装置。本实用新型能够使得得到的用于类器官培养的细胞悬液样品液滴的初始细胞含量均匀一致，进而使得最终构建的类器官体尺寸统一。
5.为解决上述技术问题，本实用新型采用的技术方案是：一种类器官成型装置，其中，包括泵，一端与所述泵连接并用于储运细胞悬液的螺旋管，连接于所述螺旋管另一端并将由螺旋管输送过来的细胞悬液挤出形成细胞悬液微球的喷头单元。本实用新型中，螺旋管采用的是一种医用硅橡胶管，内径在0.7
‑
3.6mm之间，其内的液体因为与管壁的粘附及毛细吸附作用而保持一定状态的稳定性，不会自发流动，这样细胞悬液就可以在螺旋管内稳定存储从而保证细胞悬液微球成型过程中细胞浓度的前后统一，并最终使得构建的的类器
官体尺寸统一，适用于高通量药物筛选、免疫治疗、肿瘤发生发展等方面的研究。
6.作为一种优选方案，所述喷头单元包括设于所述螺旋管另一端的喷头软管，从所述喷头软管侧壁插进其内腔并与喷头软管形成同轴结构的针头，分别设置于所述喷头软管上位于所述针头所在位置的上游和下游的第一夹管阀和第二夹管阀，所述针头尾端连接有输气装置，可给针头尾端提供10
‑
100kpa气压。喷头软管其实与螺旋管为一体结构，同样是采用的医用硅橡胶管，针头为钢制针头。
7.进一步的，所述输气装置包括通过气管与所述针头连接的气泵以及设于所述气管上的电磁阀，电磁阀控制通过针头的气流的通断，所述泵为蠕动泵。
8.进一步的，本方案还包括控制器以及与所述控制器连接的数据采集卡，所述数据采集卡分别与所述泵、第一夹管阀、第二夹管阀和电磁阀连接。控制器主要通过人机界面对整个装置进行参数设置、监控与储存数据，数据采集卡通过专用数据电缆与控制器相连接，接受控制器的控制信号，再转发给蠕动泵、第一夹管阀、第二夹管阀和电磁阀，从而控制这些装置的启动与停止。
9.作为另一种优选方案，所述喷头单元包括设于所述螺旋管另一端的喷头软管，连接于所述喷头软管远离所述螺旋管的这一端上的针头，设置于所述喷头软管上靠近所述针头处的第三夹管阀，所述针头上连接有高压直流源。喷头软管其实与螺旋管为一体结构，同样是采用的医用硅橡胶管，针头为钢制针头，高压直流源能够给针头接通1kv
‑
15kv的高压直流电，在针头下方形成高压静电场。
10.进一步的，所述针头上设有接线夹头，所述高压直流源通过导线连接于所述接线夹头上，所述泵为恒流泵。
11.进一步的，本方案还包括控制器以及与所述控制器连接的数据采集卡，所述数据采集卡分别与所述泵、第三夹管阀和高压直流源连接。控制器主要通过人机界面对整个装置进行参数设置、监控与储存数据，数据采集卡通过专用数据电缆与控制器相连接，接受控制器的控制信号，再转发给恒流泵和第三夹管阀，从而控制这些装置的启动与停止。
12.进一步的，本实用新型还包括设于所述喷头单元下方并用于盛接细胞悬液微球的二维运动台，设于所述二维运动台一侧用于检测细胞悬液微球的直径的光学检测单元，所述二维运动台和光学检测单元与所述数据采集卡连接。盛接细胞悬液微球时，可以将培养装置放置于二维运动台上，由控制器控制二维运动台运动进而带动培养装置一起运动，以便细胞悬液微球能够准确落在培养面的设定位置。光学检测单元在细胞悬液微球挤出过程中能够实时检测细胞悬液微球的直径是否统一，例如光学检测单元包含光学显微镜，可以采集微球挤出后的图像，并且通过数据线传输给数据采集卡，在控制器屏幕上显示图像并测量直径，操作者可以在控制器屏幕上观察微球体中类器官聚集、形成与成熟情况，还可以待其成熟稳定之后再次检测、测量记录微球的直径。
13.本实用新型还提供一种类器官成型装置的工作方法，其中，包括如下步骤：
14.s1.喷头单元的通路打开，泵反向旋转将含细胞或者微组织的细胞悬液通过喷头单元吸进螺旋管内待用；
15.s2.喷头单元的出口处关闭，泵正向旋转将所述细胞悬液从螺旋管挤出到喷头单元；
16.s3.所述细胞悬液飞出形成细胞悬液微球，最终滴落粘附在培养面的设定位置；
17.s4.重复步骤s1、s2和s3，直到培养面上达到目标数量的细胞悬液微球；
18.s5.在培养面上加入含有类器官诱导剂的水凝胶，对培养面上的细胞悬液微球进行培养，形成类器官。
19.其中，含细胞悬液中细胞的浓度为0.1
‑
10*106个/ml，细胞种类为原代肿瘤细胞、或者是干细胞、成体细胞等种类；水凝胶为甲基丙烯酸化明胶(3％
‑
20％)，或明胶(2％
‑
20％)、胶原(0.1％
‑
20％)、纤维蛋白原(0.2％
‑
5％)、海藻酸钠(0.5％
‑
5％)等。这些水凝胶的加入既是为了初期维持细胞团簇的形状，更为细胞的粘附生长提供了一个良好的三维微环境。水凝胶中还含有类器官诱导剂，类器官诱导剂包含多种生长因子、或小分子物质，不同的类器官种类使用的诱导剂也是不一样。以小肠类器官的培养为例，需添加egf(表皮生长因子)，r
‑
spondin
‑
1、wnt
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3a和noggin等生长因子。
20.经过一周的培养与诱导即可形成大小均匀、状态稳定的类器官结构体，整体尺寸是统一均匀，排布规律。
21.进一步的，所述步骤s3、s4和s5中，光学检测单元实时检测细胞悬液微球的直径大小，然后反馈给数据采集卡。在实际应用中，光学检测单元首先实时检测挤出的细胞悬液微球大小是否统一。待检测通过后，在培养过程中也需要检测类器官聚集、形成与成熟，待其成熟稳定之后再次检测、测量其球体直径。然后再添加抗肿瘤药物，实时检测类器官直径的变化，若药物有效则其体积保持稳定或收缩变小。反之，肿瘤类器官直径持续发展变大，则说明药物是无效的。也可通过细胞活死染色、特异荧光染色等方法，对肿瘤的发生发展进行相关研究。
22.进一步的，上述类器官成型装置的工作方法如通过气流喷射作用来形成细胞悬液微球，则包括如下具体步骤：
23.s1.控制器控制第一夹管阀和第二夹管阀打开，控制器控制泵反向旋转将含细胞或者微组织的细胞悬液通过喷头软管吸进螺旋管内待用；
24.s2.控制器控制第一夹管阀保持打开，第二夹管阀关闭，泵正向旋转一个节拍将细胞悬液从螺旋管挤出充满喷头软管空间；
25.s3.控制器控制第一夹管阀关闭，第二夹管阀打开，控制器控制电磁阀打开，通过气泵将过滤后的高压气体经针头释放，从而将喷头软管内一定体积的细胞悬液推出形成细胞悬液微球，最终滴落粘附在培养面的设定位置。
26.进一步的，上述类器官成型装置的工作方法如通过高压静电作用来形成细胞悬液微球，则包括如下具体步骤：
27.s1.控制器控制第三夹管阀打开，控制器控制泵反向启动将含细胞或者微组织的细胞悬液通过针头和喷头软管吸进螺旋管内待用；
28.s2.控制器控制泵正向启动以低速、稳定推动细胞悬液进入喷头软管；
29.s3.高压直流源打开，将针头(通电，然后第三夹管阀以一定频率稳定开启、关闭，第三夹管阀关闭液路的同时，将喷头软管端部的细胞悬液挤出至针头的端部，然后细胞悬液在高压静电的作用下突破表面张力飞出形成细胞悬液微球，最终滴落粘附在培养面的设定位置。
30.与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：
31.本实用新型采用螺旋管来存储和储运细胞悬液，这样细胞悬液就可以在螺旋管内
稳定存储从而保证细胞悬液微球成型过程中细胞浓度的前后统一，并配合泵、夹管阀的启停，可挤出大小均匀的微球体，最终使得构建的的类器官体尺寸统一，适用于高通量药物筛选、免疫治疗、肿瘤发生发展等方面的研究。
32.本实用新型装置较传统方法使用的装置，自动化程度高，形成细胞悬液微球大小可控及细胞数量可控，合适微球大小和合适的细胞数量，既能有利于高通量生产，又能保证类器官成型率。
附图说明
33.图1是采用传统培养皿培养方法构建的类器官的效果图。
34.图2是采用注射器点样法获得细胞悬液微球时细胞悬液中细胞因自身重力沉降的示意图。
35.图3是本实用新型实施例1的整体结构示意图。
36.图4是本实用新型中螺旋管和喷头软管的结构示意图。
37.图5是本实用新型实施例1中喷头软管与针头、第一夹管阀以及第二夹管阀配合的结构示意图。
38.图6是本实用新型实施例2的整体结构示意图。
39.图7是本实用新型实施例2中喷头软管与针头、以及第三夹管阀配合的结构示意图。
40.图8是本实用新型实施例3和实施例4构建的类器官的效果图。
具体实施方式
41.附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。附图中描述位置关系仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制。
42.实施例1
43.如图3和图4所示，一种类器官成型装置，其中，包括泵1，一端与所述泵1连接并用于储运细胞悬液的螺旋管2，连接于所述螺旋管2另一端并通过气流喷射作用或者高压静电作用将由螺旋管2输送过来的细胞悬液挤出形成细胞悬液微球的喷头单元3。本实用新型中，螺旋管2采用的是一种医用硅橡胶管，内径在0.7
‑
3.6mm之间，其内的液体因为与管壁的粘附及毛细吸附作用而保持一定状态的稳定性，不会自发流动，这样细胞悬液就可以在螺旋管2内稳定存储从而保证细胞悬液微球成型过程中细胞浓度的前后统一，并最终使得构建的的类器官体尺寸统一，适用于高通量药物筛选、免疫治疗、肿瘤发生发展等方面的研究。
44.如图4和图5所示，所述喷头单元3包括设于所述螺旋管2另一端的喷头软管31，从所述喷头软管31侧壁插进其内腔并与喷头软管31形成同轴结构的针头32，分别设置于所述喷头软管31上位于所述针头32所在位置的上游和下游的第一夹管阀33和第二夹管阀34，所述针头32尾端连接有输气装置，可给针头尾端提供10
‑
100kpa气压。喷头软管31其实与螺旋管2为一体结构，同样是采用的医用硅橡胶管，针头32为钢制针头32。
45.如图3所示，所述输气装置包括通过气管与所述针头32连接的气泵35以及设于所述气管上的电磁阀36，电磁阀36控制通过针头32的气流的通断，所述泵1为蠕动泵1。
46.如图3所示，本实施例还包括控制器4以及与所述控制器4连接的数据采集卡5，所述数据采集卡5分别与所述泵1、第一夹管阀33、第二夹管阀34和电磁阀36连接。控制器4主要通过人机界面对整个装置进行参数设置、监控与储存数据，数据采集卡5通过专用数据电缆与控制器4相连接，接受控制器4的控制信号，再转发给蠕动泵1、第一夹管阀33、第二夹管阀34和电磁阀36，从而控制这些装置的启动与停止。
47.如图3所示，本实施例还包括设于所述喷头单元3下方并用于盛接细胞悬液微球的二维运动台6，设于所述二维运动台6一侧用于检测细胞悬液微球的直径的光学检测单元7，所述二维运动台6和光学检测单元7与所述数据采集卡5连接。盛接细胞悬液微球时，可以将培养装置放置于二维运动台6上，由控制器4控制二维运动台6运动进而带动培养装置一起运动，以便细胞悬液微球能够准确落在培养面的设定位置。光学检测单元7在细胞悬液微球挤出过程中能够实时检测细胞悬液微球的直径是否统一，光学检测单元7在培养过程中能够检测类器官聚集、形成与成熟，待其成熟稳定之后再次检测、测量其球体直径。
48.实施例2
49.本实施例与实施例1类似，其区别在于，如图6和图7所示，所述喷头单元3包括设于所述螺旋管2另一端的喷头软管31，连接于所述喷头软管31远离所述螺旋管2的这一端上的针头32，设置于所述喷头软管31上靠近所述针头32处的第三夹管阀37，所述针头32上连接有高压直流源38。喷头软管31其实与螺旋管2为一体结构，同样是采用的医用硅橡胶管，针头32为钢制针头32，高压直流源38能够给针头32接通1kv
‑
15kv的高压直流电，在针头32下方形成高压静电场。
50.如图7所示，所述针头32上设有接线夹头39，所述高压直流源38通过导线连接于所述接线夹头39上，所述泵1为恒流泵1。
51.如图6所示，本实施例还包括控制器4以及与所述控制器4连接的数据采集卡5，所述数据采集卡5分别与所述泵1、第三夹管阀37和高压直流源38连接。控制器4主要通过人机界面对整个装置进行参数设置、监控与储存数据，数据采集卡5通过专用数据电缆与控制器4相连接，接受控制器4的控制信号，再转发给恒流泵1和第三夹管阀37，从而控制这些装置的启动与停止。
52.实施例3
53.一种基于实施例1所述的类器官成型装置的工作方法，其中，包括如下步骤：
54.s1.控制器4控制第一夹管阀33和第二夹管阀34打开，控制器4控制泵1反向旋转将含细胞或者微组织的细胞悬液通过喷头软管31吸进螺旋管2内待用；
55.s2.控制器4控制第一夹管阀33保持打开，第二夹管阀34关闭，泵1正向旋转一个节拍将细胞悬液从螺旋管2挤出充满喷头软管31空间；
56.s3.控制器4控制第一夹管阀33关闭，第二夹管阀34打开，控制器4控制电磁阀36打开，通过气泵35将过滤后的高压气体经针头32释放，从而将喷头软管31内一定体积的细胞悬液推出，这些细胞悬液在空中飞行的过程会因为表面张力的原因收缩为球体形成细胞悬液微球，最终滴落粘附在培养面的设定位置；
57.s4.重复步骤s1、s2和s3，直到培养面上达到目标数量的细胞悬液微球；
58.s5.在培养面上加入含有类器官诱导剂的水凝胶，对培养面上的细胞悬液微球进行培养，形成类器官。
59.其中，含细胞悬液中细胞的浓度为0.1
‑
10*106个/ml，细胞种类为原代肿瘤细胞、或者是干细胞、成体细胞等种类；水凝胶为甲基丙烯酸化明胶(3％
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20％)，或明胶(2％
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20％)、胶原(0.1％
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20％)、纤维蛋白原(0.2％
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5％)、海藻酸钠(0.5％
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5％)等。这些水凝胶的加入既是为了初期维持细胞团簇的形状，更为细胞的粘附生长提供了一个良好的三维微环境。水凝胶中还含有类器官诱导剂，类器官诱导剂包含多种生长因子、或小分子物质，不同的类器官种类使用的诱导剂也是不一样。以小肠类器官的培养为例，需添加egf(表皮生长因子)，r
‑
spondin
‑
1、wnt
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3a和noggin等生长因子。
60.经过一周的培养与诱导即可形成大小均匀、状态稳定的类器官结构体，整体尺寸是统一均匀，排布规律，如图8所示。
61.本实施例中，所述步骤s3、s4和s5中，光学检测单元7实时检测细胞悬液微球的直径大小，然后反馈给数据采集卡5。在实际应用中，光学检测单元7首先实时检测挤出的细胞悬液微球大小是否统一。待检测通过后，在培养过程中也需要检测类器官聚集、形成与成熟，待其成熟稳定之后再次检测、测量其球体直径。然后再添加抗肿瘤药物，实时检测类器官直径的变化，若药物有效则其体积保持稳定或收缩变小。反之，肿瘤类器官直径持续发展变大，则说明药物是无效的。也可通过细胞活死染色、特异荧光染色等方法，对肿瘤的发生发展进行相关研究。
62.实施例4
63.一种基于实施例2所述的类器官成型装置的工作方法，其中，包括如下步骤：
64.s1.控制器4控制第三夹管阀37打开，控制器4控制泵1反向启动将含细胞或者微组织的细胞悬液通过针头32和喷头软管31吸进螺旋管2内待用；
65.s2.控制器4控制泵1正向启动以低速、稳定推动细胞悬液，同时高压直流源38打开，将针头32通电，然后第三夹管阀37以一定频率稳定开启、关闭；
66.s3.第三夹管阀37关闭液路的同时，将喷头软管31端部的细胞悬液挤出至针头32的端部，然后细胞悬液在高压静电的作用下突破表面张力飞出形成细胞悬液微球，最终滴落粘附在培养面的设定位置；
67.s4.重复步骤s1、s2和s3，直到培养面上达到目标数量的细胞悬液微球；
68.s5.在培养面上加入含有类器官诱导剂的水凝胶，对培养面上的细胞悬液微球进行培养，形成类器官。
69.其中，含细胞悬液中细胞的浓度为0.1
‑
10*106个/ml，细胞种类为原代肿瘤细胞、或者是干细胞、成体细胞等种类；水凝胶为甲基丙烯酸化明胶(3％
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20％)，或明胶(2％
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20％)、胶原(0.1％
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20％)、纤维蛋白原(0.2％
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5％)、海藻酸钠(0.5％
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5％)等。这些水凝胶的加入既是为了初期维持细胞团簇的形状，更为细胞的粘附生长提供了一个良好的三维微环境。水凝胶中还含有类器官诱导剂，类器官诱导剂包含多种生长因子、或小分子物质，不同的类器官种类使用的诱导剂也是不一样。以小肠类器官的培养为例，需添加egf(表皮生长因子)，r
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spondin
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1、wnt
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3a和noggin等生长因子。
70.经过一周的培养与诱导即可形成大小均匀、状态稳定的类器官结构体，整体尺寸是统一均匀，排布规律，如图8所示。
71.本实施例中，所述步骤s3、s4和s5中，光学检测单元7实时检测细胞悬液微球的直径大小，然后反馈给数据采集卡5。在实际应用中，光学检测单元7首先实时检测挤出的细胞悬液微球大小是否统一。待检测通过后，在培养过程中也需要检测类器官聚集、形成与成熟，待其成熟稳定之后再次检测、测量其球体直径。然后再添加抗肿瘤药物，实时检测类器官直径的变化，若药物有效则其体积保持稳定或收缩变小。反之，肿瘤类器官直径持续发展变大，则说明药物是无效的。也可通过细胞活死染色、特异荧光染色等方法，对肿瘤的发生发展进行相关研究。
72.显然，本实用新型的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本实用新型所作的举例，而并非是对本实用新型的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型权利要求的保护范围之内。