一种核糖体σ因子B及其突变体在提升利普司他汀产量中的应用的制作方法

一种核糖体
σ
因子b及其突变体在提升利普司他汀产量中的应用
1.本技术是申请日为2020
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10
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29，申请号为202011176931.9，专利名称为“一种核糖体σ因子及其突变体和编码得到的蛋白在提升利普司他汀产量中的应用”的分案申请。
技术领域
2.本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种核糖体σ因子及其突变体在提升利普司他汀产量中的应用。


背景技术：

3.利普司他汀的四氢衍生物
‑
奥利司他作为目前通过美国fda、欧盟ema和中国sfda认证的不抑制食欲，不作用于中枢神经系统的肥胖症治疗药物，全球超过4千万人服用并成功减重，是目前最畅销的减肥产品。作为长效的特异性胰脂肪酶抑制剂，能阻止甘油三酯水解为可被小肠粘膜吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油，从而减少热量摄入，控制体重。而利普司他汀最初是从链霉菌streptomyces toxytricini中分离得到，具有β
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丙内酯结构单元，其2，3位分别被6碳烷基烃链和13碳烷基烃链所取代，13碳烷基烃链c5位上的羟基则和n
‑
甲酸基
‑
l
‑
亮氨酸形成酯键。由于利普司他汀分子结构复杂，化学合成工艺复杂，需消耗大量的人力与物力。目前利普司他汀的生产主要采用半生物发酵工艺，相比化学方法减少了有毒溶媒的使用，大大减少了对环境造成污染，以及毒性物质残留。
4.目前，国内外对利普司他汀产生菌合成利普司他汀的研究主要采用单因素试验和正交设计实验相结合的方法，优化发酵培养基和发酵参数，如添加生物素和atp对脂类和利普司他汀合成的影响(董惠钧等，添加生物素和atp对毒三链霉菌脂类和利普司他汀合成的影响，中国医药工业杂志，2014，01期，第19
‑
24页)。
5.核糖体σ转录因子是rna聚合酶的重要组成部分，在原核生物的转录过程中发挥重要的作用。如在streptomyces avermitilis中过表达frr会增加阿维菌素的产量(li l et al,(2010)over expression of ribosome recycling factor causes increased production of avermectin in streptomyces avermitilis strains.j ind microbiol biotechnol 37(7):673
–
679)，但目前影响利普司他汀合成的核糖体σ转录因子未见报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种核糖体σ因子及其突变体和编码得到的蛋白在提升利普司他汀产量中的应用，本发明通过基因组测序及生物信息学分析对其核糖体因子进行比较分析，发现15个不同的核糖体因子，后通过评价，发现在streptomyces toxytricini中过表达核糖体σ转录因子a和b能提高利普司他汀的产量，并提供两个核糖体σ转录因子a和b的突变体，及其在利普司他汀生产中的应用。
7.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.一种核糖体σ因子在提升利普司他汀产量中的应用，该核糖体σ因子为核糖体σ因
子a或核糖体σ因子b。
9.进一步地，核糖体σ因子a的核苷酸序列如seq id no.5所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.6所示。
10.进一步地，核糖体σ因子b的核苷酸序列如seq id no.7所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.8所示。
11.一种如上述所述的核糖体σ因子a的突变体，该突变体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12.进一步地，核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示，与正常的核糖体σ因子a氨基酸序列相比，其第19位氨基酸替换为r，第327位氨基酸替换为g，第338位氨基酸替换为g，第344位氨基酸替换为f，第347位氨基酸替换为s，第538位氨基酸替换为t。
13.一种如上述所述的核糖体σ因子b的突变体，该突变体的核苷酸序列如seq id no.3所示。
14.进一步地，核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.4所示，与正常的核糖体σ因子b氨基酸序列相比，其第95位氨基酸替换为t，第274位氨基酸替换为s，第275位氨基酸替换为t，第351位氨基酸替换为v，第411位氨基酸替换为d。
15.上述核糖体σ因子a的突变体或其编码的蛋白质在提升利普司他汀产量中的应用。
16.上述的核糖体σ因子b的突变体或其编码的蛋白质在提升利普司他汀产量中的应用。
17.一种质粒，包括上述核糖体σ因子、核糖体σ因子a的突变体，或核糖体σ因子b的突变体。
18.一种转基因细胞系，包括上述核糖体σ因子、核糖体σ因子a的突变体，或核糖体σ因子b的突变体。
19.一种工程菌，包括上述核糖体σ因子、核糖体σ因子a的突变体，或核糖体σ因子b的突变体。
20.进一步地，通过将含有所述编码基因的表达载体导入链霉菌streptomyces toxytricini中进行过表达。
21.进一步地，该基因或突变基因位于质粒或染色体中。
22.本发明的有益效果为：
23.通过对10个核糖体因子的筛选研究，表明其中核糖体σ因子a和b及其突变体基因在链霉菌streptomyces toxytricini过表达，不仅对基因工程菌生物安全(在菌内过表达未对菌体的生长造成影响)，同时可以有效的提高链霉菌streptomyces toxytricini生产利普司他汀的能力。实验数据表明其中对于原始基因在streptomyces toxytricini过表达提高产利普司他汀的能力，尤其是它们的突变体基因过表达能更进一步提高产利普司他汀的能力。
附图说明
24.图1为质粒载体pkc1139
‑
lipra的图谱、
25.图2为质粒载体pkc1139
‑
liprb的图谱、
26.图3为质粒载体pkc1139
‑
lipra
‑
mut的图谱、
27.图4为质粒载体pkc1139
‑
liprb
‑
mut的图谱、
28.图5为利普司他汀浓度标准曲线。
具体实施方式
29.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
30.1、材料
31.streptomyces toxytricini作为典型的链霉菌，其基内菌丝分枝，气生菌丝稍粗，部分气生菌丝分化为螺旋形的孢子丝，具有典型的链霉菌属的特征。
32.培养基配方：
33.种子培养基：10g of soya bean flour、5g of bacto soytone、5ml of glycerol、10ml of soya oil、and 2ml of triton x
‑
100[ph 6.5]per liter。
[0034]
发酵培养：30g of soya bean flour、14ml of glycerol、1g of bacto soytone、1ml of triton x
‑
100、and 60ml of soya oil[ph 7.0]per liter。
[0035]
2、检测方法
[0036]
(1)样品预处理
[0037]
取发酵液1ml置于10ml离心管中，加入9ml的甲醇，置于漩涡混和器混匀，超声处理30min,离心(12000rpm，5min)后用0.22μm滤器过滤，取滤液(20μl)用于hplc分析。
[0038]
(2)标准品的制备
[0039]
配置利普司他汀标准品(0.125g/l,0.25g/l,0.5g/l,1g/l,2g/l)
[0040]
(3)hplc检测条件
[0041]
色谱柱：ymc
‑
pack ods
‑
a；检测波长：205nm；流动相：乙腈：水＝90:10；流速：1.0ml/min；柱温：40℃。
[0042]
(4)利普司他汀标准曲线的绘制
[0043]
将不同浓度的标准品按上述条件进行hplc检测，绘制峰面积利普司他汀浓度标准曲线。以测得的峰面积a为纵坐标，利普司他汀质量浓度c(g/l)记为横坐标，绘制利普司他汀标准曲线。见图5，得回归方程y＝5e 6x 101960，r2＝0.996，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据利普司他汀标准曲线计算样品产量
[0044]
实施例1菌株的获得
[0045]
将冻存的菌株稀释涂布于isp3平板培养基上，放置在30摄氏度水合培养箱中倒置培养，待菌落长出，挑出单菌落重新培养并传至2代。取一个长好的新鲜平板，用10ml无菌水洗下表面孢子，置于装有玻璃珠的三角瓶中，28摄氏度，200r/min振荡培养2～3h，过滤后系列稀释，制成孢子浓度约1
×
107个/ml的单孢子悬浮液待用。
[0046]
实施例2菌株基因组分析
[0047]
将菌株streptomyces toxytricini送华大基因公司进行全基因组测序，通过基因组测序及生物信息学分析对其核糖体因子进行比较分析，发现15个不同的核糖体因子，通过筛选发现，过表达核糖体σ转录因子a和b能提高利普司他汀的产量。
[0048]
基于筛选得到的核糖体σ转录因子a和b，通过核苷酸的取代，分别得到核糖体σ因子a的突变体基因和核糖体σ因子b的突变体基因，其核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.3所示；
[0049]
同时得到相应的氨基酸突变体，具体为：
[0050]
核糖体σ因子a的突变体：核糖体σ转录因子a编码的氨基酸序列的第19位氨基酸替换为r，第327位氨基酸替换为g，第338位氨基酸替换为g，第344位氨基酸替换为f，第347位氨基酸替换为s，第538位氨基酸替换为t。
[0051]
核糖体σ因子b的突变体：核糖体σ转录因子b编码的氨基酸序列的第95位氨基酸替换为t，第274位氨基酸替换为s，第275位氨基酸替换为t，第351位氨基酸替换为v，第411位氨基酸替换为d。
[0052]
再分别验证经取代后的突变体在菌株中过表达对利普司他汀产量的影响。
[0053]
实施例3质粒的构建
[0054]
1、pkc1139
‑
lipra的构建
[0055]
分别利用表1的引物对lipra
‑
xbai
‑
f和lipra
‑
ecorv
‑
r，以streptomyces toxytricini基因组为模板，通过pcr扩增，引入xbai和ecorv酶切位点，得到lipra片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的lipra片段。lipra基因序列如seq id no.5所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.6所示。
[0056]
将上述纯化的lipra片段和pkc1139质粒分别用xbai和ecorv进行双酶切，将lipra片段的双酶切产物与pkc1139质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l阿泊拉霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pkc1139
‑
lipra。用质粒试剂盒提取质粒pkc1139
‑
lipra备用，质粒图谱如图1所示。
[0057]
2、pkc1139
‑
lipra
‑
mut:
[0058]
以核苷酸序列如seq id no：1所示的基因为模板，获得lipra
‑
mut片段，按照pkc1139
‑
lipra的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pkc1139
‑
lipra
‑
mut。质粒图谱如图3所示。
[0059]
3、pkc1139
‑
liprb的构建：
[0060]
分别利用表1的引物对liprb
‑
xbai
‑
f和liprb
‑
ecorv
‑
r，以streptomyces toxytricini基因组为模板，通过pcr扩增，引入xbai和ecorv酶切位点，得到liprb片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的liprb片段。liprb基因序列如seq id no.7所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.8所示。
[0061]
将上述纯化的liprb片段和pkc1139质粒分别用xbai和ecorv进行双酶切，将liprb片段的双酶切产物与pkc1139质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l阿泊拉霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pkc1139
‑
liprb。用质粒试剂盒提取质粒pkc1139
‑
liprb备用，质粒图谱如图2所示。
[0062]
4、pkc1139
‑
liprb
‑
mut:
[0063]
以核苷酸序列如seq id no：3所示的基因为模板，获得liprb
‑
mut片段，按照pkc1139
‑
liprb的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pkc1139
‑
liprb
‑
mut。质粒图
谱如图4所示。
[0064]
表1引物
[0065][0066]
实施例4含质粒载体菌株的构建
[0067]
1、含外源质粒大肠杆菌et12567/puz8002的准备
[0068]
将构建好的质粒转化大肠杆菌et12567/puz8002，得到含有重组质粒的供体菌。供体菌接种于5ml的lb培养基中(含25μg/ml km、cm和50μg/ml am)，37℃培养过夜，按1:50～100转种至10ml lb培养基中(含25μg/ml km、cm和50μg/ml am)，37℃培养至od
600
＝0.3～0.4，培养大约3h，离心收集菌体，以无药lb洗涤两次，悬浮于1ml无药的lb培养基。获得含相应质粒的et12567/puz8002。
[0069]
2、异源表达菌株孢子的处理
[0070]
streptomyces toxytricini培养大约7d左右，取2个平板用5ml 10％甘油洗下孢子，放入50ml的试管中，振荡混匀后脱脂棉过滤在干净的试管中，3500rpm离心10min，加入1ml的2
×
yt，50℃热激活10min。
[0071]
3、大肠杆菌et12567/puz8002与streptomyces toxytricini菌株接合转移及菌株的分离鉴定
[0072]
分别0.5ml取等量链霉菌孢子液和大肠杆菌菌液混匀涂布含10mm mgcl2的接合转移培养基(iwl4或ms和r2ye)，28℃，培养过夜，用含am(50μg/ml)和tri(100μg/ml)的无菌水覆盖，28℃培养7～10d，长出的阳性菌落挑在含有am(50μg/ml)和tri(100μg/ml)的iwl4或ms和r2ye培养基中进行传代培养后，挑取相应菌落。sk/pkc1139(对照菌)、sk/pkc1139
‑
lipra(简写为sk1)、sk/pkc1139
‑
lipra
‑
mut(简写为sk2)、sk/pkc1139
‑
liprb(简写为sk3)、sk/pkc1139
‑
liprb
‑
mut(简写为sk4)。
[0073]
实施例5不同菌株评价
[0074]
将对照菌与sk1、sk2、sk3、sk4进行摇瓶发酵，每个进行3次平行，然后进行利普司他汀的测定和比价，结果如表2所示。根据表2的检测结果可知，发现实验组菌相比对照菌生产利普司他汀的能力都有所提高，从而说明了核糖体σ因子a和b及其突变体基因过表达能够提升利普司他汀的产量。
[0075]
表2不同菌株的利普司他汀产量
[0076]
菌株利普司他汀产量(g/l)对照菌1.12
±
0.11sk11.43
±
0.17sk21.67
±
0.15sk31.27
±
0.14sk41.56
±
0.12